PLoS ONE: stromacellers Afledte fra Visceral og fede fedtvæv fremme væksten af ​​æggestokkene Cancers

Abstrakt

Fedme, især visceral fedme, er blevet forbundet med en øget risiko for at udvikle kræft samt højere rater af dødelighed efter diagnosen. Virkningen af ​​fedme på adipøst afledte stromaceller (ASC), som bidrager til dannelsen af ​​tumor stroma, er ukendt. Her hypotese vi, at visceral kilde og kost-induceret fedme (DIO) ændrer ASC fænotype, der bidrager til tumoren effekter af fedme. Vi fandt, at ASC isoleret fra subkutan (SC-ASC) og visceralt (V-ASC) hvidt fedtvæv (WAT) magert (Le) og fede (Ob) mus udviste lignende mesenkymale celleoverflademarkører ekspression, og havde tilsvarende virkninger på æggestokkene kræft celledeling og migration. Fede og visceral afledt ASC spredt langsommere og udstillet forringet differentiering i adipocytter og osteocytter

in vitro

sammenlignet med ASC stammer fra subkutan WAT af lean mus. Intraperitoneal co-injektion af kræft i æggestokkene celler med overvægtige eller visceral afledt ASC, men ikke mager SC-ASC, øget vækst af intraperitoneale ID8 tumorer i forhold til kontroller. Obese og V-ASC øget stromale infiltration af inflammatoriske celler, herunder CD3 + T-celler og F4 /80 + makrofager. Obese og visceralt afledt ASC, men ikke mager SC-ASC, forøget ekspression af kemotaktiske faktorer IL-6, MIP-2, og MCP-1, når de dyrkes med tumorceller. Samlet viser disse resultater, at fede og V-ASC har en unik fænotype, med mere begrænset proliferation og differentiering kapacitet, men forøget ekspression af kemotaktiske faktorer som reaktion på maligne celler, som understøtter infiltration af inflammatoriske celler og støtte tumorvækst og formidling.

Henvisning: Zhang Y, Nowicka A, Solley TN, Wei C, Parikh A, Court L, et al. (2015) stromacellers Afledte fra Visceral og fede fedtvæv fremme væksten af ​​ovariecancer. PLoS ONE 10 (8): e0136361. doi: 10,1371 /journal.pone.0136361

Redaktør: Sandra Orsulic, Cedars-Sinai Medical Center, UNITED STATES

Modtaget: 19 Maj 2015; Accepteret: 31 Juli 2015; Udgivet: 28 August, 2015

Copyright: © 2015 Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra æggestokkene Cancer Research fund (LT /MDACC /01.2011) og American Cancer Society (RSG-14-159-01 ) til AHK. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Fedme øger risikoen og /eller dødelighed af mange kræftformer, herunder endometrie, kolon, pancreas, og ovariecancer [1-5]. Overskydende visceralt hvidt fedtvæv (WAT) er blevet vist at være særegenhed giftige, stigende risiko og dødeligheden uafhængig af body mass index (BMI) i mange cancere, herunder ovariecancer [5]. En række mekanismer er blevet identificeret til at redegøre for forholdet mellem fedme og cancer, såsom sekretion af adipokiner, insulinresistens, og aromatisering af steroidhormoner at øge cirkulerende østrogen [6-8]. Fedtvæv indeholder også en population af tumor-tropiske adipose stamceller (ASC), der understøtter dannelsen af ​​tumorvaskulatur [9] [10]. For nylig rapporterede vi, at human omentum afledt ASC fremme væksten og vaskularisering for endometriecancer xenotransplantater sammenlignet med subkutant afledt ASC [11]. Dog kan forskelle i isolation tilgang eller individuel variation have påvirket ASC fænotype. Desuden har studier i xenograftmodeller kun gentages virkningerne af inflammatoriske celler i tumormikromiljøet, der bedre modelleret i en syngen model. Omentum, en del af visceralt fedt, er den hyppigst involveret site af ovariecancer metastase. Oment metastase er en særlig kritisk problem i kræft i æggestokkene, som har den højeste gentagelse sats og laveste overlevelse blandt gynækologiske kræftformer. Mekanismen bag dette er ikke kendt. Desuden er syngene modeller af intraperitoneal spredning veletableret i ovariecancer men ikke endometriecancer. Derfor, for at forstå betydningen af ​​ASC fra forskellige anatomisk placeringer: subkutant og visceralt adipose-væv, i ovariecancer, undersøgte vi virkningen af ​​kost-induceret fedme (DIO) på disse forskellige ASC’er og deres rolle i tumorvækst i maveregionen ved under anvendelse af en syngen intraabdominal murin model af ovariecancer.

In vitro

in vivo

analyser blev anvendt til at analysere ASC isoleret fra subkutan (SC-ASC) og visceral (V-ASC) WAT af lean (Le) og fede (Ob) mus at karakterisere effekten af ​​fedme og fedtvæv depot og ASC fænotype.

Materialer og metoder

Cell kultur

ASC blev dyrket i α-minimum essential medium (α-MEM) indeholdende 20% FBS, L-glutamin og penicillin streptomycin. ID8 og IG10 celler blev generøst tilvejebragt af Katherine Roby [12]. ID8 og IG10 celler blev stabilt transficeret med ildflueluciferase og tomat-røde gener med brug af en lentiviral metode [13] (pFULT vektor blev venligst stillet til rådighed af Dr.Jennifer Prescher). Dyrkede celler blev rutinemæssigt testet for levedygtighed med trypan blå eksklusion og opretholdt høj levedygtighed ( 95%). For

in vivo

eksperimenter minut brøkdel af døde celler blev overvejende fjernes ved vask før trypsinisering.

Isolering af SC-ASC og V-ASC

ASC blev isoleret fra subkutan WAT og visceralt WAT af C57BL /6 hunmus fodret med fedtfattig diæt (LFD) eller kost med højt fedtindhold (HFD) i 15 uger. HFD og LFD blev indkøbt fra Research Diet INC. Subkutan WAT blev taget fra den bageste torso, og visceralt WAT blev taget fra retroperitoneal og gonadale depoter. WAT blev underkastet mekanisk sprængning, efterfulgt af 0,5 mg /ml collagenase type I (Worthington Biochemical) og 50 U /ml dispase (Becton Dickinson) fordøjelse ifølge offentliggjorte protokoller [11]. Spaltet WAT blev centrifugeret ved 1.000 rpm i 5 minutter. Supernatanten indeholdende adipocyter blev fjernet. Den resulterende cellepellet blev resuspenderet i α-MEM indeholdende 20% FBS og filtreret gennem 100 um cellefilter (Becton Dickinson) og derefter gennem 40 um celle sier.

Karakterisering af SC-ASC og V-ASC

All ASC blev ekspanderet

in vitro

og tidligt passerede dem blev anvendt til at karakterisere med anvendelse af flowcytometri til ekspression af de følgende celleoverflademarkører: CD34, CD31, CD45, CD29, CD11b, CD73 , CD90, og CD105 (Becton Dickinson). Celledifferentieringsfaktorer undersøgelser blev udført som tidligere [14] beskrevne. For adipocytdifferentiering, sammenflydende celler i 6-brønd eller plade med 24 brønde blev dyrket i adipogenisk induktionsmedium, Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM; Mediatech) suppleret med 10% FBS, 1% penicillin /streptomycin, 10 ug /ml insulin, 500 pM 3-isobutyl-1-methylxanthin (Sigma-Aldrich), 1 pM dexamethason (Sigma-Aldrich), og 200 uM indomethacin (Sigma-Aldrich). Efter celler blev holdt i induktionsmedium i 72 timer blev mediet ændret til adipogenisk vedligeholdelsesmedium, Dulbeccos modificerede Eagles Medium suppleret med 10% FBS, 1% penicillin /streptomycin og 10 ug /ml insulin i 24 timer. Denne procedure på 72 timer induktion og 24 timer vedligeholdelse blev gentaget to gange. Efter den tredje induktion celler blev anbragt i vedligeholdelsesmedium for i alt 10 dages inkubation. Vedligeholdelse medium blev skiftet to gange om ugen. Celler blev derefter fikseret i 10% formalin i 10 minutter efterfulgt af 60% isopropanol. Oil Red O (Sigma-Aldrich) farvning blev anvendt til at visualisere røde lipidvakuoler. For osteoblast differentiering, konfluerende celler i 6-brønds plader blev dyrket i NH OsteoDiff Medium (Miltenyi) i 3 uger, med mediet skiftet to gange om ugen. Efter 3 uger blev cellerne vasket 3 gange med PBS og fikseret med forafkølet 100% methanol. Celler blev farvet med alizarinrødt S. Fem repræsentative billeder fra hver brønd (tre brønde for hver ASC) blev taget af Leica DMI6000B mikroskop og analyseret af Inform software: regioner i rød Alizarin eller Oil Red O farves blev defineret på 4-6 billeder, og om anerkendelse software blev anvendt på alle billeder. Den farvning i pixel blev kvantificeret for hvert billede, og procentdelen af ​​farvning blev beregnet og gennemsnittet fra alle billeder for en endelig procentsats.

qPCR assay

mRNA fra Ob /Le afledt SC- ASC eller V-ASC på forskellige dage under adipogenese induktion blev isoleret under anvendelse af TRIzol og omdannes til cDNA under anvendelse af SuperScript III revers transkriptase (Invitrogen). Kvantitativ RT-PCR-analyse blev udført på grundlag af TaqMan-primere /Universal PCR Master Mix (Invitrogen) platform ved hjælp ABI 7900 arbejdsstation og SDS 2.4 software (Applied Biosystems, Grand Island, NY, USA) og 2 ^ -delta Ct-værdi blev anvendt til analyse [15]

Proliferationsassay

Luciferase-mærket ID8 og IG10 celler blev udpladet med en tæthed på 500 celler per brønd alene i en BD Falcon 96-brønds plade eller i 1:. 1 cokultur med tidlig passage ASC. Efter 24 timer blev luciferase-ekspression målt i 0,15 mg /ml D-luciferin. Efter 1 times inkubation ved 37 ° C blev luminescensen målt med et spektrofotometer (Fluostar Omega, BMG Labtech). Mediet blev derefter erstattet, og målingerne blev gentaget hver anden dag, indtil cellerne nåede sammenløb.

Migration assay

Konditioneret medium (CM) fra tidlig passerede subkutan eller visceral ASC af overvægtige eller magert WAT blev opsamlet fra en 6-brønds plade, der var belagt med 300.000 celler per brønd med serum-frit medium i 48 timer. ID8 og IG10 migration blev analyseret i ASC CM i en 24-brønd transwell (Corning Inc.) med 8-um porer. CM blev anbragt i den nedre del af Transwell og ID8 på den øverste del af Transwell. Hver CM blev analyseret tre gange. Antallet af celler, der var migreret til bunden af ​​transwell blev målt efter 8 timer ved farvning membraner med en Hema 3 Stat Pack (Thermo Fisher Scientific) og derefter mekanisk fjernelse af resterende celler på den øvre membran. Celler fastgjort til bunden af ​​membranen blev dissocieret fra membranen under anvendelse af 2% deoxycholicacid. Den optiske tæthed af den resulterende suspension blev påvist ved et enzymbundet immunosorbentassay (ELISA) pladeaflæser (BioTek Instruments) ved 590 nm i en 96-brønds plade [16].

Sfæroide formation assay

i alt 40.000 tidlig passeret ASC eller ovariecancerceller blev udpladet i 2 ml sfæroide assaymedium (MEM med 0,1 mg /ml gentamycin, 1% penicillin /streptomycin, 10 ml B27, 10 ug FGF, og 10 ug af EGF fra Gibco) i lav vedhæftede plader til 5 dage og opsamles som spheriod-medium (sfæroid-CM). Sfæroide kulturer blev initieret ved podning 100 cancer eller ASC celler i 100 ul medium bestående af 50% ASC eller cancercelle sfæroide-CM og 50% regelmæssig kugleformet assaymediet i 96-brønds plader. Fjorten dage senere blev 7,5 pi MTT (Methylthiazolyldiphenyl-tetrazoliumbromid) til hver brønd. Sfærer blev talt manuelt med diameter på mindst 50um at udelukke enkelte celler eller debris. Hver prøve blev gentaget i 8 brønde.

Luminex assays

sfæroide CM beskrevet ovenfor blev analyseret for angiogenese /vækst eller cytokin /chemokin faktor panel herunder IL-6, SDF-1, MCP 1, TNF-a, IL-10, MIP-1a, 1b, MIP-2, og VEGF med Luminex 100 ved anvendelse af en Milliplex MAP Kit (EMD Millipore Corp, Billerica, MA, USA). Data blev behandlet af Bioplex Manager software.

In vivo

undersøgelser

Dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med MD Anderson Institutional Animal Care og brug Udvalg-godkendt protokol (120.914.932). Alle mus blev opstaldet, og behandles i overensstemmelse med institutionelle standarder. Musestammer, C57BL /6 var fra Jackson Lab. For DIO induktion [17], HFD D12492 (60 kcal% fedt) og LFD D12450B (10 kcal% fedt) fra Research kostvaner blev brugt. Alle musene i vore forsøg fik 2-4% isofluran til bedøvelse og dybden af ​​bedøvelse blev overvåget ved respirationsfrekvens og fravær af tilbagetrækning refleks til trædepude knivspids. At evaluere effekten af ​​fedme på kræft i alt 10

6 luciferase-udtrykkende ID8 i 200 pi PBS blev injiceret intraperitonealt (IP) i HFD eller LFD mus, og tumorer blev dyrket i 10 uger fedme for tumorvækst. For at undersøge yderligere forskellige påvirker af visceral afledt ASC og subkutan afledt ASC på kræft, blev seks uger gamle magre mus bedøves som før og injiceres intraperitonealt med 1 × 10

6 luciferase-udtrykkende ID8 celler og 1 x 10

6 tidlige passager af SC-ASC eller V-ASC fra fede eller magre mus ind i maven (5 mus per gruppe). Luciferase signaler blev målt for at bestemme tumorstørrelse ved IVIS Imaging 200 serien (Xenogen Corporation) to gange om ugen efter 4 dage, og billeder blev analyseret under anvendelse Living Billede software (Caliper LifeSciences). På omkring dag 50 blev musene aflivet ved inhalation overdosis af isofluran blev ascites opsamlet, og tumorknuder nær maven blev udvundet fra aflivede mus. Ascites blev centrifugeret, og lyse af røde blodlegemer (eBioscience) blev anvendt til at fjerne røde blodlegemer i cellepellets; dette blev efterfulgt af 10 ml af en-MEM med 20% FBS til neutraliseringen. Celler fra ascites blev opbevaret ved -80 ° C og blev senere analyseret ved flowcytometri for celle præparat. Immunofluorescens på formalinfikserede, paraffinindlejrede vævssnit blev udført efter antigen-genvinding, vask med 0,2% Triton X-100, og blokering i serumfrit Protein Block (DAKO); dette blev efterfulgt af inkubation med primære antistoffer (4 ° C, 12 timer) og sekundære antistoffer (stuetemperatur, 1 time) i PBS indeholdende 0,05% Tween-20. De primære anvendte antistoffer var som følger: kanin anti-Ki-67 (Thermo Scientific, 1: 200), biotinyleret GSL I-isolectin B

4 for tumorkar farvning (Vector, 01:50), rotte-anti-F4 /80 (Abcam, 1: 100), rotte-anti-CD3 (Abcam, 1: 100), og kanin-anti-perilipin (Cell Signaling Technology, 1: 100). Sekundær æsel Alexa 488-konjugeret (1: 150) IgG var fra Invitrogen, Cy3-konjugeret (1: 300) IgG var fra Jackson ImmunoResearch, og streptavidin-Cy3 (1:20) var fra Invitrogen. Kerner blev farvet med Hoechst 33258 (Invitrogen).

MicroCT Scan på mus SC-WAT og V-WAT

For at bestemme mængden af ​​viscerale og subkutane fedtvæv, vi brugte MATLAB (Mathworks, Natick, MA) for at skabe et internt program. MicroCT scanninger blev erhvervet ved brug (scanner) og taget ved (kVp, mA, FOV, skive tykkelse). CT-billeder for hver mus blev importeret som en serie af DICOM-billeder. Regionen af ​​interesse (ROI) for fedt volumen bestemmelse var begrænset til maven. Følgelig blev de øvre og nedre grænser af ROI defineret fra bunden af ​​membranen til den superiore side af de femurhoveder. Dernæst vi manuelt trak elliptiske konturer inde i abdominale muskulatur strækker posteriort til hvirvellegemet så visceralt fedtvæv var indeholdt inden for ellipsen og subkutane fedtvæv var uden for ellipsen. De ellipser blev trukket på toppen, øvre kvartil, midten, lavere kvartil, og nederste skiver af ROI. Under denne proces bestemte vi den optimale placering og størrelse af ellipsen for at adskille visceralt fedtvæv og subkutant fedtvæv så meget som muligt. Programmet derefter lineært interpoleret disse konturer for resten af ​​skiverne, effektivt adskille ROI i 2 regioner. Et område afgrænset af ellipsen indeholdt bughulen, som omfattede visceralt fedtvæv og organer. Området uden for ellipsen indeholdt subkutane fedtvæv.

Endelig programmet beregnede fedtvæv volumen ved automatisk at tælle antallet af voxels, der svarer til fedtvæv, og multiplikation med rumfanget af hver voxel. Subkutan fedt bestod af væv mellem – 50 og 150 Houncefield enhed (HU) og visceralt fedt bestod af væv mellem -50 og 200 HU. Intervallerne blev udvalgt på grundlag af visuel analyse af HU fordeling af fedtvæv.

Billede erhvervelse og dataanalyse

Billeder blev erhvervet af Vectra Automated Multispektral Imaging System (Perkin Elmer) og analyseret af Inform software: regioner af interesse blev defineret 4-6 billeder, og softwaren anerkendelse blev brugt til at klassificere alle billeder. Fluorescens af interesse i pixel blev kvantificeret for de forskellige tumor kategorier af hvert billede, og procentdelen af ​​fluorescens fra måltumor kategori blev beregnet, og gennemsnittet fra alle billeder af en tumor for en endelig procentdel. Mindst 10 billeder pr dias blev kvantificeret. Tre tumorer blev analyseret fra hver af ID8 forsøgsgrupper. Statistisk analyse blev udført med Mann-Whitney-test, to-halet.

Flowcytometri

ASC eller celler fra tumor eller ascites blev resuspenderet i PBS suppleret med 2% FBS (10

6 celler /100 pl /farvning reaktion). 1 pg af hvert antistof blev tilsat til cellesuspensionen og inkuberet ved 4 ° C i 30 minutter. Mærkede cellepopulationer blev derefter analyseret ved Gallios flowcytometer (Beckman Coulter) LSRII (BD Bioscience) med Kaluza eller FLowJo software. erhvervelse Prøve blev ledsaget med brug af kontrol uplettet, single-farve farves, og isotypekontroller at bestemme den passende spændinger, kompensationer, og placering af porte for dataopsamling. Ascites celler blev præ-gated at udelukke snavs, celleklumper, kontaminerende polymorfonukleære celler, røde blodlegemer og døde celler baseret på DAPI-farvning. Cell kompositioner blev analyseret på grundlag af Texas Red (Texas Red kanal) og de følgende IgG-kloner: APC-anti-CD34 (RAM34), PE-Cy7-anti-CD31 (MEC 13.3), APC-Cy7-CD45 (30-F11) eller Texas Red, PE-Cy7-anti-CD11, og APC-F4 /80, og de tilsvarende isotypekontroller (BD Biosciences). Isotyper og holdninger tidligere karakteriseret hæmatopoietisk og endotel befolkninger på plots [18,19] blev brugt til at indstille gate cutoffs.

statistiske analyser

Til analyse af

in vivo

data, tumorstørrelse målt som luminescens intensitet blev forvandlet af basen 10 logaritmer at tilnærme normalitet til lineær model. En lineær mixed effekt model med gentagne målinger blev anvendt til at vurdere forskellene mellem grupper (Le-V-ASC, Le-SC-ASC, Ob-V-ASC, Ob-SC-ASC, og ID8 kun) på tværs af flere tidspunkter. Vores endelige model omfattede den faste effekt af gruppe (5 grupper), og dag (samspillet mellem gruppen og dag var ikke signifikant), tilfældig effekt af mus indlejret i gruppe, og gentagne målinger med den første-ordens auto regressive kovarians struktur. Vi undersøgte normalitet af resterne af normal fraktil-fraktil plot (Q-Q plot) [20]. Analysen af ​​

in vitro

data blev udført under anvendelse SAS 9,3 (Gary, NC). In vitro resultater blev rapporteret som betyder +/- standardfejl på middelværdien.

P Salg værdier blev opnået ved anvendelse af to-halet Mann-Whitney-test. Den log-rank test blev brugt til at sammenligne tid til påvisning af sygdom ved hjælp af luciferase billeddannelse.

Resultater

Fedme øger væksten af ​​ID8 ovariecancer

For at afgøre, om fedme har en direkte effekt på væksten af ​​murine ovariecancer, vi brugte en syngen musemodel af kræft i æggestokkene i C57BI /6 mus, der er tilbøjelige til DIO. C57BL /6-hunmus blev fodret med en kost med højt fedtindhold (60% af kcal fra fedt) eller en fedtfattig diæt (20% af kcal fra fedt). Efter 4 måneder, mus fodret med en kost med højt fedtindhold havde næsten dobbelt legemsvægten af ​​mus fodret med fedtfattig diæt (gennemsnitlig legemsvægt, 37,6 g vs. 22,6 g) (Fig 1A). For at bestemme om mus med DIO havde øget visceral WAT samt subkutan WAT blev volumenet af visceralt WAT målt med microCT scanninger. Mus med DIO indeholdt mere end en 16,7 gange højere volumen af ​​visceralt fedt og 6,5 gange højere volumen af ​​subkutant fedt end lean mus (Fig 1B). Mus blev derefter isografted med 1 x 10

6 ildflueluciferase-udtrykkende ID8 ovariecancer celler intraperitonealt. Ved 11 dage, luciferaseaktivitet var signifikant højere i mus med DIO end i mager mus (Fig 1C og 1D), hvilket viser, at kost-induceret fedme accelererer ID8 ovarietumorer.

A, C57BL /6-mus blev fodret med en HFD eller LFD i 4 måneder. N = 10 pr gruppe. Mus, som blev fodret med en HFD havde højere kropsvægt end mus, der blev fodret med en LFD (gennemsnitlig legemsvægt, 37,6 g vs. 22,6 g). B, CT-scanninger af HFD eller LFD mus (HFD: betyde visceral WAT: 7,2 cm

3 og betyde SC WAT 6,6 cm

3; LFD: betyde visceral WAT: 0,4 cm

3 og betyde SC WAT 1.0 cm

3) og HU distribution af visceralt og subkutant fedt fra HFD eller LFD mus. Gule stjerner angiver visceralt fedt, og rød stjerne angiver subkutant fedt. Røde lodrette linjer angiver de øvre og nedre dale, der definerer HU interval svarende til fedtvæv. Fejllinjer, SEM. ***,

P

0.001 (Student

t

test). C, repræsentant HFD og LFD mus med luciferase signaler fra tumorer. Mus blev i.p. isografted med 1 x 10

6 luciferase-udtrykkende ID8 tumorceller. Tumorer blev målt ved luciferase signaler detektion inden abdominal side af mus. D, kost-induceret fedme accelereret ID8 ovarietumorer. Tumorvækst i HFD og LFD mus i 11 dage.

Isolering og karakterisering af ASC fra subkutan og visceralt fedt fra magert og fede mus

For at afgøre, om fedme effekter blev medieret af ASC vi isoleret og karakteriseret SC-ASC og V-ASC af tumor-fri mus fodret en HFD eller LFD, som beskrevet ovenfor. ASC blev isoleret ifølge tidligere offentliggjorte protokoller [11]. Morfologisk, SC-ASC og V-ASC fra fede eller magre mus udviste en lignende mesenchymale fænotype (Fig 2A). Celleoverflademarkør ekspression blev karakteriseret i tre eksemplarer med flowcytometri efter celler blev passeret 3 gange (S1 Fig og S1 Table). Alle ASC var negative for endothelial markør CD31, monocyt markør CD11, og en hæmatopoietisk linje markør CD45. Mesenchymal markering, CD29 blev udtrykt på alle 4 ASC linjer, mens mesenchymale CD90 og 105 var til stede på de fleste SC-ASC og Le-V-ASC men mindre hyppige i Ob-V-ASC. Disse resultater viser, at der ikke var bevis for kontaminering med ikke-mesenchymal-afstamningsceller fra fedtvæv og at SC og Le-V-ASC havde lignende celleoverflademarkør ekspression. Ob-V-ASC blev bemærket at have mindre ekspression af CD90 og 105, som er karakteristiske for MSC. Dernæst at bestemme, om SC-ASC og V-ASC fra fede eller magre mus opretholde den samme vækstrate blev celleproliferationsassays udført. Lean SC-ASC (Le-SC-ASC) spredt hurtigere end ASC fra andre kilder (

P

0,05, S2 Fig).

A, morfologi vedhæftende celler viser lighed SC-ASC og V-ASC fra fede og magre mus. Scale bar, 1 um. B, adipogenese af SC-ASC og V-ASC. Differentierede celler blev farvet med olie rød-O og kvantificeres ved procentdelen af ​​pixels af olie rød-O i billeder. Fejllinjer, SEM. **,

P

0.01 (Mann-Whitney-test). Scale bar, 100μm.C, Osteogenesis fra SC-ASC og V-ASC. Differentierede celler blev farvet med alizarinrødt S. Fejlsøjler, SEM. **,

P

0.01 (Mann-Whitney-test). Scale bar, 100 um. D, Kvantitativ RT-PCR-analyse af mRNA-niveauer for gener stemplingen adipocyt differentiering og lypolysis normaliseret til 18s RNA udtryk i angivet ASC ved baseline og 14 dage efter adipogenese induktion. Fejl bar:. SEM

In vitro

ASC differentiering

For at bestemme, om SC-ASC og V-ASC fra fede eller magre mus udviser multipotency

in vitro

blev adipocyt og osteocyt afstamningsceller differentieringsfaktorer assays udført som tidligere beskrevet (fig 2B og 2C) [11]. Adipocyt kvantificering var baseret på Oil Red O-farvning af lipid dråbe efter adipogenese induktion. SC-ASC dannet flere Oil Red O-positive lipiddråber end V-ASC. (Fig 2B,

P

0,01). Osteogenese blev påvist med anvendelse af alizarinrødt farvning til påvisning alkalisk phosphatase, indikerer osteoblastisk differentiering (fig 2C). Osteogenesis var også mere robust for SC-ASC end for V-ASC (

P

0,01) med en tendens til fedme forringe osteogent differentiering potentiale. Kombineret, disse resultater tyder på, at SC-ASC har højere multipotency end V-ASC, og at fede WAT-afledte ASC har mere begrænset differentiering potentiale end lean WAT-afledte ASC.

For at afgøre, om væv kilde og fedme påvirket adipogenisk programmering, udtryk for adipocyt (adipsin, leptin, GLUT4), lipolyse (ATGL) og nøgle adipogenese regulerer transskription faktor (PPAR-γ) blev profileret i ASC ved baseline og efter 14 dage adipocyt induktion (figur 2D). Vi fandt, at Le-SC-ASC undergik 30-gange induktion af den kritiske adipogensis-regulerende gen, PPAR-γ efter adipocyt induktion, i modsætning ASC fra andre kilder. Niveauet af PPAR γ var stadig høj efter differentiering i Ob-V-ASC gruppe, men indeholdt nogle Oil-Rød-O-farvning (Fig 2C). Dette kan skyldes øget lipolyse, hvilket afspejles i højere niveauer af ATGL ekspression i Ob-V-ASC. Adipocyt gener herunder adipsin, leptin og GLUT4 blev udtrykt på langt højere niveauer i Le-SC-ASC, i overensstemmelse med vores observation, at SC-ASC differentierede mest håndfast ind adipocytter. Lipolyse regulerer gen ATGL var højest i fede visceral afledt ASC.

In vitro

analyse af ASC og ovariecancer co-kulturer

For at afgøre, om ASC har en direkte mitogen effekt på maligne celler, vi analyserede spredning af ID8 og IG10 C57 afledt æggestokkræft cellelinjer

ex vivo

. Luciferase-mærket ID8 og IG10-celler blev co-dyrket med eller uden ASC. Tumorcelleproliferation blev overvåget med anvendelse af luciferase billeddannelse. ASC fra alle kilder havde en beskeden pro-proliferativ effekt på ID8 og IG10 celler (S3A og S3B Fig). For at afgøre om ASC påvirke invasive potentiale ovariecancerceller blev en

ex vivo

migration gennem Boyden Chamber Transwell assay udføres. ASC fra alle kilder, sammenlignet med ovarie celler alene, øget migration af æggestokkene celler (

P

0,01). (S3C og S3D Fig)

Maligne ovariecancerceller aggregat og formen sfæroid -lignende strukturer i ascitesvæske, der kan lette oment metastase [21]. Vi har tidligere rapporteret, at knoglemarv afledt MSC forøge dannelsen af ​​brystkræft sfæroider [22]. Når ASC blev dyrket som sfæroider ved 100 celler udpladet pr brønd uden tumorceller, Ob-V-ASC dannet signifikant flere kugler, der ASC fra alle andre kilder (Fig 3A). For at bestemme virkningen af ​​ASC på ovariecancer kugleformet dannelse, blev ID8 og IG10-celler dyrket som sfæroider med eller uden ASC sfæroid-CM. ID8 celler dannet betydeligt flere spheroids i alle ASC-sfærisk-CM end ID8 celler alene (Fig 3C,

P

0,05). IG10 celler dannet signifikant flere sfæroider når dyrket med Ob-V-ASC sfæroide-CM (fig 3B og 3D). Sammenfattende fedme og vævskilde synes at påvirke ASC kugleformet dannelse, og til støtte for IG10 ovariecancer celleafledte sfæroider. Salg

Celler blev udpladet ved en densitet på 100 celler i alt 100 ul i 96-brønds plader og dyrket i 14 dage. Celler blev derefter farvet med MTT, og sfæroider blev talt manuelt. Hvert eksperiment blev udført tre gange. A, Kvantificering af ASC klumpformet i regelmæssig medium. B, Sammenligning af IG10 klumpformet dannelse i forskellige ASC klumpformet-CM. Repræsentative billeder vist på 10x forstørrelse. Scale bar, 100 um. C, Kvantificering af ID8 klumpformet assay i forskellige ASC sfæroide-CM. (Vist er gennemsnit ± SEM, ***,

P

0,001, Student

t

test, tosidet.). D, Kvantificering af IG10 klumpformet assay i forskellige ASC klumpformet-CM. (Vist er gennemsnit ± SEM, *,

P

0,05, **,

P

0,01, ***,

P

0,001, Student

t

test, to halet).

Effekt af fede og magre WAT afledt ASC på

in vivo

væksten af ​​kræft i æggestokkene

til undersøge

in vivo

virkninger af vævskilde og fedme på ASC i ovariecancer, ASC blev co-injiceret med luciferase-udtrykkende ID8 tumorceller i lean C57BL /6-mus intraperitonealt (1: 1 ratio, 10

6 /hver). Tumorvækst blev overvåget med luciferase billeddannelse. blev påvist højere niveauer af luciferaseaktivitet i mus injiceret med Ob-SC-ASC, Le-V-ASC og Ob-V-ASV sammenlignet med mus injiceret med ID8 celler alene (tabel 1 og fig 4A-4D). Tumorvækst i mus injiceret med Le-SC-ASC lignede tumorvækst i mus, der modtog ID8 celler alene. Ob-SC-ASC forfremmet tumorvækst mere end gjorde Le-SC-ASC (

P

= 0,049). Ob-SC-ASC og Ob-V-ASC havde lignende tumorfremmende effekter (

P

= 0,84). Desuden blev tumorer i mus injiceret med Le-SC-ASC detekteres senest var tumorer i mus injiceret med ASC fra andre kilder (

P

= 0,024, Fig 4C).

ASC var coinjiceret med luciferase-udtrykkende ID8 tumorceller i C57BL /6-mus intraperitonealt (1: 1 ratio, 10

6 /hver). N = 5 pr gruppe. A, Sammenligning af tumorbelastning målt ved luciferase ekspression ved abdominal side mellem Ob-SC-ASC og Le-SC-ASC grupper. Fejl bar: 90% konfidensinterval. B, Sammenligning af tumorbelastning målt ved luciferase ekspression ved abdominal side mellem Ob-V-ASC og Le-V-ASC grupper. Fejl bar: 90% konfidensinterval. C, Sammenligning af tumor initiering blandt grupper. D, Luciferase signal måling af abdominal side i musene på dag 46.

Effekt af ASC på tumorens mikromiljø

For at bestemme virkningen af ​​ASC på in vivo tumorcelleproliferation, vi kvantificeret antallet af Ki-67-positive celler i ID8 tumorer med anvendelse af immunofluorescens (fig 5A og S4). Antallet af pixel positive repræsenterer frekvensen af ​​celler til Ki-67 var højere i ASC injicerede tumorer, men der var ikke anderledes mellem fede og magre grupper (Fig 5A og 5B). Tumorer fra Ob-SC-ASC gruppe indeholdt lidt højere Ki67 signaler end Ob-V-ASC (P & lt 0,05) (Fig 5A og 5B). Vi havde tidligere vist, at ASC understøtte dannelsen af ​​kar i endometrie xenografter [11]. For at bestemme om disse ASC virkninger på tumorvaskularitet modificeres ved fedme og vævskilde, blev tumorsnit farvet med GSL I-isolectin B4, som specifikt binder til endotelceller (Fig 5A). Vaskularisering var højere i alle ASC injicerede tumorer i forhold til ID8 tumorer alene med et betydeligt højere antal fartøjer upon co-injektion af Ob-SC-ASC end Le-V-ASC eller Ob-V-ASC (

P