PLoS ONE: Virkningen af ​​Flavonoider på Matrix Metalloproteinase Sekretion og Invadopodia Formation i Meget Invasiv A431-III Cancer Cells

Abstrakt

Metastase er en væsentlig årsag til dødelighed hos kræftpatienter. Invadopodia anses for at være afgørende strukturer, der tillader kræftceller at trænge tværs af ekstracellulære matrix (ECM) ved anvendelse matrixmetalloproteinaser (MMP’er). Tidligere isolerede vi et stærkt invasiv A431-III sublinie fra parentale A431-celler ved Boyden kammer assay. De A431-III celler besidder højere invasive og vandrende evner, forhøjede niveauer af MMP-9 og en forbedret epitelial-mesenkymale overgang (EMT) fænotype. I denne undersøgelse opdagede vi, at A431-III-celler havde en forøget potentiale for at danne invadopodia og forbedret evne til at nedbryde ECM forhold til de oprindelige A431-celler. Vi observerede også forbedrede phosphoryleringsniveauerne af cortactin og Src i A431-III-celler; disse phosphorylerede proteiner er blevet rapporteret at være de vigtigste regulatorer af invadopodia formation. Flavonoider, næsten allestedsnærværende fordelt i fødevarer planter og planteprodukter fødevarer, er blevet dokumenteret at udvise anti-tumor egenskaber. Derfor var det af stor interesse for at udforske virkningerne af flavonoid antioxidanter på den metastatiske aktivitet af A431-III celler. Eksponering af A431-III celler til to potente kosten flavonoider, nemlig luteolin (Lu) og quercetin (Qu), forårsagede hæmning af invadopodia dannelse og formindskelse i ECM nedbrydning. Vi konkluderer, at Lu og Qu dæmpe phosphorylering af cortactin og Src i A431-III celler. Som følge heraf er der ensues en afbrydelse af invadopodia generation og undertrykkelsen af ​​MMP-sekretion. Disse ændringer, i koncert, medføre en reduktion i metastase

Henvisning:. Lin Y-C, Tsai P-H, Lin C-Y, Cheng C-H, Lin T-H, Lee KPH, et al. (2013) Effekten af ​​Flavonoider på Matrix Metalloproteinase Sekretion og Invadopodia Formation i Meget invasive A431-III cancerceller. PLoS ONE 8 (8): e71903. doi: 10,1371 /journal.pone.0071903

Redaktør: Donald Gullberg, Universitetet i Bergen, Norge

Modtaget: April 6, 2013; Accepteret: 4 Juli 2013; Udgivet: 21 august, 2013 |

Copyright: © 2013 Lin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af Taiwan Academia Sinica Tematisk Project (AS-96-TP-B06 til MTL). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Ingen yderligere eksterne midler modtaget for denne undersøgelse

Konkurrerende interesser:. Dr. Chithan C. Kandaswami er ansat af Castle Hills Health. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Metastase, spredning af kræft fra hjemstedet til distale væv i kroppen , anses for at være den primære bidragsyder til dødelighed i et flertal af cancere [1]. Over 90% af cancerassocierede dødsfald som følge af metastase og alligevel de mekanismer, der kontrollerer metastase mangler at blive yderligere belyst [2]. MMP’er er bedst dokumenteret kritiske proteolytiske enzymer, der er forbundet med tumormetastase [3]. For at lette metastase, tumorceller afhænge af aktiviteten af ​​mere end én MMP og andre mere generelle nedbrydende enzymer for at sætte dem i stand til at krydse vævsbarrierer de støder under processen med invasion. Det menes, at MMP’er nedbrydes ECM, og at denne handling gør det muligt tumorceller til at migrere, invadere og spredes til forskellige sekundære steder i kroppen, hvor de danner metastaser. MMP’er regulere tumormikromiljøet, og deres ekspression og aktivering øges i næsten alle humane cancere sammenlignet med dem i det normale væv svarende til cancer [4]. Et væld af nyligt påløbne oplysninger tyder på, at MMP’er rekrutteres til unikke overfladestrukturer, der betegnes invadopodia, og at de efterfølgende er i stand til at undergå sekretion [5], [6].

Invadopodia blev først opdaget i fibroblaster transformeret med v-src onkogenet, som koder for et konstitutivt aktive ikke-receptortyrosinkinase v-src [7], og udtrykket blev opfundet i 1989 [8]. Invadopodia er specialiseret actin-baseret membran fremspring fundet i cancerceller, som nedbryder ECM via lokalisering af proteaser [9]. Deres evne til at mægle ECM nedbrydning foreslår en kritisk rolle for invadopodia i cancer invasion og metastase. Invadopodia består af mange actin regulatoriske proteiner, såsom cortactin, N-WASP, ARP2 /3 og cofilin [10]. Selv om disse actin regulatoriske proteiner er også elementer i andre actin-baserede membran fremspring, matrix-nedbrydende evne skiller sig ud som en stor, vigtig og forudsigelig indeks invadopodia identifikation. Tre MMP, MMP-2, MMP-9 og MT1-MMP [11], er rapporteret at blive ansat til invadopodia for at skabe deres nedværdigende evne. Men de detaljerede mekanismer, hvormed MMPs transporteres og målrettet til invadopodia, og yderligere udskilles stort set ukendt.

I de senere år har flere molekylære spillere operative i invadopodia er blevet defineret af mutationsmønstre undersøgelser, RNA interferens undersøgelser eller ved indsættelse af hæmmende antistoffer. Blandt disse er den centrale rolle for Src ikke-receptortyrosinkinase i invadopodia regulering blevet udledes; efterfølgende undersøgelser har vist, at Src-kinaseaktivitet er essentiel for invadopodia dannelse og funktion [12], [13]. Faktisk denne aktivitet af Src-kinase i sig selv førte til opdagelsen af ​​invadopodia. Phosphorylering af sine proteiner er afgørende for invadopodia regulering og dette primært involverer tyrosinphosphorylering af Src kinase. En række Src substrater, såsom cortactin, Tks5, dynamin2, AMAP1 /ASAP1 og N-WASP, er blevet lokaliseret til invadopodia og er forpligtet ved dem til at være aktiv [10], [14], [15]. Når Src-kinase aktiveres af opstrøms integrin signal- eller vækstfaktorstimulering, disse proteiner undergår tyrosinphosphorylering; dette, så regulerer deres funktion som adaptere eller giver dem mulighed for at interagere med hinanden under samlingen af ​​de actin net [12], [16]. Mutation af tyrosinphosphoryleringssteder på disse proteiner inhiberer invadopodia dannelse og funktion [15], [17], hvilket yderligere understøtter betydningen af ​​tyrosinphosphorylering til invadopodia formation. Ud over at tyrosinphosphorylering af Src, har protein kinase C også blevet rapporteret at synergi med Src og deltage i reguleringen af ​​invadopodia ved phosphorylering serin eller threonin [16].

Cortactin, en actin regulatorisk protein, der fungerer under både aktiverings- og stabilisering trin actin forgrening, er for nylig blevet tegning fremtrædende opmærksomhed på grund af sin rolle i invadopodia dannelse [18]. Cortactin blev oprindeligt identificeret som en Src tyrosinkinase substrat [19]. Det blev opkaldt cortactin fordi det er lokaliseret til kortikale actin strukturer. Menneskelig cortactin er kodet af

CTTN

(tidligere

EMS1

) på kromosom 11q13, som ofte forstærkes i forskellige kræftformer, såsom bryst, hoved og hals [20]. Genamplifikation der resulterer i en overekspression af cortactin har vist sig at være forbundet med højere metastase /invasion og en dårlig prognose [21]. Overensstemmelse med dens actinbindende evne, har cortactin vist sig at lokalisere til perifere cellestrukturer, såsom lamellipodia og invadopodia. Nylige undersøgelser med henblik på at udforske de molekylære mekanismer, der regulerer actin polymerisering før MMP ansættelsen har antydet, at cortactin fosforylering er afgørende for invadopodia dannelse og modning [22] .Disse resultater tyder på, at Src tyrosinkinase og dets substrat cortactin sammen spiller meget betydelige roller i kræft invasion og migration [23].

for at bestemme, hvordan celler styrer invadopodia dannelse har flere forskere screenet en samling af farmakologisk aktive forbindelser med det formål at identificere kemikalier, som er i stand til at hæmme processen. Plant flavonoider er blevet anerkendt i nogen tid som besidder anti-tumor og anti-differentiering effekter [24] – [27]. Tidligere vi identificeret to kosten flavonoid bestanddele, Lu, en flavon, og Qu, et flavonol, som nogle af de mest potente plante flavonoider i form af deres

in vitro

biologiske aktiviteter. De udviser en række anticancer effekter, såsom væksthæmning og kinase-aktiviteter, induktionen af ​​apoptose, nedskrivning af differentiering, undertrykkelse af MMP-sekretion, reduktionen i tumorcelleadhæsion, inhibering af metastase og faldet i angiogenese [28] – [31]. Selv om disse to flavonoider er potentielt effektive som anti-invasive forbindelser til dato ingen undersøgelse har vurderet indflydelse Lu og Qu om invadopodia dannelse og funktion. I tidligere undersøgelser har vi dokumenteret, at både Lu og Qu kan blunt tyrosinkinase aktiviteter og i høj grad nedtrykke sekretionen af ​​MMP’er i tumorceller [26]. Vurdering af relevansen og betydningen af ​​hæmning af kinase aktiviteter og MMP-sekretion af disse flavonoider har fået os til at vurdere deres indvirkning på begivenhederne omkring invadopodia dannelse og funktion.

Materialer og metoder

Materialer

A431 human epidermal cancer cellelinje blev erhvervet fra American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA). De stærkt invasive A431-III-celler blev isoleret i vores laboratorium fra de parentale A431 tumorceller (A431-P) [32]. Føtalt bovint serum (FBS) og RPMI-1640 blev opnået fra GIBCO (Grand Island, NY). MMP-9 siRNA blev købt fra Invitrogen (Carlsbad, CA). PCR-primere blev indkøbt fra Purigo Biotech (Taipei, Taiwan). Quercetin blev købt fra Nacalai Tesque (Kyoto, Japan). Luteolin blev opnået fra Extrasynthese (Genay, Frankrig). Anti-cortactin antistof blev opnået fra Epitomic (Burlingame, CA). Anti-phospho-cortactin (Y421) antistof blev købt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Anti-Src antistof blev erhvervet fra Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY). Anti-phospho-Src (Y418) antistof blev købt hos Abcam (Cambridge, MA). Anti-Tks5 antistof og GM6001 blev opnået fra Millipore (Billarica, MA). Anti-MT1-MMP, TIMP1, blev TIMP2 antistoffer købt fra Genetex (Irvine, CA).

Fremstilling af cellelysater

Celler blev dyrket til 80% konfluens og derefter vasket med PBS. Cellerne blev lyseret med guld lysis buffer som tidligere beskrevet [26]. Uopløseligt materiale blev opsamlet ved centrifugering ved 14.000 ×

g

i 20 minutter ved 4 ° C. Proteinkoncentrationen kvantificeret under anvendelse af Bio-Rad protein assay (Hercules, CA). Prøverne blev derefter opdelt i 50 pi alikvoter og opbevaret ved -80 ° C til yderligere undersøgelse.

Transfektion af små interfererende RNA

A431-III-celler (2,5 x 10

5) blev udpladet i 60 mm dyrkningsskåle og fik lov at adhærere natten over. 6 pi Lipofectamine 2000 (Invitrogen) blev tilsat til 300 pi serum-frit medium, grundigt blandet og inkuberet i 5 minutter ved stuetemperatur. Parallelt blev 12 pi siRNA lager (10 uM) tilsættes for at adskille 300 pi serum-frit medium, blandet grundigt. Den fortyndede siRNA og Lipofectamine 2000, blev derefter kombineret og inkuberet i 20 minutter ved stuetemperatur. Endelig siRNA /Lipofectamine kompleks blev tilsat til 60 mm skål indeholdende 2,4 ml serumfrit medium giver en slutkoncentration på 40 nM. Efter 24 timer blev mediet indeholdende transfektion komplekset blev ændret, og frisk medium indeholdende 10% FBS blev tilsat; cellerne blev derefter inkuberet i yderligere 24 timer. Alle assays blev udført 48 timer efter transfektion.

Kvantitativ realtids-PCR

Totalt RNA blev isoleret ved anvendelse af High Pure RNA Isolation Kit (Roche, Basel, Schweiz), og revers transkriberet ved hjælp af MMLV High performance revers transkriptase-kit (Epicentre, Madison, WI). Kvantificering af transkriptet niveauer af målgener blev udført i LightCycler System (Roche) under anvendelse af en kommerciel SYBR Premix Ex Taq (Takara Bio, Shiga, Japan) og specifikke primer sæt.

Gene Expression microarray analyse

proceduren af ​​genekspression microarray analyse blev leveret af producenten Welgene Biotech (Taipei, Taiwan). Kort beskrevet både A431-P og A431-III-celler (1 x 10

6) blev udpladet på 100 mm skåle og lodes vokse i komplet medium. Efter 24 timer blev den totaler RNA fra begge celler ekstraheret ved 3 ml Trizol reagens. Genekspressionen microarray analyse af A431-P og A431-III-celler blev udført ved Welgene Biotech. De data, der behandles i denne publikation er deponeret i NCBI s Gene Expression Omnibus og er tilgængelige via GEO Series tiltrædelse nummer GSE47996 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE47996) .

gelatinezymografi

Det konditionerede medium blev opsamlet og separeret ved 8% SDS-PAGE indeholdende 0,1% gelatine. Efter elektroforese blev gelen vasket i 2,5% Triton X-100 i 20 minutter, to gange, at renaturere gelatinaserne og derefter inkuberet i reaktionsbuffer (50 mM Tris-HCI, pH 8,0, indeholdende 5 mM CaC

2, 0,02 % NaN

3) ved 37 ° C i 24 til 48 timer. Gelen blev derefter farvet med Coomassie Blue og affarvet med affarvning buffer som tidligere beskrevet [33]. Den gelatinaseaktivitet var synlig som klare zoner i gelen.

Western Blotting

Cellelysatet Prøverne blev blandet med 5 × prøvebuffer og kogt i 5 min, separeret på 10% SDS-polyacrylamid geler (PAGE) og derefter overført til nitrocellulosemembran (Millipore). Membranenhederne blots blev blokeret i PBS indeholdende 5% BSA i 1 time ved stuetemperatur og inkuberet med primært antistof natten over ved 4 ° C. Efter vask med TBST indeholdende 20 mM Tris-HCI (pH 7,6), 0,8% (vægt /volumen) NaCI og 0,25% Tween-20, blev blottene inkuberet med sekundært antistof konjugeret med peberrodsperoxidase (Millipore). Membranerne blev derefter vasket med TBST, og immunoreagerede bånd blev påvist med ECL reagenser og eksponeret på Fujifilm.

In Vitro Invasion Assay

filter i et 24-brønds Transwell enhed blev overtrukket med 0,1 ml 0,6 mg /ml EHS Matrigel. Det nedre rum indeholdt RPMI-1640 med 10% FCS som en kemoattraktant. Cellerne blev anbragt i det øvre rum (10

5 celler /0,5 ml RPMI-1640 indeholdende 0,1% BSA) i 24 timer. Efter inkubering blev filtrene fikseret med 3% glutaraldehyd i PBS og farvet med krystalviolet. Celler på den øvre overflade af filteret blev forsigtigt skrabet, og dem, der trængte gennem Matrigel til den nedre overflade af filteret blev talt under et mikroskop (20 ×).

Immunofluorescens

celler blev udpladet på 6-brønds plade indeholdende 18 mm gelatineovertrukne dækglas i 18-24 timer for at holde sig. Mediet blev derefter kasseret, og cellerne blev fikseret med 4% paraformaldehyd i 15 minutter, vasket med PBS, og permeabiliseret med 0,1% Triton X-100 i 10 min. Efter vask med PBS blev dækglassene blokeret med 1% BSA i PBS i 30 min. Cellerne blev derefter inkuberet med anti-cortactin eller anti-Tks5 antistoffer, som blev fortyndet i 1% BSA blokerende buffer i 1 time. Dette blev efterfulgt af inkubation med det passende sekundære antistof konjugeret til Alexa Fluro 555 (Invitrogen) i 1,5 time. De samme celler blev også farvet med Alexa fluor 488-konjugeret phalloidin og DAPI at detektere F-actin og cellekerner hhv. Dækglassene blev derpå monteret i 50% glycerol i PBS og analyseret ved confocol billede mikroskopi.

Matrix Degradation Assay

matrixnedbrydning assay blev udført ifølge en tidligere beskrevet procedure [34], og hele proceduren for matrixnedbrydning assayet blev udført i mørke. Kort fortalt blev 18 mm dækglas først coatet med 0,2 mg /ml Oregon Green® 488-konjugeret gelatine (Molecular Probe). Dækglassene havde 200 pi 0,5% iskold glutaraldehyd i PBS tilsat på dem, og blandingerne blev derefter inkuberet i 15 minutter ved 4 ° C. Efter vask med PBS blev dækglassene inkuberet med frisk 5 mg /ml NaBH

4 i PBS i 3 minutter ved stuetemperatur. Derefter blev dækglassene vasket med PBS og steriliseret i 70% ethanol. Efter standsning med serum-frit medium i 1 time, 1 x 10

5-celler blev podet på dækglas i 5 timer, og objektglassene blev forarbejdet til immunofluorescensanalyse under anvendelse phalloidin for at detektere F-actin og DAPI at detektere cellekernerne. Billederne blev visualiseret ved konfokal mikroskopi. For at kvantificere invadopodia dannelse og funktion blev invadopodia manuelt kvantificeret ved at tælle det totale antal celler, der producerer invadopodia i mindst fem individuelle felter ( 300 celler). Arealet af matrix runde de celler, der var blevet nedbrudt blev også målt under anvendelse af en identisk tærskel signal for Oregon Green® 488-gelatine fluorescens til hvert billede. Det forringede område målte var det område, hvor fluorescenssignalet var under tærsklen som målt ved ImageJ. Det kvantificeret område var derefter normaliseret mod antallet af celler.

konfokalmikroskopi

Fluorescerende billeder blev taget med et Zeiss LSM510 konfokal mikroskop med en 63 × olie nedsænkning linse, en NA 1.25 objektiv og pin hul på 0,1 luftige enhed. Billedanalyse blev udført ved hjælp af ImageJ software.

Statistisk analyse

Kvantitative data fra mindst tre uafhængige forsøg er udtrykt som middel (± SEM). Uparret Students t-test blev anvendt til at sammenligne forskellene mellem grupper. En

s

af. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

A431-III celler danner mere Invadopodia og forringe ECM effektivt

Vi har tidligere vist, at de A431-III-celler udviser større invasive og migrerende kapacitet sammen med forhøjede niveauer af MMP-9 [32]. Det giver os en pålidelig model til undersøgelse af mekanismen af ​​metastase /invasion ved at sammenligne A431-III-celler med de parentale celler (A431-P). For at bestemme om A431-P og A431-III-celler er i stand til at danne invadopodia, vi først udført immunofluorescens til påvisning og sammenligne dannelsen af ​​invadopodia ved A431-P og A431-III-celler. A431-P og A431-III-celler blev udpladet på gelatineovertrukne 6-brønds plader i 4 timer. Invadopodia kunne observeres som cortactin og actin-positive prikker placeret på ventrale site af celler. Som vist i figur 1A blev invadopodia let findes i A431-III-celler. Der var få eller ingen påviselig invadopodia synlig i A431-P celler. Dernæst blev matrixnedbrydning assay udført for at vurdere ECM nedbrydning kapacitet invadopodia i A431-P og III celler. A431-III-celler viste sig at have højere gelatine nedbrydende evne i forhold til A431-P-celler (Fig. 1A). Disse data antyder, at den større gelatine nedbrydende evne fundet at være associeret med A431-III-celler paralleller deres større evne til at danne invadopodia

A, Overpanel:. A431-P og A431-III-celler blev farvet med cortactin ( rød), F-actin (grøn), og DAPI (blå). Pilespidser, eksempler på invadopodia der er identificeret som cortactin og actin-positive prikker. Repræsentative billeder taget af begge celler. Underpanel: Begge celler blev udsået på Oregon Green® 488-konjugeret gelatine. Forringet ECM blev identificeret som et mørkt område på gelatinen. B, Øvre panel: Kvantificering af celler i forbindelse med matrixnedbrydning. Lavere panel: Kvantificering af nedbrydningen området normaliseret mod celle nummer. C, Invasion assays blev udført. *

s

0,05. Fejlsøjler præsentere standardfejlen på middelværdien. Scale bar er 22 um. P (A431-P); III (A431-III).

For at kvantificere dannelsen af ​​invadopodia og deres evne til at nedbryde ECM, vi beregnede procentdelen af ​​celler med invadopodia puncta, der var forbundet med nedbrudte gelatine patches. Som vist i figur 1B, blev over 35% af A431-III-celler sig at danne invadopodia og at nedbryde gelatine. Dette adskiller sig med resultaterne for A431-P, hvor kun 5% af A431-P-celler blev fundet at danne invadopodia. Vi kvantificerede også det område af de nedbrudte patches og normaliseret dette mod celleantal. A431-III-celler udviste en 10 gange højere evne til at nedbryde gelatine end gjorde A431-P-celler. Denne større evne invadopodia dannelse og nedbrydende funktion svarede til den invaderende evnen af ​​disse celler (Fig. 1C). Sammenfattende disse resultater tyder på, at, når der sammenlignes med A431-P celler, stærkt invasive A431-III celler udviser en langt større evne til at danne invadopodia og at dette fører til mere nedbrydning af ECM og øget invasiv evne.

Cortactin Phosphorylering Fremmer invadopodia dannelse og Matrix Nedbrydning

for nylig har flere rapporter godkendt, at overekspression af invadopodia regulatorer eller invadopodia komponent proteiner er i stand til at forbedre invadopodia formation. For yderligere at bekræfte, om disse regulatorer er opreguleret i A431-III celler, vi udførte microarray og qPCR analyser at belyse denne begivenhed. Til vores overraskelse var der ingen signifikant stigning i alle kendte invadopodia regulator eller komponent protein (figur 2A . 2B). Disse data tyder på, at forskellen mellem A431-P og A431-III, i form af invadopodia, vil sandsynligvis være på signaltransduktion plan snarere end på proteinekspression niveau.

A, Expression af invadopodia regulatorer, kernekomponenter og MMP’er /TIMP’er i A431-P og A431-III blev analyseret ved mikroarray. B, Ekspression af invadopodia regulatorer, komponenter og MMP /TIMP’er blev valideret af qPCR. C, Totale cellelysater blev udsat for immunblotting analyse. Den aktive status Src kinase og phosphorylering af cortactin blev bestemt.

Src kinase spiller en fundamental rolle i reguleringen af ​​invadopodia dannelse [12], [13]. Adskillige komponentproteiner vides at undergå tyrosinphosphorylering under invadopodia genese, herunder cortactin [9], [35]. Phosphorylering af cortactin af Src-kinase er en nøgleafbryder, der tillader omdannelse af actinfilamenter og aktiveringen af ​​invadopodia dannelse og funktion [17], [22]. For at teste rolle Src i invadopodia dannelse og funktion, vi undersøgte Src-kinaseaktivitet ved hjælp af anti-phosphoryleret Src antistof i A431-P og III celler. Som vist i figur 2C, fandt vi, at Src-kinase blev signifikant aktiveret i A431-III-celler, og efterfulgt af en stigning i phosphorylering af nedstrømsmål, cortactin. Disse resultater tyder på, at Src-kinaseaktivitet, snarere end den transskriptionelle induktion af Src eller enhver anden invadopodia regulator /komponent, sandsynligvis vil være ansvarlig for forøget invadopodia dannelse ved A431-III-celler, i konkordans med vores følgeslutning om microarray data.

for yderligere at bekræfte rolle Src kinase og cortactin fosforylering i invadopodia dannelse i A431-III celler, vi derefter behandlet celler med SU6656, en selektiv Src kinase inhibitor. Resultatet viste, at invadopodia dannelse dramatisk blev undertrykt ved behandling med SU6656 (fig. 3A), som var de invaderende evner detekteret ved invasion assays (fig. 3D). Kvantificering af procentdelen af ​​invadopodia-positive celler og relative nedbrydning område er vist i figur 3B. Disse resultater viser, at en reduktion i phosphorylering af Src følge af hæmningen af ​​Src-kinaseaktivitet ved SU6656, mens også ledsaget af en lavere cortactin phosphorylering (fig. 3C). Disse data antyder, at Src-kinase aktivitet er nødvendig for invadopodia dannelse og den invasive potentiale.

A blev A431-III-celler udpladet på gelatine eller Oregon Green® 488-konjugeret gelatine og behandlet med DMSO eller 5 uM SU6656 for 5 timer for at undersøge dannelsen af ​​invadopodia og matrixnedbrydning. B, Kvantificering af celler i forbindelse med matrixnedbrydning (øvre panel). Kvantificering af nedbrydningen områdenormaliseret mod celleantal (nederste panel). C, Totale cellelysater blev forberedt til immunblotting analyse. Aktiv Src og nedstrøms target cortactin (Y421) blev analyseret. D, Invasion assays blev udført. *

s

0,05. P-værdier er sammenlignet med kontrol A431-III. Fejlsøjler præsentere standardfejlen på middelværdien. Scale bar er 22 um.

MMP aktivitet er påkrævet for Invadopodia Dannelse og Matrix Nedbrydning

For at metastaserer, tumorceller afhængige invadopodia dannelse og MMP at udføre fordøjelsen af ​​ECM, som letter cellepenetration tværs af ECM barriere. Inddragelsen af ​​MMP i invadopodia aktivitet er afgørende, hvis proteolyse skulle opstå. At bestemme korrelationen af ​​MMP’er og invadopodia dannelse i A431-III, vi først målte evnen for A431-III-celler til dannelse invadopodia og nedbryde ECM’en i nærvær af GM6001, en bredspektret MMP-inhibitor. Vores undersøgelse brugte Tks5 som en markør til at opdage invadopodia dannelse og funktion. Behandling A431-III celler med 25 pM GM6001 helt afskaffet gelatine nedbrydning (fig. 4A). Ingen påviselige invadepodia dot-lignende strukturer i A431-III-celler blev observeret efter behandling med GM6001. Denne virkning kan skyldes invadopodia manglende dannelse af en stabil struktur, når MMP-aktivitet inhiberes. Kvantificering af procentdelen af ​​invadopodia-positive celler og for de relative nedbrydning områder er vist i figur 4B. Virkningerne af GM6001 på MMP’er aktiviteter og TIMP’er blev målt ved Western blot og zymografi (fig. 4C). Sammen vores resultater viser den afgørende betydning af MMP-aktivitet i nedværdigende evne A431-III celler, og hvordan MMP aktivitet påvirker dannelsen af ​​invadopodia struktur.

A, A431-III-celler blev udsået på gelatine eller Oregon Green® 488-konjugeret gelatine og behandlet med DMSO eller 25 uM GM6001 i 5 timer for at observere dannelsen af ​​invadopodia og matricen nedbrydende evne. Tks5, invadopodia komponent protein, blev anvendt som en markør. B, Kvantificering af celler i forbindelse med matrixnedbrydning (venstre panel). Kvantificering af nedbrydning områdenormaliseret mod celleantal (højre panel). C, Effekt af GM6001 på MMP’er aktiviteter og TIMP’er ‘ekspression blev målt ved zymografi og western blot. D, Cellerne blev behandlet med 40 nM MMP-9 siRNA eller kontrol siRNA. Knockdown effektivitet blev målt ved qPCR (venstre) eller gelatinezymografi (højre). E, A431-III-celler (som udtrykker kontrol eller MMP-9 knockdown siRNA) blev udpladet på gelatine eller Oregon Green® 488-konjugeret gelatine for at undersøge dannelsen af ​​invadopodia og matricen nedbrydende evne. . F, Kvantificering af celler i forbindelse med matrix nedbrydning (venstre panel) og nedbrydning område normaliseret mod celle nummer (højre panel) *

s

0,05. Fejlsøjler præsentere standardfejlen på middelværdien. Scale bar er 22 um.

Tre MMP, MT1-MMP (MMP14), MMP-2 og MMP-9, er blevet rapporteret at være forbundet med invadopodia fungerer i forskellige cellelinjer [13], [36], [37]. Vi har vist, at MMP-9-aktivitet er nøglen MMP som markant øger i A431-III-celler (figur 2A . 2B) [32], og at dette protein spiller en væsentlig rolle i migration, invasion og EMT [33]. På grund af det faktum, at MT1-MMP og MMP-2 undergår ringe eller ingen ændringer i A431-III-celler, er det således sandsynligt, at en forøgelse af MMP-9-niveau er den mest betydningsfulde faktor til stigningen i invadopodia proteolytisk aktivitet. At bekræfte, om MMP-9 bidrager til invadopodia dannelsesproces blev en blokade af endogen MMP-9-aktivitet i A431-III-celler udføres af siRNA knockdown. Knockdown af MMP-9 i A431-III-celler blev bekræftet ved qPCR og zymografi analyser (Fig. 4D). Tabet af MMP-9 resulterede i en manglende detektering invadopodia puncta i A431-III-celler (fig. 4E). Knockdown af MMP-9 i A431-III-celler var tilstrækkelig til at forringe invadopodia dannelse ved cirka 60% og forårsage en reduktion på 70% i det samlede areal nedbrydes af disse celler som vist i figur 4F. Generelt knockdown af MMP-9 i A431-III-celler havde et lignende resultat med den for udsættelse for GM6001. I begge tilfælde var der enten en manglende detektering invadopodia eller en betydelig reduktion i antallet af invadopodia dot-lignende strukturer. Kollektivt, disse resultater viser, at MMP-9 spiller en vigtig rolle i induktionen af ​​invadopodia generation og den efterfølgende nedbrydning af ECM.

Luteolin og Quercetin Hæmmet Src kinase aktivitet og påvirkede Downstream Target Cortactin

i vores tidligere undersøgelser, vi identificeret to af de mest potente kendte flavonoider, nemlig Lu og Qu. Disse flavonoider udviser en række anti-cancer effekter, såsom inhibering af cellevækst og kinaseaktivitet, undertrykkelse af MMP’er ekspression og sekretion, fald i migrering /invasion, og vending af EMT [26], [29], [38], [39]. Selv om disse to flavonoider er potentielt effektive som anti-invasive forbindelser til dato ingen undersøgelse har vurderet indflydelse Lu og Qu om invadopodia dannelse og funktion. Baseret på deres virkninger på kinaseaktivitet og MMP’er [26], postulerede vi, at Lu og Qu kan have evnen til at forstyrre dannelsen og funktion invadopodia. Der er fremsat forslag, at Src, først er aktiveret, er i stand til at transducere signaler til downstream mål, der derefter modulerer cellevækst, overlevelse, migration og invasion [40]. Disse resultater fik os til at undersøge, om behandling med enten Lu eller Qu ville have en direkte hæmmende effekt på Src tyrosinkinaseaktivitet, og nedskrivninger på cortactin fosforylering som en konsekvens.

Behandling med enten Lu eller Qu fandtes at formindske src phosphorylering og phosphorylering af cortactin (fig. 5A). Ud over den hæmmende virkning på Src og cortactin phosphorylering, vi også undersøgt virkningerne af disse to flavonoider på MMP-aktivitet. Som vist i fig. 5B, Lu eller Qu undertrykt sekretion af MMP-2 og MMP-9-aktivitet, men havde ingen væsentlig indvirkning på MT1-MMP, TIMP1 og TIMP2.

Celler blev behandlet med 20 pM Lu eller Qu i serum fri medium i 24 timer. A, samlet cellelysater blev underkastet til immunblotting analyse. Aktiv Src og nedstrøms target cortactin (Y421) blev bestemt. B, betinget medier og cellelysat blev analyseret for MMP’er aktiviteter og TIMP’er ‘udtryk ved hjælp gelatinezymografi og western blot. C, Repræsentative billeder af A431-III behandlet med Lu eller Qu. Venstre panel: Cellerne blev farvet med cortactin (rød) og F-actin (grøn). Højre panel: A431-III-celler blev udpladet på Oregon Green® 488-konjugeret gelatine at undersøge matrix nedbrydende evne. D, Kvantificering af celler i forbindelse med matrixnedbrydning (venstre panel). Kvantificering af nedbrydning områdenormaliseret mod celleantal (højre panel). E, Invasion assays blev udført. *

s

0,05. P-værdier er sammenlignet med kontrol A431-III. Fejlsøjler præsentere standardfejlen på middelværdien. Scale bar er 22 um.

For yderligere at undersøge virkningen af ​​Lu og Qu behandling på invadopodia dannelsesproces, vi evaluerede evne A431-III cellerne danner invadopodia og nedbryde gelatine i tilstedeværelse af Lu eller Qu.