PLoS ONE: TGF-beta Undertrykker VEGFA-medieret angiogenese i Colon Cancer Metastasis

Abstrakt

FET cellelinie, der stammer fra et tidligt tidspunkt kolon karcinom, er ikke-tumorigen i athymiske nøgne mus. Manipulerede FET celler, som udtrykker TGF-α (FETα) display konstitutivt aktive EGFR /ErbB signalering. Disse celler let dannes xenotransplantattumorer i athymiske nøgne mus. Vigtigere, FETα celler bevarede deres respons på TGF-beta-medieret vækstinhibering, og ligesom de parentale FET celler, ekspression af en dominant negativ TGF-beta receptor type II (DNRII) i FETα celler (FETα /DNRII) ophævet modtagelighed for TGF -beta-induceret vækstinhibering og apoptose under stressbetingelser

in vitro

og forøget metastatisk potentiale i en ortotopisk model

in vivo

, hvilket indikerer metastase suppressor aktivitet af TGF-beta-signalering i denne model. Kræft angiogenese er bredt anerkendt som en vigtig egenskab for tumor dannelse og progression. Her viser vi, at TGF-beta-signalering inhiberer ekspression af vaskulær endotel vækstfaktor A (VEGFA), og at tab af autokrin TGF-beta i FETα /DNRII celler resulterede i øget ekspression af VEGFA. Regulering af VEGFA ekspression ved TGF-beta er ikke på det transskriptionelle niveau, men på post-transkriptionel niveau. Vores resultater viser, at TGF-beta falder VEGFA protein stabilitet gennem ubiquitinering og nedbrydning i en PKA- og Smad3-afhængige og Smad2-uafhængig vej. Immunhistokemisk (IHC) analyser af ortotopisk tumorer udviste signifikant reduceret TGF-beta signalering, øget CD31 og VEGFA farvning i tumorer i FETα /DNRII celler sammenlignet med dem af vektor kontrolceller. Disse resultater indikerer, at inhibering af TGF-beta signalering øger VEGFA ekspression og angiogenese, som potentielt kunne bidrage til øget metastase af de celler

in vivo

. IHC undersøgelser udført på human kolon adenocarcinom prøver viste, at TGF-beta signalering er omvendt korreleret med VEGFA udtryk, hvilket indikerer, at TGF-beta-medieret undertrykkelse af VEGFA udtryk findes hos patienter med tyktarmskræft

Henvisning:. Geng L, Chaudhuri A, Talmon G, Wisecarver JL, Wang J (2013) TGF-beta Undertrykker VEGFA-medieret angiogenese i Colon Cancer Metastase. PLoS ONE 8 (3): e59918. doi: 10,1371 /journal.pone.0059918

Redaktør: Lu-Zhe Sun, University of Texas Health Science Center, USA

Modtaget: December 14, 2012; Accepteret: 20 Februar 2013; Udgivet: 25 marts 2013

Copyright: © 2013 Geng et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health giver P20RR018759 og R01CA140988-01 (https://projectreporter.nih.gov/project_info_description.cfm?aid=8215881 icde=14708223 ddparam= ddvalue= ddsub= cr=1 csb=default cs=ASC) til JW. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

transformerende vækstfaktor beta (TGF-beta) omfatter en gruppe af multifunktionelle polypeptider, som regulerer forskellige cellulære processer, herunder celleproliferation, apoptose, differentiering, migration, tumorigenecity og metastase, ved binding til TGF-beta-receptorer. Mange undersøgelser viser, at TGF-beta signalering fungerer som enten en tumor promotor eller en tumor suppressor. Tumorpromotoren funktion af TGF-beta har været forbundet med dets evne til at inducere en epitelial til mesenkymale overgang (EMT), som giver resistens over de apoptotiske virkninger af TGF-beta [1] – [3]. Imidlertid har vi og andre demonstreret eksperimentelt, at TGF-beta medierer tumorsuppressoraktivitet i en række forskellige cancere, herunder coloncancer, og at tab af TGF-beta-signalering fører til erhvervelse og progression af malignitet [4] – [11]. Vores seneste undersøgelser viser, at TGF-beta signalering undertrykker metastase i en delmængde af kolon kræftceller i en ortotopisk model

in vivo

[12]. Derfor identificerer mekanismen (er), hvorved TGF-beta fremkalder sin metastaser suppressor funktion er afgørende for vores forståelse af tumor progression og for udvikling af effektive terapeutiske strategier.

Angiogenese er en vigtig faktor for tumor progression. Faste tumorer kan ikke vokse ud over en vis størrelse uden tilstrækkelig vaskulær forsyning til at give tilstrækkelig ilt og næringsstoffer. VEGF /VEGFR-vejen er et centralt mediator af angiogenese [13] og VEGFA virker som en potent tumor angiogen faktor [14]. VEGFA stimulerer væksten af ​​nye blodkar, som giver tumorer med nødvendige ilt og næringsstoffer [14], [15]. Ekspression af VEGFA er blevet vist at blive reguleret på det transskriptionelle og translationelle niveau [16] – [19]. Regulering af VEGFA udtryk ved TGF-beta signalering er ikke blevet meget godt undersøgt. Det er blevet rapporteret, at TGF-beta inducerer VEGF-sekretion i humane cytotrophoblastceller [20]. Tværtimod anden gruppe viste, at TGF-beta antisense-oligonukleotider forøger VEGFA ekspression i humane keratinocytter og hudfibroblaster

in vitro

[21]. Derfor kan TGF-beta differentielt regulerer VEGFA ekspression afhængig cellulær sammenhæng.

FET coloncarcinomcellelinie, der blev isoleret fra en brønd differentieret tidligt stadium kræft, bevarer autokrin TGF-beta-aktivitet. Disse celler danner en lille tumor knude på stedet for inokulering i athymiske nøgne mus, der ikke gradvis vokse og regredere derefter over 3-5 uger [5], [22]. Den manglende evne af disse coloncarcinomceller afledte celler til at generere progressiv tumorvækst

in vivo

antyder, at i forhold til de mere fremskredne model cellelinier, FET celler bevarer mange normale vækst kontroller, herunder den hæmmende reaktion på TGF-beta. Derfor blev FET celler manipuleret til at udtrykke TGF-α (FETα), som konstitutivt aktiverer EGFR /ErbB signalering. Disse celler (FETα) let dannes xenotransplantattumorer i nøgne mus [22]. Men FETα celler bevaret deres respons på TGF-beta-medierede væksthæmning og sjældent spredt

in vivo

. Ekspression af en dominant negativ TGF-beta receptor type II (DNRII) i FETα celler, betegnet FETα /DNRII ophævede modtagelighed for TGF-beta-induceret vækstinhibering og apoptose under stressbetingelser

in vitro Salg og signifikant forøget metastatisk potentiale i en ortotopisk model

in vivo

[12]. Det ser således ud, at tabet af TGF-beta tumorsuppressor respons er permissiv for udvikling af metastase af FETα celler, der giver dokumentation til støtte for metastase suppressor funktion af TGF-beta signalering i denne celle model. Den aktuelle undersøgelse udnytter FETα /vektor og FETα /DNRII celle modelsystem til at teste den hypotese, at TGF-beta signalering medierer angiogenese gennem regulering VEGFA ekspression, hvilket kan bidrage til metastase suppressor funktion af TGF-beta. I denne undersøgelse rapporterer vi, at i colon cancerceller, TGF-beta inhiberer VEGFA ekspression på post-transkriptionel niveau, sandsynligvis ved at formindske VEGFA proteinstabilitet gennem ubiquitinering og nedbrydning. Denne regulering er Smad3-afhængig og Smad2-uafhængig. Vores data indikerer også, at TGF-beta-medieret nedregulering af VEGFA ekspression er gennem en PKA-medieret vej. Desuden viser vi, at tabet af autokrine TGF-beta i FETα /DNRII celler resulterer i øget ekspression af VEGFA sammenlignet med kontrol- celler både

in vitro

i viv

o, hvilket antyder, at et aspekt af autokrin TGF-beta-aktivitet i sin metastase suppressor kontekst undertrykker angiogenese. Endelig IHC studier af sektioner af humane colon adenokarcinomer viser, at TGF-beta signalering er omvendt korreleret med VEGFA udtryk, der angiver, at forbindelsen mellem tab af TGF-beta-aktivitet og øget VEGFA udtryk findes også hos patienter med tyktarmskræft.

Materialer og metoder

Alle forsøg med dyr blev godkendt af University of Nebraska Medical center Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC #: 07-043-08-FC).

cellelinier og reagenser

FETα /DNRII celler blev opnået ved transfektion af en dominerende negativ TGF-beta type II receptor i FETα celler, hvorimod FETα /vektor kontrol celler blev genereret ved transfektion af en kontrol plasmid. FETα /vektor, FETα /DNRII, HCT116, RKO, C, CBS, GEO og parentale FET coloncarcinomaceller [9] blev dyrket ved 37 ° C i en fugtig inkubator med 5% CO

2 i McCoys 5A serumfrit medium (Sigma) suppleret med 5 ng /ml epidermal vækstfaktor, 20 ug /ml insulin, og 4 ug /ml transferrin som tidligere [23] beskrevne. Rekombinant human TGF-beta1 blev købt fra R pSmad3;. figur 1D, venstre panel). Følgelig blev VEGFA ekspression signifikant forøget i DNRII celler sammenlignet med vektor kontrolceller (fig. 1D, venstre panel). Immunofluorescens-farvning af VEGFA bekræftede higer ekspression af VEGFA i FETα /DNRII celler end i FETα /vektor-celler (fig. 1D, højre panel).

(A) Western blot-analyse af VEGFA ekspression i forskellige coloncancer-cellelinjer og HCT116 celler re-udtrykkende TGF-beta RII. (B og C) FET-celler blev dyrket til 50% konfluente og behandlet med 4 ng /ml TGF-beta1 for de indikerede tidsperioder (B) eller med 4 ng /ml TGF-beta1 i nærvær eller fravær af 200 nM SB525334 for 48 timer (C). Western blot analyser blev udført med et anti-VEGFA antistof til påvisning VEGFA ekspression. β-actin blev anvendt som en loading kontrol. (D) Western blot (venstre panel) og immunfarvning (højre panel) analyser af VEGFA udtryk i FETα /vektor og FETα /DNRII celler. Phosphorylering af Smad2 og Smad3 (pSmad2 pSmad3) viste sig at indikere Smad aktivering (venstre panel)

TGF-beta hæmmer VEGFA udtryk ved post-transkriptionel niveau

Til. bestemme, hvordan TGF-beta undertrykker VEGFA ekspression, blev mRNA-ekspression af VEGFA bestemt i FET celler behandlet med TGF-beta for forskellige tidsperioder. RT-PCR-resultater viste, at VEGFA mRNA-niveauer forblev uændret efter TGF-beta behandling i op til 48 timer (fig. 2A, øvre panel). Kvantificering af gentagne forsøg bekræftede observation (fig. 2A, nedre panel). Disse resultater viser, at TGF-beta regulerer VEGFA ekspression på post-transkriptionel niveau. En af de mulige mekanismer for post-transkriptionel regulering er, at proteinstabilitet. For at bestemme om TGF-beta signalering regulerer proteinstabilitet af VEGFA, cycloheximid (CHX) blev tilsat til FET celler til at inhibere proteinsyntese, mens de blev behandlet med TGF-beta. Under disse betingelser niveauer af VEGFA faldt hurtigere i TGF-beta-behandlede prøver, end i kontrolprøverne (fig. 2B, øvre panel). Kvantificering og normalisering af intensiteten af ​​VEGFA bånd med den for de tilsvarende actin bands viste klart, at TGF-beta behandling reducerede halveringstid VEGFA protein (fig. 2B, nederste panel), hvilket viser, at TGF-beta regulerer VEGFA proteinstabilitet . For yderligere at dissekere den underliggende mekanisme, en proteasominhibitor, MG132 eller ubiquitin E1 inhibitor, PYR41, blev anvendt til behandling FET celler sammen med TGF-beta. Som vist i figur 2C, enten MG132 eller PYR41 forhindrede TGF-beta-medieret suppression af VEGFA ekspression. Disse resultater antyder, at TGF-beta-signalering falder VEGFA proteinstabilitet gennem ubiquitinering og nedbrydning.

(A) FET-celler blev dyrket til 50% konfluente og behandlet med 4 ng /ml TGF-beta1 for de angivne tidsperioder. RT-PCR blev udført som beskrevet i

Materialer og fremgangsmåder Salg (øvre panel). Intensiteten af ​​hver VEGFA mRNA bånd blev kvantificeret og normaliseret med den for det tilsvarende actin band. Værdier er middel ± S.E. fra tredobbeltforsøg (lavere panel). (B) Western blot-analyse af VEGFA ekspression blev udført ved de angivne tidspunkter i FET celler behandlet med 100 ug /ml cycloheximid (CHX), enten enkeltvis eller CHX og TGF-beta sammen (øvre panel). Intensiteten af ​​hver VEGFA bånd blev kvantificeret og normaliseret med den for det tilsvarende actin band (nederste panel). (C) Western blot-analyse af VEGFA ekspression i FET celler behandlet med TGF-beta alene, TGF-beta med MG132 (10 uM) eller TGF-beta med PYR41 (15 uM). (D) Angivelse af Smad2 og Smad3 i FET celler med tom vektor kontrol (CTR), Smad2 shRNA (Sh-S2) eller Smad3 shRNA (Sh-S3) blev vist i det venstre panel. Phosphorylering af Smad2 og Smad3 og ekspression af VEGFA i ovennævnte celler behandlet med 4 ng /ml TGF-beta blev vist i panelet til højre. (E) Ekspression af PKACatα i FET celler med tom vektor kontrol (CTR) eller PKACatα shRNA (Sh-PKA) blev vist i det venstre panel. VEGFA ekspression i ovennævnte celler behandlet med 4 ng /ml TGF-beta i 48 timer blev vist i højre panel.

TGF-beta signalering medieres overvejende via Smad aktivering. Imidlertid har Smad-uafhængig TGF-beta signalering også blevet rapporteret i forskellige celletyper [23], [24]. For at bestemme, om TGF-beta-medieret hæmning af VEGFA udtryk er Smad-afhængig eller -uafhængige blev Smad2 og Smad3 slået ned enkeltvis i FET celler ved shRNAs specifikke for Smad2 eller Smad3. Ekspression af Smad2 eller Smad3 blev reduceret effektivt og specifikt i Smad2 eller Smad3 knockdown celler (fig. 2D, venstre panel). Som følge heraf blev stigninger i pSmad2 eller pSmad3 upon TGF-beta behandling afskaffet i Smad2 eller Smad3 knockdown celler (fig. 2D, højre panel). Western blot-analyse viste, at inhibering af VEGFA protein ekspression ved TGF-beta delvis er vendt i Smad3 knockdown celler henviser knockdown af Smad2 havde ringe virkning (fig. 2D, højre panel). Disse resultater viser, at TGF-beta undertrykker ekspression af VEGFA i en Smad3-afhængige og Smad2-uafhængig måde. Den delvise tilbageførsel af TGF-beta-medieret undertrykkelse af VEGFA udtryk i Smad3 knockdown celler kan tilskrives ufuldstændig lyddæmpning af Smad3 til udtryk i disse celler eller eksistensen af ​​en Smad3-uafhængig mekanisme.

Som tidligere vist, TGF -beta regulerer XIAP nedregulering gennem en PKA-medieret vej [25]. Vi næste afgøres, om PKA er involveret i reguleringen af ​​VEGFA udtryk ved TGF-beta. Udtrykket af PKA katalytisk α subunit (PKACatα) blev slået ned af en specifik shRNA i FET celler (fig. 2E, venstre panel). Som et resultat blev TGF-beta-medieret inhibering af VEGFA ekspression næsten fuldstændig ophævet i disse celler (Fig. 2E, højre panel). Taget sammen med den observation, at PKA-aktivering er Smad3-afhængig [25], indikerer disse resultater, at TGF-beta /Smad3 /PKA signalering regulerer nedregulering af VEGFA ekspression i colon cancerceller.

TGF-beta-signalering inhiberer VEGFA ekspression og undertrykker tumorangiogenese in vivo

VEGFA er en vigtig regulator af blodkardannelse og spiller en vigtig rolle i angiogenese, som bidrager til tumorudvikling og progression. Vi har vist ovenfor, at TGF-beta-signalering inhiberer VEGFA ekspression (fig. 1B). Da TGF-beta fungerer som en metastase suppressor i colon cancerceller [12], undersøgte vi, om suppression af VEGFA ekspression ved TGF-beta bidrager til metastase suppression funktion af TGF-beta. Vi brugte FETα /vektor og FETα /DNRII celle model beskrevet tidligere [12] for at løse dette spørgsmål. VEGFA udtryk var meget højere i FETα /DNRII celler end i FETα /vektor celler

in vitro

grund ophævelse af TGF-beta signalering (fig. 1D). Som tidligere vist, at der forekom FETα /DNRII celler signifikant forøget metastatisk potentiale sammenlignet med FETα /vektor-celler i en ortotopisk model

in vivo

[12]. Primære tumorsnit fremstillet fra hver mus orthotopisk transplanteret med FETα /vektor eller FETα /DNRII celler blev undersøgt for TGF-beta-signalering. Da FETα celler udtrykker både Smad2 og Smad3 (data ikke vist), Smad2 phosphorylering blev anvendt som en indikator for aktiv TGF-beta /Smad2 /3 signaleringen. IHC analyser anvendelse af et anti-phospho-Smad2 (anti-pSmad2) antistof viste, at nukleare Smad2 phosphorylering blev reduceret betydeligt i de primære tumorer i FETα /DNRII celler sammenlignet med dem af FETα /vektor-celler (fig. 3A, venstre felt). Kvantificering af farvning tæthed af nukleare pSmad2 i flere prøver viste, at TGF-beta signalering blev hæmmet i tumorer i FETα /DNRII celler med ca. 40% (figur 3A, højre panel, *

P

. 0,001) . For at bestemme, om TGF-beta signalering undertrykker VEGFA udtryk

in vivo

undersøgte vi VEGFA udtryk i primære tumorer ved hjælp IHC analyser. Resultaterne viste, at VEGFA udtryk var meget højere i tumorer i FETα /DNRII celler end de af kontrol celler (fig. 3B, venstre panel). Kvantificering af farvning tæthed af VEGFA i flere prøver viste, at VEGFA ekspression blev øget med mere end to gange i disse tumorer (Fig 3B, højre panel, *

P

. 0,001), hvilket bekræfter den undertrykkende rolle TGF-beta i VEGFA udtryk

in vivo

. At afgøre, om VEGFA udtryk har nogen biologiske konsekvenser

in vivo

, vi næste analyserede mikrokardannelse inden for tumorer ved hjælp af et anti-CD31-antistof. CD31 er en markør for blodkarrenes endothelceller. I tumorer i FETα /DNRII celler, mikrokar tæthed var mere end tre gange højere end observeret i kontrolprøverne (fig 3C, *

P

. 0,001). Disse resultater indikerer, at inhibering af TGF-beta-signalering fører til forhøjet VEGFA ekspression, som bidrager til øget angiogenese. Taget sammen med resultaterne af forøget metastatisk potentiale FETα /DNRII celler i ortotopisk model, vores studier tyder på, at TGF-beta-signalering undertrykker VEGFA-medieret angiogenese og tumorprogression.

Repræsentative billeder af IHC-farvning af phospho- Smad2 (A), VEGFA (B) og CD31 (C) i de primære tumorer i FETα /vektor og FETα /DNRII celler (venstre paneler). Farvning tæthed blev målt og kvantificeres med ImagePro plus 7,0 Software hjælp 20 × eller 40 × billeder (højre paneler). Fire dyr blev analyseret for hver type celler. Femten til tyve histologisk lignende felter blev tilfældigt udvalgt fra hvert dias til analyse af farvning tæthed. Dataene er præsenteret som gennemsnit ± SE.

P

værdier blev beregnet ved hjælp af Students

t

-test. *

P

. 0,001

Angivelse af VEGFA omvendt korrelerer med TGF-beta signalering i human tyktarmskræft adenokarcinom

Ovenstående

in vitro

og

in vivo

resultater viser, at TGF-beta negativt regulerer VEGFA udtryk i humane colon cancer cellelinjer. Vi næste undersøgt, om der var nogen sammenhæng mellem TGF-beta signalering og VEGFA udtryk i humane colon adenokarcinomer. Sektioner fremstillet af 10 normal colon og 24 individuelle tyktarmskræft patienter blev undersøgt for aktiv TGF-beta signalering og VEGFA udtryk. Da Smad2 og Smad3 sjældent er muterede i tyktarmskræft [26], blev Smad2 phosphorylering anvendt i denne undersøgelse for at indikere aktiv TGF-beta /Smad2 /3 signaleringen. Normal menneskelig colon viste stærk og tydelig nukleare farvning for Smad2 phosphorylering og svag farvning for VEGFA i krypten epitelceller mens de maligne epitelceller i adenocarcinom sager vises mest svage og diffust farvning for Smad2 phosphorylering og stærk farvning for VEGFA ved IHC analyser ( fig. 4A). Figur 4B viser kvantificering af farvning tæthed af nukleare Smad2 phosphorylering og VEGFA udtryk for individuelle patientprøver. Samlet set normale colon epitelceller vise højere nukleare Smad2 phosphorylering og lavere VEGFA udtryk end adenocarcinomer, støtter det synspunkt, at ekspressionen af ​​VEGFA omvendt korrelerer med TGF-beta signalering i human colon adenocarcinom.

Sektioner fremstillet af 10 normal colon og 24 individuelle tyktarmskræft patientprøver blev farvet ved hjælp af anti-phospho-Smad2 og anti-VEGFA antistoffer. (A) Repræsentative billeder af IHC farvning af phospho-Smad2 og VEGFA i normale colon og tyktarmskræft prøver. (B) Farvning tæthed blev målt og kvantificeres med ImagePro plus 7,0 Software hjælp 40 × billeder i hver prøve. Normale kolon prøver er repræsenteret ved kvadrater og tyktarmskræft prøver ved trekanter. Søjler repræsenterer middelværdier for hver gruppe af prøver.

P

værdier blev beregnet ved hjælp af Students

t

-test. *

P

. 0,001

Diskussion

TGF-beta signalering har vist sig at undertrykke tumordannelse og metastase i en delmængde af tyktarmskræft celler gennem mange forskellige mekanismer, herunder hæmning af celledeling og induktion af apoptose [4], [12], [25], [27]. Evnen af ​​maligne celler til at modstå miljømæssige påvirkninger, især dem der er forbundet med metastaser, betragtes som en nøglefaktor i tumor udvikling og progression [28]. Eftersom miljømæssige begrænsning af vækst er meget almindeligt i faste tumorer, såsom colon carcinom, en mekanisme, der muliggør forøget angiogenese at give tilstrækkelige næringsstoffer og ilt ville være meget fordelagtigt at maligne celler og øge deres afvigende overlevelsesevne. VEGFA er en potent angiogen faktor, der spiller vigtige roller i cancer. Tumorceller hemmelige VEGFA at fremkalde vaskulatur til at udvikle, så en tilstrækkelig forsyning af ilt og næringsstoffer [14]. Derfor VEGFA kunne være et potentielt mål for cancerterapi. Vi har tidligere vist, at flugt fra TGF-beta-medieret apoptose i colon cancerceller bidrager til deres øget overlevelse kapacitet og øget metastatisk potentiale

in vivo

[12]. Vi viser her, at ud over at inducere apoptose, kan TGF-beta signalering også inhibere ekspression af VEGFA og som en konsekvens, angiogenese i coloncancer celler

in vivo

og at ophævelsen af ​​TGF-beta muliggør forøget VEGFA ekspression og angiogenese, som kan fremme tumorvækst og metastase udvikling. Endvidere er et omvendt forhold mellem TGF-beta signalering og VEGFA ekspression også observeret i humane coloncancer prøver, hvilket indikerer relevansen af ​​vores undersøgelser til human cancer. Derfor er den inhibitoriske virkning af TGF-beta på VEGFA ekspression og angiogenese giver en anden vigtig og hidtil ukendt mekanistisk basis for TGF-beta tumor og metastase suppressorfunktion.

Selvom ekspression af VEGFA kan reguleres på det transskriptionelle niveau ved HIF1α [19], dens regulering af TGF-beta er på post-transkriptionelle niveau (fig. 2A). Vores resultater viser, at TGF-beta behandling reducerede stabilitet VEGFA proteinet gennem ubiquitinering og nedbrydning (Fig 2B . 2C). Desuden TGF-beta-medieret fald i VEGFA ekspression forekommer via en PKA- og Smad3-afhængige og Smad2-uafhængige vej (Fig 2D . 2E). Det er blevet vist, at aktivering af PKA ved TGF-beta involverer Smad3 men ikke Smad2 og at PKA-aktivering fremmer proteinnedbrydning gennem ubiquitinering [25]. Derfor er det muligt, at TGF-beta medierer VEGFA nedbrydning gennem Smad3 /PKA-vejen. Dette er en hidtil ukendt mekanisme, ved hvilken ekspression af VEGFA reguleres af TGF-beta-signalering. Yderligere undersøgelser vil være nødvendige for at bestemme den underliggende mekanisme.

Høj frekvens af Smad4 mutation og inaktivering er tæt forbundet med øgede metastaser og dårlig prognose i tyktarmskræft [29], [30]. Skønt TGF-beta signalering virker som en tumorsuppressor i en undergruppe af coloncancerceller (dvs. FET, GEO og CBS, osv), som udtrykker vildtype Smad4 [4], [10], [11], Smad4-uafhængig TGF-beta signalering har vist sig at fremme tyktarmskræft metastase [31]. Det er blevet rapporteret, at TGF-beta inducerer VEGF-ekspression i Smad4-nul coloncancer-celler [32], hvilket antyder, at TGF-beta-medieret aktivering af Smad4-uafhængige veje (dvs. MEK-Erk og p38-MAPK, osv) er involveret i opreguleringen af ​​VEGF-ekspression, som kan samarbejde med andre pro-onkogene veje til at fremme metastase. Derfor kunne den modsatte virkning af TGF-beta på VEGFA ekspression bidrage til dens differential rolle som tumorsuppressor eller tumor promotor i anden celle sammenhæng.

Sammenfattende har vi identificeret en hidtil ukendt mekanisme, hvorved TGF-beta undertrykker VEGFA ekspression, angiogenese og metastase hos en delmængde af colon cancerceller.