PLoS ONE: MMP-10 /Stromelysin-2 Fremmer Invasion af hoved- og halscancer

Abstrakt

Baggrund

Periostin, IFN-induceret transmembrane protein 1 (IFITM1) og Vingeløse-typen MMTV integration hjemmeside familie, medlem 5B (Wnt-5b), blev tidligere identificeret som invasionen fremmes gener af hoved og hals pladecellecarcinom (HNSCC) ved at sammenligne genekspressionsprofilerne mellem forælder og et stærkt invasiv klon. Vi har tidligere rapporteret, at Periostin og IFITM1 fremmet invasionen af ​​HNSCC celler. Her viste vi, at Wnt-5b overekspression fremmet invasionen af ​​HNSCC celler. Endvidere stromelysin-2 (matrix metalloproteinase-10; MMP-10) blev identificeret som en fælles opreguleret gen blandt Periostin, IFITM1 og Wnt-5b overudtrykkende HNSCC celler ved hjælp microarray datasæt. I denne undersøgelse undersøgte vi roller MMP-10 i invasionen af ​​HNSCC.

Metoder og Resultater

Vi undersøgte ekspression af MMP-10 i HNSCC sager ved immunhistokemi. Høj ekspression af MMP-10 blev hyppigt observeret og var signifikant korreleret med invasionsevne og metastaser i HNSCC tilfælde. Dernæst undersøgte vi roller MMP-10 i invasionen af ​​HNSCC celler

in vitro

. Ektopisk overekspression af MMP-10 fremmet invasionen af ​​HNSCC celler, og knockdown af MMP-10 undertrykte invasionen af ​​HNSCC celler. Desuden MMP-10 knockdown undertrykt Periostin og Wnt-5b-promoveret invasion. Interessant, MMP-10 overekspression inducerede den formindskede p38 aktivitet og MMP-10 knockdown induceret øget p38 aktivitet. Derudover behandling med en p38-inhibitor SB203580 i HNSCC celler inhiberede invasion.

Konklusioner

Disse resultater antyder, at MMP-10 spiller en vigtig rolle i invasionen og metastase af HNSCC, og at invasion drevet af MMP-10 er delvist forbundet med p38 MAPK-inhibering. Vi foreslår, at MMP-10 kan anvendes som en markør for forudsigelse af metastase i HNSCC

Henvisning:. Deraz EM, Kudo Y, Yoshida M, Obayashi M, Tsunematsu T, Tani H et al. (2011) MMP-10 /Stromelysin-2 Fremmer Invasion af hoved- og halscancer. PLoS ONE 6 (10): e25438. doi: 10,1371 /journal.pone.0025438

Redaktør: Torbjørn Ramqvist, Karolinska Instituttet, Sverige

Modtaget: Januar 24, 2011; Accepteret: September 5, 2011; Udgivet: 5 oktober 2011

Copyright: © 2011 Deraz et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Arbejdet blev finansieret delvist af Ministeriet for uddannelse, videnskab og kultur i Japan tilskud-in-hjælp (Y. Kudo og T. Takata) og Kurozumi Mindefond tilskud (Y. Kudo). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Ingen yderligere eksterne midler modtaget for denne undersøgelse

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Hoved og hals pladecellekræft (HNSCC) er en af ​​de mest almindelige typer af human cancer, med en årlig incidens på mere end 500.000 tilfælde på verdensplan [1]. På trods af de fremskridt i behandlingsstrategier, dødeligheden og svigt af behandlingsmuligheder i HNSCC patienter er stadig høj. Høj dødelighed og dårlig prognose af HNSCC forudsiges ved forekomst af lymfeknudemetastase, som er en almindelig hændelse hos cancerpatienter [2]. HNSCC udvikler gennem akkumulering af multiple genetiske og epigenetiske ændringer i en multi-trins proces [3]. Forsøg på at identificere de gener, der er involveret i metastaser er afgørende for den tidlige forudsigelse af HNSCC adfærd. Processen med metastaser består af sekventielle og selektive trin, herunder proliferation, induktion af angiogenese, løsrivelse, motilitet, invasion i omløb, sammenlægning og overlevelse i kredsløbet, celle anholdelse i fjerne kapillære senge og ekstravasation i orgel parenkym [4], [5] . Identifikationen af ​​nye invasion og metastase relaterede molekyler i HNSCC og bedre forståelse af de mekanismer, som carcinomceller undergår i løbet af de trin i invasion og metastase er af afgørende betydning for at designe bedre terapeutiske strategier til behandling af denne sygdom.

genekspression microarrays er dukket op, og deres udbredte anvendelse har ført til identifikation af potentielle kandidatgener. Yderligere undersøgelse af de biologiske adfærd og signifikant klinisk resultat af disse gener især i HNSCC er af stor interesse. Vi har tidligere etableret en HNSCC cellelinie, MSCC-1, fra lymfeknudemetastaser [6]. Desuden isolerede vi et stærkt invasiv klon MSCC-INV1 fra MSCC-1-celler ved anvendelse af en

in vitro

invasion assayanordning [7]. Derefter sammenlignede vi den transkriptionelle profil for moder celler (MSCC-1) og en meget invasiv klon (MSCC-INV1) ved microarray analyse for at identificere gener, der er forskellige i deres ekspression [8]. Adskillige gener blev selektivt overudtrykt i det stærkt invasive klon. Blandt disse gener, Periostin (osteoblast-specifik faktor 2 (fasciclin jeg)) var den mest udtrykte gen, og den anden var IFITM1 (IFN-induceret transmembrane protein 1). Faktisk viste vi, at Periostin og IFITM1 forfremmet invasion både

in vitro

in vivo

[8], [9]. Vi identificerede også Vingeløse-typen MMTV integration hjemmeside familie, medlem 5B (Wnt-5b) som den tredje stærkt udtrykt gen i MSCC-INV1. Her har vi bekræftet evne Wnt-5b til at fremme invasion af HNSCC celler

in vitro.

Desuden identificerede vi matrixmetalloproteinase-10 (MMP-10) som en fælles opreguleret gen ved invasion fremme molekyler, herunder Periostin , IFITM1 og Wnt-5b. Matrixmetalloproteinaser (MMP’er) udgør en familie af zink-afhængige proteinaser, som er i stand til at nedbryde ECM komponenter, såsom collagener og proteoglycaner og de har en rolle i normal udvikling og vævsskade i forskellige patofysiologiske tilstande, der involverer arthritis, sårheling og tumorudvikling [10 ]. MMP’er kan inddeles i undergrupper, herunder; collagenaser, stromlysiner, gelatinaser og membran typen MMP [11]. Nogle medlemmer af MMP’er er impliceret i invasionen og metastase i HNSCC såsom MMP-2, membrantype-1 MMP (MT1-MMP), og MMP-9 [12], [13]. Overekspression af disse MMP’er er blevet korreleret med invasion, metastase, og dårlig prognose. I den foreliggende undersøgelse, undersøgte vi roller MMP-10 i invasionen af ​​HNSCC.

Resultater

Wnt-5b fremmer invasion af HNSCC

Wnt-5b er et medlem af Wnt-genfamilien, en gruppe af udskilte glycoproteiner, der spiller en vigtig rolle i onkogenese og i flere udviklingsprocesser og udløser intracellulære responser gennem forskellige signalveje. Ved at sammenligne den transkriptionelle profil af forælder celler og den meget invasive klon af microarray analyse, Wnt-5b var den tredje stærkt udtrykt gen i det stærkt invasive klon efter Periostin og IFITM1. Vi undersøgte først, om Wnt-5b var involveret i invasionen af ​​HNSCC. Den højere ekspression af Wnt-5b i det stærkt invasive klon sammenlignet med forælder cellerne blev verificeret ved RT-PCR (figur 1A). Vi undersøgte ekspressionen af ​​Wnt-5b mRNA i seks HNSCC cellelinier. Wnt-5b-mRNA-ekspression blev bemærket i næsten alle de HNSCC cellelinier undtagen HSC4 celle (figur 1A). For at tydeliggøre rollen som Wnt-5b i invasiv af HNSCC, genereret vi Wnt-5b-overekspression celler ved transfektion af Wnt-5b i HSC4 celler uden Wnt-5b udtryk. Efter at have fået den stabile klon af Wnt-5b-overekspression celler (figur 1B), blev de brugt til at kontrollere invasiv af

in vitro

invasion assay. Wnt-5b overekspression væsentligt forbedret invasionen af ​​HNSCC celler

in vitro

(figur 1B). For at bekræfte Wnt-5b-fremmet invasion af HNSCC celler undersøgte vi knockdown af Wnt-5b ved hjælp siRNA i HSC2 celler med høj ekspression af Wnt-5b. Behandling af Wnt-5b siRNA reducerede ekspressionen af ​​Wnt-5b mRNA og inhiberede invasion (figur 1B) signifikant. Selvom Wnt-5b ikke påvirkede cellevækst (figur 1C), det fremmes signifikant cellemotilitet af HNSCC celler som påvist ved sårheling assay (figur 1D). Interessant, Wnt-5b siRNA inhiberede signifikant cellemotilitet af HNSCC celler (figur 1D). Endvidere sammenlignede vi genekspressionsprofilen mellem kontrol og Wnt-5b-overudtrykkende HSC4 celler ved microarray analyse (Data S1). S100A8, SERPINB4, osteopontin og SERPINB3 blev opreguleret og TGF-SS2, CDH11 og thrombospondin 1 blev nedreguleret i Wnt-5b-overekspression celler (tabel S1).

A,

ekspression af Wnt- 5b i de meget invasive klon og HNSCC cellelinier. Ekspression af Wnt-5b-mRNA i MSCC-1, MSCC-INV1 samt seks HNSCC cellelinier; HSC2, HSC3, HSC4, Ca-9-22, Ho-1-N-1, og Ho-1-U-1 blev undersøgt ved RT-PCR. Ekspression af Wnt-5a-mRNA blev også undersøgt i 6 HNSCC cellelinier. GAPDH blev anvendt som en loading kontrol.

B,

Wnt-5b fremmet invasionen af ​​HNSCC celler. Til frembringelse af Wnt-5b-overudtrykkende celler, blev Wnt-5b ekspressionsvektor transficeres i HSC4 celler uden Wnt-5b ekspression. Vi opnåede stabil klon, og ekspressionen af ​​Wnt-5b blev undersøgt ved Western blotting med anti-Wnt-5b polyklonalt antistof (venstre øvre panel). Vi anvendte tom vektor transficerede celler (tom) som en kontrol. p-actin-ekspression blev anvendt som en loading kontrol. Den invasionsevne af Wnt-5b-overekspression celler (højre øverste panel) blev undersøgt af

in vitro

invasion assay. 1,5 × 10

5-celler blev anbragt på det øvre rum af celledyrkningsinsert. Efter 12 h inkubation blev den gennembrudte celler på den nedre side af membranen fikseret i formalin og farvet med hematoxylin. HSC2 celler med Wnt-5b ekspression blev transficeret ved Wnt-5b siRNA (siWnt-5b) eller kontrol siRNA (siControl). En forvrænget sekvens, der ikke viser signifikant homologi med rotte-, muse- eller humane gensekvenser blev anvendt som kontrol. Virkningen af ​​knockdown blev evalueret med RT-PCR (venstre nedre panel). GAPDH blev anvendt som en loading kontrol. Den invasionsevne af Wnt-5b-bankede-down celler blev undersøgt ved

in vitro

invasion assay (højre nederste panel). Efter 24 timers inkubation blev trængt celler på den nedre side af membranen fikseret i formalin og farvet med hematoxylin. Søjlerne viser gennemsnitsværdierne og SDS af tre uafhængige forsøg. * Signifikant forskellig fra tomme vektor transficerede celler eller kontrollere siRNA transficerede celler på

P

0,01.

C,

Celleproliferation af Wnt-5b-overudtrykkende celler og Wnt-5b-bankede-down celler. Celler blev udpladet på plader med 24 brønde, og trypsiniserede celler blev talt ved celletæller ved 0, 2, 4 og 6 døgn. Søjlerne viser gennemsnitsværdierne og SDS af tre uafhængige forsøg.

D,

Migration af Wnt-5b-overekspression celler og Wnt-5b-bankede-down celler. Migration af cellerne blev bestemt ved sårheling assay. 24 timer efter at ridse celler, fase-kontrast (10 × felt) af såret helingsprocessen blev fotograferet digitalt med et inverteret mikroskop. Afstanden af ​​de viklede områder blev målt på de billeder, der er på 100% for 0 timer, og den gennemsnitlige procentdel af de samlede afstande af de viklede områder blev beregnet. Søjlerne viser gennemsnitsværdierne og SDS af tre uafhængige forsøg. * Signifikant forskellig fra tomme vektor transficerede celler eller kontrol siRNA transficerede celler på

P

. 0,01

MMP-10 er identificeret som et fælles mål gen for Periostin, IFITM1 og Wnt -5b overekspression

for at identificere de fælles mål gener for Periostin, IFITM1 og Wnt-5b overekspression, vi sammenlignet genekspressionsprofilerne mellem kontrol- HSC2 celler og Periostin-overekspression HSC2 celler, kontrol Ca9-22 celler og IFITM1- overudtrykker Ca9-22 celler og kontrol HSC4 celler og Wnt-5b-overudtrykkende HSC4 celler (figur 2A). Som følge heraf blev flere grupper af gener med variable biologiske funktioner i normal udvikling og i processen for malignitet findes at være fælles i Periostin, IFITM1, og Wnt-5b-overudtrykkende celler (figur 2B). En række fælles målgener med variable biologiske adfærd, herunder celleadhæsion, celleproliferation, apoptose, cellecyklus og andre blev identificeret. Gene ontologi analyse blev udført ved anvendelse af Gene Spring GX software til at identificere de biologiske funktioner af disse molekyler (figur 2B). Fælles up-regulerede gener mellem Periostin- og IFITM1-overekspression, Periostin- og Wnt-5b-overekspression og IFITM1- og Wnt-5b-overekspression er anført i tabel S2, S3 og S4, henholdsvis. Adskillige gener blev den stærkt opreguleret blandt Periostin-, IFITM1-, og Wnt-5b-overudtrykkende HNSCC celler (tabel S5). Blandt disse blev stromelysin-2 (MMP-10) inkluderet. MMP’er er kendt som en familie af zink-afhængige proteinaser, som er i stand til at nedbryde ECM komponenter, og de har en rolle i tumorudvikling [10]. Men kun lidt om involvering af MMP-10 i invasionen og metastase af cancerceller. Derfor har vi fokuseret på MMP-10 som et fælles opreguleret molekyle fremkaldt af invasion relaterede faktorer HNSCC og undersøgt sin rolle i invasionen af ​​HNSCC.

A,

Schema viser den strategi til at identificere det fælles mål for invasion relaterede molekyler. Periostin, IFITM1, og Wnt-5b identificeres som invasionen beslægtede molekyler ved sammenligning genekspressionsprofilen mellem forælder (MSCC-1-celler) og en højt invasiv klon (MSCC-INV1 celler). For at identificere fælles mål for invasion relaterede molekyler, vi sammenlignet genekspressionsprofilerne kontrol vs. Periostin-overekspression HSC2 celler, kontrol vs. IFITM1-overekspression Ca9-22 celler, og kontrol vs. Wnt-5b-overekspression HSC4 celler. Ektopisk ekspression niveau af Periostin, IFITM1 og Wnt-5b i hvert celler er vist ved RT-PCR. GAPDH udtryk blev anvendt som en loading kontrol.

B,

flere opreguleres gener blev fundet mellem Periostin og IFITM1, Periostin og Wnt-5b, og Wnt-5b og IFITM1. Ved at bruge Gene ontologi software identificerede vi de biologiske funktioner af disse gener. Tabellen viser disse fælles opreguleres gener omfattende forskelligartede familier med variable biologiske funktioner.

Høj udtryk for MMP-10 er godt korreleret med invasion mønstre og metastaser i HNSCC

Vi først undersøgte ekspression af MMP-10 i 30 normale orale slimhindevæv og 116 HNSCC sager ved immunhistokemi. Kliniske oplysninger af 116 patienter, herunder alder, beliggenhed, tumorstørrelse, invasion mønster, metastase, tumor stadium TNM klassifikation, behandling, overlevelse og MMP-10 ekspression er vist i data S2. For at demonstrere antistof specificiteten af ​​immunhistokemisk farvning af MMP-10, udførte vi immunhistokemisk farvning uden sekundært antistof eller uden primært antistof som negativ kontrol (fig S1). Høj ekspression af MMP-10 blev observeret i 89 ud af 116 (76,7%) HNSCC tilfælde, mens ikke-neoplastisk epitel ikke viste MMP-10-ekspression (figur 3A). Derefter sammenlignede vi MMP-10 ekspression med invasion mønster, trin gruppering og lymfeknudemetastaser (tabel 1). Vi brugte Jacobsson klassificering (Patterns I-IV) til evaluering af invasion mønster (figur S2) [14]. Ud af 116 HNSCC tilfælde, 9, 12, 62 og 33 tilfælde viste det mønster I, II, III, og IV (tabel 1). Interessant var incidensen af ​​MMP-10 positive tilfælde i mønstret III og IV var signifikant højere end i mønstret I og II (figur 3B). Det er velkendt, at mønstre III og IV svarende til dårlig differentiering og høj metastatisk rate [14]. Korrelationen mellem MMP-10 ekspression og invasion mønster var statistisk signifikant (P 0,001) (tabel 1). Vi sammenlignede også MMP-10 ekspression med gruppe mellemstation. Fyrre-ni HNSCC sager var tilgængelige for trin gruppering (I-IV) i henhold til kriterierne i Japan Society for hoved- og halscancer [15]. Fleste tilfælde (97,1%) viste høj ekspression af MMP-10 i fremskredent stadium gruppe (III og IV), medens 46,7% af tilfældene viste høj ekspression af MMP-10 i tidlig fase gruppe (I og II). Korrelationen mellem MMP-10 ekspression og scene gruppering var statistisk signifikant (P 0,001) (tabel 1). Desuden blev MMP-10 ekspression korrelerede signifikant med lymfeknudemetastaser (P 0,001) (tabel 1 og figur 3B). Niogtyve af 89 HNSCC tilfælde med høj ekspression af MMP-10 havde lymfeknudemetastaser, mens 5 af 27 HNSCC tilfælde med lav ekspression af MMP-10 havde lymfeknudemetastaser (figur 3B). Desuden har vi undersøgt sammenhængen mellem MMP-10-ekspression og overlevelse i HNSCC tilfælde. Toogfyrre HNSCC tilfælde var tilgængelige for overlevelse analyse. Interessant, selv om der ikke var nogen statistisk signifikans (

P

= 0,21), patienter med høj ekspression af MMP-10 havde en tendens til at vise dårlig prognose (figur 3C).

A,

Immunhistokemisk ekspression af MMP-10 i 116 HNSCC tilfælde og 30 normale epitel. Normalt epitel er fuldstændig negativ for MMP-10 sammenlignet med HNSCC tilfælde, hvor de fleste tumorceller viste stærkt ekspression af MMP-10. er vist repræsentative tilfælde af lav MMP-10 ekspression i normalt oralt epitel og HNSCC tilfælde (Jacobsson klassifikation Pattern I), og som er repræsentative tilfælde af høj ekspression af MMP-10 (lav og høj forstørrelse) i HNSCC tilfælde (Jacobsson klassifikation Pattern IV). Scale bar er vist i hvert billede.

B,

Korrelation mellem MMP-10-ekspression og invasion og metastase i HNSCC tilfælde. Venstre graf viser forholdet mellem MMP-10 ekspression og mønsteret for invasion. Den Jacobsson klassificering (Patterns I-IV) blev anvendt til vurdering af invasion mønster (figur S1) [14]. * Signifikant forskellig fra mønster I eller II på

P

0,01. Lige graf udstiller forholdet mellem MMP-10-ekspression og metastase. * Signifikant forskellig fra lav ekspression af MMP-10 på

P

0,01.

C,

MMP-10-ekspression og dårligt resultat. Fyrre-to italienske HNSCC sager var til rådighed for overlevelse analyse. Kaplan-Meier-kurver viser overlevelsen af ​​HNSCC patienter med høj ekspression af MMP-10 (•, N = 34) eller lav ekspression af MMP-10 (▴, N = 8).

MMP-10 fremmer invasion af HNSCC

Vi undersøgte dernæst MMP-10 mRNA og protein i 6 HNSCC cellelinier ved RT-PCR og Western blot-analyse, hhv. Høj ekspression af MMP-10 mRNA og protein blev observeret i Ca9-22, Ho-1-U-1 og Ho-1-N-1-celler (figur 4A). I HSC2, HSC3 og HSC4 celler, MMP-10 ekspression var lav (Figur 4A). MMP-10-proteinekspression svarede til mRNA-ekspression niveau. For at undersøge om MMP-10 fremmer invasion af HNSCC

in vitro

, genereret vi MMP-10-overudtrykkende celler ved hjælp HSC2 og HSC3 celler med lav ekspression af MMP-10 (figur 4B). Vi bekræftede den højere aktivitet af MMP-10 i konditionerede medier af MMP-10-overudtrykkende celler ved stromelysin zymografi (figur 4B). Selvom MMP-10 overekspression ikke påvirkede celleproliferation (data ikke vist), det dramatisk forbedret invasive aktivitet i både HSC2 og HSC3 celler (

P

0,05) (Figur 4C). For yderligere at bekræfte MMP-10-medieret invasion af HNSCC celler undersøgte vi knockdown af MMP-10 ved hjælp af siRNA i Ca-9-22 og Ho-1-N-1-celler med høj ekspression af MMP-10. For MMP-10 knockdown, vi brugte 3 forskellige siRNAs (# 1, # 2 og # 3). Alle siRNA’er herunder cocktail af 3 siRNAs reducerede MMP-10-ekspression (figur S3). Vi anvendte cocktail af 3 siRNAs i følgende undersøgelser. MMP-10 knockdown inhiberede ekspressionen af ​​MMP-10 mRNA og protein i Ca9-22 og Ho-1-N-1-celler (figur 4D). MMP-10 knockdown undertrykte signifikant invasionen af ​​HNSCC celler (Figur 4E). Taget alle sammen, disse resultater viser, at MMP-10 spiller en vigtig rolle i invasionen af ​​HNSCC celler.

A,

ekspression af MMP-10 mRNA og protein i seks HNSCC cellelinjer. Ekspression af MMP-10-mRNA i HSC2, HSC3, HSC4, Ca-9-22, Ho-1-N-1, og Ho-1-U-1 blev undersøgt ved RT-PCR. GAPDH blev anvendt som en loading kontrol. MMP-10-proteinekspression niveau blev vurderet i de seks HNSCC cellelinier ved Western blot-analyse. Billeder af kort og lang eksponering af MMP-10-proteinekspression er vist. ß-actin blev anvendt som en loading kontrol.

B,

generation af MMP-10-overekspression celler. Vi opnåede adskillige kloner ved transfektion med pBICEP-FLAG-mærket MMP-10 i HSC2 og HSC3 celler. Ektopisk ekspression af MMP-10 blev bestemt ved Western blotting med anti-FLAG-antistof (venstre panel). β-actin blev anvendt som en loading kontrol. Enzymatisk aktivitet af MMP-10 blev detekteret ved stromelysin zymografi (højre panel). Aktive form af MMP-10 (pil hoved) blev påvist i konditionerede medier af MMP-10-overudtrykkende celler.

C,

Invasiv aktivitet af MMP-10-overekspression HSC2 (venstre panel) og HSC3 (højre panel) celler i sammenligning med tom vektor transficeret HSC2 og HSC3 celler (tom) af

in vitro

invasion assay. Cellerne blev fikseret efter inkubation af 12 timer eller 20 timer i HSC2 celler eller HSC3 celler. Figuren viser den farvede nedre side af membranen, hvor cellerne gennemtrænges (øvre panel). Graferne viser antallet af invaderede celler i MMP-10-overudtrykkende og tom vektor transficerede celler (nederste panel). Søjlerne viser gennemsnitsværdierne og SDS af tre uafhængige forsøg. * Signifikant forskellig fra tom vektor transfekterede celler på

P

0,01.

D,

MMP-10 siRNA undertrykte invasionen af ​​HNSCC celler. Cocktail af 3 forskellige MMP-10 siRNA’er blev transient transficeret ind i Ca-9-22 og Ho-1-N-1-celler med MMP-10 ekspression. En forvrænget sekvens, der ikke viser signifikant homologi med rotte-, muse- eller humane gensekvenser blev anvendt som kontrol. Efter 48 timers transfektion blev ekspression af MMP-10 mRNA og protein undersøges ved RT-PCR og Western blotting (WB), hhv. GAPDH mRNA og β-actin-protein blev anvendt som en loading kontrol. Densitometrisk analyse af MMP-10 ekspression blev udført. MMP-10 /GAPDH-forhold er vist.

E,

Undertrykkelse af invasion af MMP-10 knockdown i Ca9-22 og Ho-1-N-1 celler. Invasivitet af MMP-10 bankede-down celler blev undersøgt ved

in vitro

invasion assay i sammenligning med kontrol siRNA transficerede celler. En forvrænget sekvens, der ikke viser signifikant homologi med rotte-, muse- eller humane gensekvenser blev anvendt som kontrol. Efter 24 timers inkubation blev cellerne fikseret, og antallet af invaderede celler blev talt. Figuren viser den farvede nedre side af membranen, hvor cellerne gennemtrænges (venstre panel). Grafen viser antallet af invaderede celler (højre panel). Søjlerne viser gennemsnitsværdierne og SDS af tre uafhængige forsøg. * Signifikant forskellig fra kontrol siRNA transfekterede celler på

P

. 0,01

MMP10 knockdown undertrykker Periostin og Wnt-5b-forfremmet invasion af HNSCC celler

vores nuværende resultater viste, at MMP-10 er en almindelig opreguleret gen blandt Periostin, IFITM1, og Wnt-5b overekspression. Vi sammenlignede ekspressionen af ​​MMP-10 i Periostin, IFITM1, og Wnt-5b-overudtrykkende celler med det i kontrolceller. MMP-10 blev fundet at være opreguleret af Periostin eller Wnt-5b (figur 5A), men ikke af IFITM1 (data ikke vist). I vores microarray analyse, blev 17,4 gange forøgelse af MMP-10 ekspression observeret i Periostin-overudtrykkende HSC2 celler og 5,8 gange forøgelse af MMP-10 ekspression blev observeret i Wnt-5b-overudtrykkende HSC4 celler. Derfor undersøgte vi den potentielle rolle for MMP-10 i Periostin og Wnt-5b-forfremmet invasion i HNSCC. Vi undersøgte virkningen af ​​MMP-10 knockdown på invasionen i Periostin-overekspression Ca9-22 celler og i Wnt-5b-overudtrykkende HSC4 celler. Ekspression af MMP-10-protein blev reduceret med MMP-10 knockdown i Periostin- og Wnt-5b-overudtrykkende celler (figur 5B). Interessant, MMP-10 knockdown undertrykte signifikant den Periostin- og Wnt-5b-fremmet invasion (figur 5C), hvilket indikerer, at MMP-10 kan spille en rolle i invasionsevne drevet af Periostin- og Wnt-5b-overekspression i HNSCC. Vi undersøgte også MMP-10 knockdown i Periostin-overxpressiong HSC2 celler (Figur S4). I lignende til Periostin-overxpressiong Ca9-22 celler, MMP-10 siRNA undertrykt de invasive kapacitet i Periostin-overxpressiong HSC2 celler. Desuden MMP-10 knockdown inhiberede signifikant invasion i kontrol- Ca9-22 celler, medens MMP-10 knockdown lidt inhiberede invasion i kontrol HSC2 og HSC4 celler (figur 5C og fig S4). I Ca9-22 celler, iagttoges højt niveau af MMP-10 ekspression, men ikke i HSC2 og HSC4 celler (figur 4A). Som Ca9-22 celler viste endogene MMP-10-ekspression på højere niveauer, vi troede, at MMP-10 siRNA undertrykt invasive kapacitet gennem nedregulering af endogen MMP-10-ekspression i Ca9-22 celler. Niveauet af undertrykkelse af MMP-10 knockdown var sandsynligvis afhængig af ekspressionsniveauet af MMP-10.

A,

Ekspressionen af ​​MMP10 mRNA blev undersøgt ved RT-PCR i kontrol CA9 -22 celler, Periostin-overudtrykkende Ca9-22 celler, kontrol HSC4 celler og Wnt-5b-overudtrykkende HSC4 celler. GAPDH udtryk blev anvendt som en loading kontrol.

B,

MMP-10 knockdown ind Periostin- og Wnt-5b-overekspression celler. Cocktail af 3 forskellige MMP-10 siRNA’er blev transient transficeret ind Periostin-overekspression Ca-9-22-celler og Wnt-5b-overudtrykkende HSC4 celler. En forvrænget sekvens, der ikke viser signifikant homologi med rotte-, muse- eller humane gensekvenser blev anvendt som kontrol. Efter 48 timers transfektion blev MMP-10 proteinniveau undersøgt ved Western blot-analyse med anti-MMP-10-antistof i MMP-10 siRNA transficerede Periostin-overudtrykkende celler. ß-actin blev anvendt som en loading kontrol.

C,

invasionsevne af MMP-10 siRNA transficeret Periostin-overekspression Ca-9-22-celler (venstre panel) og Wnt-5b-overekspression HSC4 celler (højre panel) blev undersøgt af

in vitro

invasion assay. Efter 18 timers inkubation af HSC4 celler og 24 h inkubation af Ca9-22 celler blev celler fikseret, og antallet af invaderede celler blev talt. Figuren viser den farvede nedre side af membranen, hvor cellerne gennemtrænges (øvre panel). Graferne viser antallet af invaderede celler i knockdown og kontrolceller (nederste panel). Søjlerne viser gennemsnitsværdierne og SDS af tre uafhængige forsøg. * Signifikant forskellig fra kontrol på

P

. 0,01

MMP-10-forfremmet invasion er forbundet med p38 hæmning

For at vide mekanismen i MMP-10 fremmes invasion, vi observerede aktivitet af celle- signalering molekyler såsom p38, FAK, RSK, Akt, Src, og ERK ved western blotting under anvendelse af phosphorylering specifikt antistof i kontrol og MMP-10 overudtrykkende celler. Blandt disse molekyler, blev p38 inaktiveret ved MMP-10 overekspression (figur 6A). For yderligere at bekræfte involveringen af ​​p38 inhibering i MMP-10-fremmet invasion, den invasive evne kontrol og MMP-10-overudtrykkende celler efter behandling med p38-inhibitor, blev SB203580 undersøgt. Interessant SB203580 behandling fremmes signifikant invasionen af ​​kontrolceller med p38-aktivitet (figur 6B). På den anden side, havde SB203580 behandling ikke fremmer invasion i MMP-10 overudtrykkende celler uden p38 aktivitet. Derudover undersøgte vi, om en p38-inhibitor reddet blokken af ​​invasion induceret af MMP10 knockdown i MMP-10 overekspression HSC2 og HSC3 celler. MMP-10 knockdown i MMP-10-overudtrykkende celler fremmet invasiv kapacitet efter behandling med p38-inhibitor (fig S5). Men p38-inhibitor ikke fuldt redde den invasive kapacitet undertrykt af MMP-10 siRNA (figur S5). Desuden har vi bekræftet, at tilsætning af konditioneret medium fra MMP-10-overudtrykkende celler inhiberede p38 aktivitet i HSC2 og HSC3 celler (Figur 6C). Vi undersøgte også p38 aktivitet og invasionen af ​​MMP-10 knockdown i MSCC-INV1 celler. I MSCC-INV1 celler, MMP-10 knockdown lidt opreguleret p38 aktivitet (figur 6D) og hæmmede den invasive aktivitet (figur 6E).

A,

p38 hæmning blev bemærket i MMP-10 overudtrykkende celler. Niveauer af total og phosphorylerede former for p38, FAK, RSK, Akt, Src, og ERK i kontrol og MMP-10 overexpresing celler ved western blotting.

B,

Invasion af kontrol og MMP-10 overekspression celler efter behandling af p38-inhibitor. Den invasionsevne af blev undersøgt af

in vitro

invasion assay i tomme vektor transfekterede celler og MMP-10 overekspression celler med SB203580 behandling. Tom vektor transficerede celler blev anvendt som kontrol. Efter 12 h inkubation blev cellerne fikseret, og antallet af invaderede celler blev talt. Figuren viser den farvede nedre side af membranen, hvor cellerne gennemtrænges (øvre panel). Grafer viser antallet af invaderede celler (nederste panel). Søjlerne viser gennemsnitsværdierne og SDS af tre uafhængige forsøg. * Signifikant forskellig fra tom vektor transfekterede celler uden SB203580 behandling på

P

0,01.

C,

p38 aktivitet efter behandling med konditioneret medie fra MMP-10 overekspression celler. Konditionerede medier fra MMP-10 overudtrykker HSC2 og HSC3 celler blev opsamlet efter 48 timer af plating. Efter tilsætning konditionerede medier i 0, 6, 12 og 24 timer blev HSC2 eller HSC3 celler opsamlet. Ekspression af phospho-p38 og p38 blev undersøgt ved Western blot analyse.

D,

MMP-10 siRNA opregulerer p38 aktivitet i HNSCC celler. Cocktail af 3 forskellige MMP-10 siRNA’er blev transient transficeret ind MSCC-INV1 celler. En forvrænget sekvens, der ikke viser signifikant homologi med rotte-, muse- eller humane gensekvenser blev anvendt som kontrol. Efter 48 timers transfektion blev ekspression af MMP-10-protein undersøgt ved Western blotting. Niveauer af total og phosphorylerede former af p38 blev også undersøgt ved Western blotting. p-actin-ekspression blev anvendt som en loading kontrol.

E,

Undertrykkelse af invasion af MMP-10 knockdown i MSCC-INV1 celler. Den invasionsevne blev undersøgt af

in vitro

invasion assay. Efter 6 timers inkubation blev cellerne fikseret, og antallet af invaderede celler blev talt. Figuren viser den farvede nedre side af membranen, hvor cellerne gennemtrænges (øvre panel). Grafen viser antallet af invaderede celler (nederste panel). Søjlerne viser gennemsnitsværdierne og SDS af tre uafhængige forsøg. * Signifikant forskellig fra kontrol på

P

. 0,01

Diskussion

Invasion og metastase er det store problem, og den største hindring for behandling af HNSCC. Derfor er det vigtigt at identificere hidtil ukendte molekyler involveret i invasion og metastase af HNSCC. Vi identificerede adskillige invasion relaterede gener ved at sammenligne genekspressionsprofilerne mellem moderceller og en meget invasiv klon [8]. Periostin og IFITM1 blev identificeret som de højeste gener i en meget invasiv klon og deres involvering i invasion blev bekræftet af

in vitro

in vivo

undersøgelser [8], [9]. Her, demonstrerede vi, at Wnt-5b fremmet invasionen af ​​HNSCC celler (figur 1). Indtil videre er der kun én rapport, Wnt-5b opreguleres i cancer-cellelinjer og lidt er kendt om den rolle, Wnt-5b i kræft [16].