PLoS ONE: Distinct fænotyper af menneskelig prostatacancerceller Associate med forskellige Tilpasning til Hypoxi og Pro-inflammatorisk genekspression

Abstrakte

Hypoxi og inflammation er strengt forbundet både samstemmende til prostatakræft progression. Talrige rapporter fremhæve betydningen af ​​tumorceller ved syntesen af ​​pro-inflammatoriske molekyler og viser at hypoksi kan modulere en række af disse gener, der bidrager væsentligt til stigningen af ​​cancer aggressivitet. Imidlertid vides der kun lidt om vigtigheden af ​​tumor-fænotypen i denne proces. Den foreliggende undersøgelse undersøger, hvordan forskellige funktioner, herunder differentiering og aggressivitet, af prostata tumorcellelinier indvirkning på hypoxiske omformning af pro-inflammatorisk genekspression og malignitet. Vi udførte vores undersøgelser af tre cellelinier med stigende metastatisk potentiale: den godt differentieret androgen-afhængige LNCaP og mindre differentieret og androgen-uafhængige DU145 og PC3. Vi analyserede den virkning, at hypoxiske behandling har på modulerende pro-inflammatorisk genekspression og evalueret den rolle HIF isoformer og NF-kB spille i opretholde denne proces. DU145 og PC3-celler påvist en højere normoxisk udtryk og en mere komplet hypoksisk induktion af pro-inflammatoriske molekyler sammenlignet med godt differentieret LNCaP-cellelinje. Rolle HIF1α og NF-kB, master regulatorer af hypoxi og inflammation henholdsvis opretholde hypoxisk pro-inflammatoriske fænotype var forskellig alt efter celletype. NF-kB blev observeret til at spille en hovedrolle i DU145 og PC3-celler, hvori behandling med NF-kB-inhibitor parthenolide kunne modvirke både den hypoxiske pro-inflammatorisk skift og HIF1α aktivering, men ikke i LNCaP-celler. Vores data højdepunkt, at tumor prostata-fænotype bidrager på en anden grad og med forskellige mekanismer til hypoxisk pro-inflammatoriske genekspression relateret til tumor progression

Henvisning:. Ravenna L, Principessa L, Verdina A, Salvatori L, Russo MA, Petrangeli E (2014) Særskilte fænotyper af menneskelig prostatacancerceller Associate med forskellige Tilpasning til Hypoxi og Pro-inflammatorisk genekspression. PLoS ONE 9 (5): e96250. doi: 10,1371 /journal.pone.0096250

Redaktør: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, USA

Modtaget: September 20, 2013; Accepteret: April 4, 2014; Udgivet: 6. maj 2014

Copyright: © 2014 Ravenna et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev delvist understøttet af Undervisningsministeriet University og Forskning (MIUR, COFIN 2006062242). Ingen yderligere ekstern finansiering blev modtaget til denne undersøgelse. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft udviser en heterogen cellepopulation herunder sjældne cancer stamceller (CSC) og pluripotente progenitorer (PS) er indlejret i en masse af celletyper ved forskellige grader af differentiering. Den relative overflod af CSC + Ps og differentieringen af ​​bulk-celler korrelerer med tumor malignitet [1], [2]. Men findes om virkningen af ​​den fænotype af bulk tumorceller med at tilpasse sig miljømæssige stress og især hypoxi få data. Hypoxi er en reduktion i det normale væv oxygenspænding som kan forekomme i humane patologier. Nylige undersøgelser har vist, at hypoxi fremmer en mere aggressiv metastatisk fænotype i humane cancere, såsom bryst [3], glioblastoma [4], thyroid [5], colon [6], pancreas [7], særlig prostatatumorer [8] – [10], som er associeret med en dårlig prognose. Hypoxi inducerbare faktorer (HIFs) er centrale regulatorer af transkriptionelle reaktion på hypoxisk stress [11]. De er heterodimerer dannet af en O

2 følsom α underenhed og en konstitutivt udtrykt β underenhed (HIF1β). Tre inducerbare isoformer af HIFα er til stede i pattedyr. HIF1α og HIF2α er de bedste karakteriserede og strukturelt lignende isoformer [12]. HIF3α er mere fjernt beslægtet en med talrige splejsningsvarianter [13]. I nærværelse af oxygen, HIF1α undergår proteasomalaktivitet nedbrydning. Under hypoxiske betingelser, det ophobes i cellekernerne, danner heterodimerer med HIF1β og binder hypoxi responselementer på target gen loci. Også HIF2α og HIF3α nuværende hypoxisk stabilisering og binding til HIF1β selv med forskellige kinetik. Både HIF2α og HIF3α vises udtrykt i en celle-specifik måde og spille ikke redundante roller i tilpasning til hypoxi og i hypoxisk tumorvækst og progression [14], [15]. Stigende tyder på, at den inflammatoriske mikromiljø er en yderligere medvirkende faktor, der fører til udvikling af kræft i prostata [16], [17]. Inflammatorisk gen reaktion afhænger af flere transkriptionsfaktorer, blandt hvilke NF-kB spiller en central rolle. Den klassiske form for NF-kB er heterodimer p50 /p65. Efter aktivering, NF-kB dimerer translokerer ind i kernen, hvor de kan undergå phosphorylering, binder målgener og stimulere transkription [18]. En krydstale mellem NF-kB og HIF veje er blevet dokumenteret udførligt [19] – [21]. Faktisk NF-kB underenheder p50 og p65 direkte interagere med NF-kB konsensus site på HIF1α promotoren og bidrager til basale niveauer af HIF1α mRNA og protein i visse modeller [22], [23]. På den anden side, hypoxi synes at aktivere NF-kB afhængig gentransskription [24]. Men de underliggende mekanismer forbinder hypoxi til inflammation og betændelse til tumorprogression stadig undvigende. Nylige rapporter har understreget den rolle, hypoxiske tumorceller i syntesen af ​​inflammatoriske-relaterede molekyler i bryst- [3], glioblastoma [4], thyroid [25] og prostata [26] malign cancer progression. Derudover demonstrerede de, at en koordineret pathway herunder inflammatoriske og reparative molekyler er til stede i tumorvæv i fravær af påviselig leukocyt infiltrat (CD45 +) og opreguleres i transformerede celler.

Den foreliggende undersøgelse blev udført for at analysere den relative betydning af HIF og NF-kB pathways i modulationen af ​​den hypoxiske inflammatorisk genekspression i prostata cellemodeller viser forskellige fænotyper med stigende differentiering. Afklaring af specifik inddragelse af disse to veje i intratumor heterogene celler kunne have nyttig nedfald på klinisk forskning og terapi [27]. Til dette formål har vi udført vores eksperimenter på godt differentieret, androgen-afhængige LNCaP og om de mindre differentierede, androgen-uafhængige DU145 og PC3 tumor prostata cellelinier med lav, moderat og høj metastatisk potentiale, henholdsvis [28] – [32] . Vi tog hensyn et repræsentativt sæt gener relateret til det medfødte immunreaktion stærkt involveret i prostata tumor progression, der blev vist opreguleret i tumorvæv [26], [33]. Disse omfatter: skaden receptoren for fremskreden glycosylering slutprodukter (RAGE) og purin-receptoren (P2X7R), den vaskulære epidermal vækstfaktor A (VEGF) involveret i tumorangiogenese, den inducerbare enzymer ciclo-oxygenase-2 (COX2) ansvarlig for prostaglandiner syntese, den akutte fase protein pentraxin 3 (PTX3) og CXC kemokinreceptor 4 (CXCR4) af stromal celleafledt faktor, regulator af invasiv vækst og metastase-dannelse. Desuden har vi analyseret niveauerne af hemoxygenase-1 (HO1), det hastighedsbegrænsende enzym i hæm nedbrydning, som en prototype af anti-inflammatorisk regulator [34], [35]. For at vurdere effekten af ​​NF-kB i hypoxi drevet modulation af de analyserede pro-inflammatoriske gener, vi studerede virkningerne af NF-kB inhibitor parthenolide. Bidraget fra HIF1α og den kombinerede virkning af NF-kB og HIF1α blev analyseret i androgen-uafhængige DU145 celler stabilt knockdown for HIF1α.

Materialer og metoder

cellelinjer og cellekultur

human prostatacancer-cellelinier LNCaP, DU145 og PC3 blev opnået fra American Type Culture Collection. LNCaP blev dyrket i RPM1-1640 medium, DU145 og PC3 i D-MEM-medium (Invitrogen) suppleret med 10% vol /vol føtalt bovint serum (Thermo Scientific HyClone) og 100 U /ml penicillin + 100 pg /ml streptomycin. Puromycin dihydrocloride (Sigma-Aldrich) 2 pg /ml blev altid tilsat til mediet af HIF1α Knockdown kloner. Celler blev holdt under standard normoxiske betingelser (95% luft og 5% CO

2) i en fugtig inkubator ved 37 ° C. For eksperimenter i hypoxiske betingelser blev celler podet i skåle i komplet vækstmedium med en tæthed afhængigt af længden af ​​behandling for at nå subkonfluens når analysen blev udført. På dagen for eksperimentet blev mediet erstattet med forkonditioneres hypoxiske medium og cellekulturer blev udsat for hypoxi i en forseglet modulær inkubator kammer (Billups-Rothenberg) skyllet med 1% O

2, 5% CO

2 og 94% N

2 ifølge producentens instruktioner og dyrket ved 37 ° C. Parthenolid (Sigma-Aldrich) behandlinger blev udført ved en koncentration på 5 uM i den angivne tid, altid forudgås af en 2 h forbehandling i normoxi.

Protein ekstraktion og western blot-assay

nukleare ekstrakter blev fremstillet ved en nuklear ekstrakt kit (Active Motif). I alt 5-20 ug proteiner blev opløst på Tris-HCI-polyacrylamidgeler og elektroforetisk overført til polyvinylidendifluorid-membraner (Invitrogen). Membraner blev blokeret i PBS-fedt fri mælk 5% (Bio-Rad Laboratories) i 1 time, probet med det egnede primære antistof natten over ved 4 ° C og efterfølgende inkuberet med peroxidase-konjugeret sekundære antistoffer i 1 time ved stuetemperatur. Immunkomplekser blev visualiseret under anvendelse af et forstærket kemiluminescerende kit (EuroClone). Digitale billeder af de resulterende bånd blev kvantificeret ved Mængde One-software-pakke (Bio-Rad Laboratories) og udtrykt som arbitrære densitometriske enheder

Følgende primære og sekundære antistoffer blev anvendt:. Muse-anti-HIF1α (1:500 BD Bioscience); muse anti-HIF2α og kanin-anti-P50 (1:500, 1:1000, Novus Biologicals); kanin anti-HIF3α (1:1000, Aviva Biological Systems); muse-anti-p65 (1:2000, Santa Cruz Biotechnology); kanin-anti-phospho NF-kB p65 (Ser 276) (1:1000, Cell Signaling); muse anti β-actin (1:10000, Sigma Aldrich); peberrodsperoxidasekonjugeret anti-muse og anti-kanin (1:2000, Bio-Rad Laboratories).

RNA-isolering og real-time kvantitativ polymerasekædereaktion

Totalt RNA blev ekstraheret ved Trizol-reagens og revers transkriberet under anvendelse af Superscript II revers transkriptase og tilfældige primere (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. Kvantitativ RT-PCR blev udført med ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Life Technologies). TaqMan Gene Expression Assaykits blev brugt til HIF1α, HIF2α, HIF3α, VEGF, RAGE, P2X7R, COX2, PTX3, CXCR4, HO1 og 18S rRNA (Life Technologies) med producentens standard cykelforhold. MRNA niveau af hvert gen blev kvantificeret ved hjælp af en passende standardkurve og normaliseret til husholdning gen 18S rRNA.

Stabil gen silencing

Mission shRNA Bakteriel Glycerol Stock huser sekvens verificeret shRNA lentivirus plasmidvektorer ( klonnumre TRCN0000003810 og TCRN0000010819), som udtrykker kort hårnål RNA (shRNA) rettet mod HIF1α (HIF1α shRNA), og de ikke-målrettet shRNA negativ kontrol plasmider (NTshRNA) blev købt fra Sigma-Aldrich. Bakterielle kulturer blev amplificeret og shRNA plasmider oprenset (PureLink, Invitrogen) og transficeret ind i DU145-celler. Stabile transfektioner blev udført under anvendelse af Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. Kort fortalt blev 10

6 celler podet i skåle med 6 cm i diameter. Den følgende dag blev celler transficeret med 4 ug plasmid i et medium uden antibiotika. Seks timer senere blev mediet erstattet med et standard medium og, 24 timer efter start transfektion blev cellerne trypsiniseret og podet ved forskellige fortyndinger. Efter yderligere 24 timer blev det selektive antibiotikum puromycin-hydrochlorid tilsat ved en slutkoncentration på 2 pg /ml. Ti udvalgte kolonier for hver plasmidvektor blev amplificeret og testet for HIF1α mRNA-ekspression. Kolonier med en nedsat HIF1α mRNA-niveau (-20% af gennemsnittet vægt- værdi) for lyddæmpning plasmidvektorer og en mRNA-niveau sammenligneligt med wt celler til NTshRNA plasmidvektor blev kontrolleret for HIF1α kerneprotein ved western blot, efter 4 h hypoksisk stimulation. For at reducere variabiliteten af ​​hypoxisk reaktion udførte vi vores eksperimenter på tre forskellige knockdown kloner og vi præsenterer middelværdien ± SE af resultaterne fra hver klon. For kontrol blev en blanding af tre ikke målretning plasmidvektorer transficerede kloner anvendes. NTshRNA DU145 og wt celler viste ingen signifikante forskelle i normoksiske og hypoxiske niveauer af alle de analyserede parametre. Derfor vi angiver som “vægt” middelværdien ± SE for de opnåede data både fra wt og NTshRNA DU145 celler.

Statistisk analyse

Hvert forsøg blev udført mindst tre gange og repræsentative resultater er vist. Værdier i søjlediagrammer er givet som den middel ± SE. Statistisk signifikans for enlige sammenligninger af normalfordelte data blev bestemt ved Students t-test eller ved Mann-Whitney rank sum test for data normalt ikke distribueres. Alle statistikker blev analyseret med PRISM-programmet. P-værdier mindre end 0,05 blev betragtet signifikant (* /° /# P 0,05, ** /°° /## P 0,01, *** /°°° /### P 0,001).

Resultater

Protein nukleare translokation og mRNA transskription af HIF1α HIF2α og HIF3α i hypoxiske prostatacancerceller LNCaP, DU145 og PC3

nuklear translokation er et mål for aktivering af HIF isoformer. Vi har derfor karakteriseret den nukleare udtryk profil HIF1α, HIF2α og HIF3α i tumor prostata cellelinjer LNCaP-, DU145 og PC3 følgende ilt afsavn (figur 1A). I normoxisk kontrol, HIF1α protein var målbart eller til stede på et meget lavt niveau. Én% ilt øget sin nukleare translokation i alle de undersøgte cellelinjer med lignende kinetik. Kerneakkumulation startet tidligt efter iltmangel (1 h), toppede efter 4 timer og faldt tæt på basen niveau ved 48 timer. HIF2α var til stede i kernen i alle de cellemodeller også i normoxi og dens mængde ikke syntes signifikant moduleret i nogen af ​​de undersøgte modeller. En 72 kDa nukleare HIF3α protein kunne påvises kun i normoksiske DU145 celler, hvor også blev observeret en sen induktion starter efter 24 timers stimulering. Densitometrisk analyse fremgår en maksimal stigning på 2,8 ± 0,8 folder i forhold til normoksiske celler efter 48 h ilt tilbagetrækning og en langsom tilbagegang til værdier stadig over de kontroller efter 72 timer hypoxi (data ikke vist).

Cell blev udsat til 1% O

2 fra 1 op til 48-72 timer, efter det eksperimentelle design eller venstre ubehandlet. En Proteinekspression blev påvist i kerneekstrakter ved immunoblotanalyse. Et repræsentativt eksperiment for hvert gen i hver undersøgte cellelinier er vist. β-actin blev anvendt som en loading kontrol. B mRNA bestemmelser blev udført ved real-time PCR, normaliseret til husholdning gen 18S rRNA og udtrykt som fold induktion med hensyn til normoksiske kontroller (sæt ved 1). Middelværdier ± SE.

Virkningerne af hypoxi på HIF1α, HIF2α og HIF3α mRNA niveauer i de undersøgte celle modeller er afbildet i figur 1B. HIF1α mRNA blev udtrykt i alle ustimulerede celler. I den hypoxiske miljø, HIF1α mRNA-niveau forblev uændret i 4 timer og derefter pludselig faldt til 40-50% af basisværdien og forblev stabilt lavt Til 48 h behandling. Også HIF2α mRNA blev udtrykt i alle normoxiske cellelinier og viste en sen og svag stigning kun i androgen-afhængige LNCaP efter 24 og 48 timer oxygen deprivation. HIF3α mRNA var detekterbar kun i DU145. I denne celle model, hypoxi bestemt mRNA opregulering der gik forud for stigningen i nukleare protein, der starter efter 4 timer og nåede et højdepunkt efter 48 timers stimulering (10,8 ± 1,5 gange induktion).

Alt i alt, vores data højdepunkt at HIF1α isoform, ud af de tre analyserede, er den vigtigste spiller i respons på hypoxi uanset cellefænotype. HIF3α aktivering er cellespecifik og synes ikke at være relateret til kræftcelle aggressivitet.

Hypoxi aktiverer NF-kB-vejen i DU145 og PC3, men ikke i de androgenafhængige LNCaP-celler

Vi evaluerede effekten af ​​hypoxi på NF-kB-status ved western blot-analyse, kvantificering af mængden af ​​nukleare P50 og p65-underenheder i tidsforløb eksperimenter af iltmangel. Basal NF-KB-aktivering blev observeret i alle cellelinier. Nuklear translokation af både p50 og p65 blev signifikant forøget sammenlignet med normoksiske celler i PC3 (1-4 h) og DU145 (2-4 h), mens iltmangel ikke signifikant modulerer nukleare NF-kB niveau i LNCaP-celler inden for samme tid span (figur 2).

Cell blev udsat for 1% O

2 fra 0,5 op til 24 timer eller venstre ubehandlet. Efter de angivne tidspunkter blev celler behandlet og den nukleare indhold af p50 og p65 blev påvist ved immunoblotanalyse. β-actin blev anvendt som en loading kontrol. Et repræsentativt eksperiment for hvert gen i alle de undersøgte cellelinjer er vist. Mean densitometri af NF-kB p50 og p65 i forhold til p-actin ± SE fremgår også og udtrykkes som arbitrære enheder. * Hypoxiske celler

vs

normoksiske kontrol celler.

Disse resultater dokumenterer, at hypoxi har forskellig indvirkning på NF-kB-vejen i henhold til tumor-fænotype.

hypoksisk opregulering af inflammatoriske-relaterede fænotype i prostata tumorceller

Vi derefter undersøgt den rolle, hypoxi i modulering syntesen af ​​pro-inflammatoriske molekyler i de beskrevne prostata tumorcellelinier. Til dette formål valgte vi en række repræsentative medlemmer af genfamilier involveret i inflammation og i vævsreparation overudtrykt i prostata tumor eller metastase og deres ekspression i tidsforløbet for akutte (2 og 4 timer) og kronisk (24, 48, 72 h) hypoxisk stimulering blev målt ved real time PCR.

Kvalitative og kvantitative forskelle blev observeret i bunden og i den hypoxiske induktion af de udvalgte molekyler i henhold til celle fænotype og metastatisk potentiale.

LNCaP celler var de mindre aktive producenter af de undersøgte under normoxi molekyler. Vi har ikke registrerer udskrifter for PTX3 og COX2 og alle de andre gener, bortset CXCR4, var betydeligt mindre transskriberet i forhold til androgen-uafhængige DU145 og PC3-celler (tabel 1).

Hypoxi var i stand til at inducere VEGF, RAGE, CXCR4 og HO1 men ikke P2X7R mRNA-transkription. RAGE mRNA stigning var begrænset til akut stimulation (4 h), mens mRNA-transkription af de andre gener toppede efter 24 timer iltmangel og faldt med 72 timer (figur 3A).

Celler blev eksponeret for 1% O

2 fra 2 op til 72 timer. mRNA-niveauer for VEGF, RAGE, P2X7R, PTX3, COX2, CXCR4 og HO1 blev analyseret ved real-time PCR og normaliseret til husholdning gen 18S rRNA. Graferne viser forholdet mellem ekspressionen af ​​hypoxi behandlede celler i forhold til normoksiske kontrolceller (sat til 1). Middelværdier ± SE. * Hypoxiske celler

vs

normoksiske kontrol celler.

DU145 og PC3 celler udtrykte et højere antal af de udvalgte inflammatoriske gener, som blev opreguleret i hypoxi med en mere komplet og vedvarende respons i mere aggressive PC3 celler. Især DU145 dokumenteret basale transkripter for alle de undersøgte molekyler undtagen P2X7R. I hypoxi, viste PTX3 mRNA en tidlig og tidsbegrænset stigning, mens transkriptionen af ​​VEGF, RAGE, COX2, CXCR4 og HO1 toppede efter 24 timers stimulering og faldt med 72 timer (figur 3B). PC3 celler udtrykte detekterbare basale mRNA-niveauer for alle de analyserede pro-inflammatoriske molekyler. Også i denne cellelinie PTX3 og RAGE blev maksimalt induceret af akut hypoksi efter 2 og 4 timer stimulering, hhv. Forskellige til de andre celle modeller, hypoxiske stigning af VEGF, P2X7R, COX2, CXCR4 og HO1 udtryk stadig var på sit højeste efter 48-72 h af ilt afsavn (figur 3C).

Kollektivt, de ovenstående resultater fremhæve, at ekspressionen og hypoxiske opregulering af molekyler typisk er involveret i inflammation og metastase i prostata tumor i høj grad kan variere alt efter cellefænotype.

NF-kB-inhibitor parthenolide modvirker hypoxi induceret proinflammatoriske fænotype i DU145 og PC3 i men ikke i LNCaP-celler og inducerer HO1 transkription i alle cellemodeller

den iagttagelse, at hypoksi har forskellig indvirkning på NF-kB-aktivering ifølge cellelinjen fænotype fik os til at undersøge rollen af ​​NF-kB i den hypoksiske opregulering af inflammatoriske-relaterede fænotype i alle de prostata celler ved anvendelse af den naturlige NF-kB-inhibitor parthenolide. I figurerne 4A, 4B og 4C virkningerne af 5 uM parthenolid på ekspressionen af ​​hypoxi modulerede proinflammatoriske gener i LNCaP henholdsvis DU145 og PC3-celler er afbildet både i hypoxisk og normoxiske betingelser. For hvert gen, præsenterer vi de data, der indsamles på punkt, hvor hypoxi udøvede sin maksimale stigning i transkription, som vist i figur 3A, 3B og 3C. Parthenolid betydeligt modvirket hypoxi induceret opregulering af de fleste af disse gener i DU145 og i PC3-celler undtagen P2X7R og CXCR4 i PC3-celler. Tværtimod har stoffet ikke nogen signifikant effekt på ekspressionen af ​​hypoxi induceret molekyler i mindre aggressive LNCaP celler.

LNCaP (A), PC3 (B), DU145 (C) celler blev holdt i normoxi og eksponeret for 1% O

2 i nærvær og fravær af 5 uM parthenolide. mRNA-niveauer for VEGF, RAGE, P2X7R, PTX3, COX2, CXCR4 og HO1 blev analyseret ved realtids-PCR, normaliseret til husholdning gen 18S rRNA og udtrykt som gange induktion i forhold til den normoxiske ubehandlede kontrol (sat til 1). For hvert gen præsenterer vi effekten af ​​parthenolide på tidspunkter, hvor hypoxi udøves en maksimal stigning på transskription. * Hypoxiske parthenolide behandlede celler

vs

hypoxiske celler. C: kontrol normoksiske ubehandlede celler. P: normoxisk parthenolide behandlede celler. H: hypoksiske celler. HP:. Parthenolide behandlet hypoxiske celler

Virkningen af ​​parthenolide i modulation af HO1, et vigtigt enzym i modvirke inflammatorisk skade, var helt anderledes (figur 5). Parthenolide var i stand til precociously og stærkt fremkalde HO1 i alle normoxiske og hypoxiske prostata tumorceller med en maksimal effekt efter 4 timer stimulering. Denne effekt gradvist faldet, men stadig var til stede efter 24 timers behandling i LNCaP og DU145 og efter 48 h i PC3 celler. På disse tidspunkter virkningen af ​​parthenolid og hypoxi på HO1 ekspression var additive.

LNCaP, PC3 og DU145-celler blev holdt i normoxi og eksponeret for 1% O

2 i nærvær og fravær af 5 uM parthenolide. mRNA niveauer for HO1 blev analyseret ved realtids-PCR, normaliseret til husholdning gen 18S rRNA og udtrykt som gange induktion i forhold til den normoxiske ubehandlede kontrol (sat til 1). Vi viser virkningen af ​​parthenolid efter 4 h behandling, når lægemidlet maksimalt opreguleret HO1 ekspression i normoxiske kulturer og efter 24 timer (LNCaP, DU145) og 48 timer (PC3) stimulering når hypoksi udøvede en maksimal stigning på dens transkription. Middelværdier ± SE. * Normoksiske og hypoxiske parthenolide behandlede celler

vs

normoksiske kontrol celler. C: kontrol normoksiske ubehandlede celler. P: normoxisk parthenolide behandlede celler. H: hypoksiske celler. HP: parthenolide behandlet hypoxiske celler

Disse resultater viser, at NF-kB spiller en central rolle i at flytte mere aggressive DU145 og PC3 men ikke LNCaP hypoxisk prostata tumorceller mod en pro-inflammatorisk, mere ondartet. fænotype. Endvidere i alle cellelinjer, vises NF-kB, at være involveret i en hypoxi-uafhængig hæmning af den anti-inflammatoriske gen HO1.

parthenolide påvirker HIF1α og HIF3α hypoxi afhængig aktivering i DU145 og PC3 cellelinjer

Styringen af ​​HIFs og især HIF1α aktivering af NF-kB er et spørgsmål om forhandling. Vi testede, om parthenolide haft nogen indvirkning på den nukleare ophobning af HIF1α efter 4 timer hypoxisk stimulation, der inducerede det højeste niveau af nuklear translokation i vores eksperimentelle betingelser. Figur 6A viser, at NF-kB-inhibitor parthenolide faldt betydeligt HIF1α protein cellekerneakkumulering i DU145 og PC3 celle (-30%, P 0,05). Interessant nok blev HIF1α nuklear niveau påvirkes ikke af NF-KB-inhibering kun i LNCaP-celler, som ikke udviser en signifikant NF-KB-aktivering i hypoxi.

A LNCaP, DU145 og PC3-celler blev holdt i normoxi og udsættes for 1% O

2 i 4 timer i nærvær og fravær af 5 uM parthenolide. HIF1α blev målt i den nukleare fraktion ved immunoblotanalyse. β-actin blev anvendt som en loading kontrol. For hvert gen er vist et repræsentativt eksperiment. Mean densitometri af HIF1α forhold til p-actin fremgår også og udtrykkes som arbitrære enheder. B DU145-celler blev inkuberet under normoxiske eller hypoxiske betingelser i 48 timer i nærvær og fravær af 5 uM parthenolide. HIF3α blev målt i den nukleare fraktion ved immunoblotanalyse. β-actin blev anvendt som en loading kontrol. For hvert gen er vist et repræsentativt eksperiment. Mean densitometri af HIF3α forhold til p-actin fremgår også og udtrykkes som arbitrære enheder. Middelværdier ± SE. C: kontrol normoksiske ubehandlede celler. P: normoxisk parthenolide behandlede celler. H: hypoksiske celler. HP: parthenolid behandlet hypoxiske celler. * Hypoxiske parthenolide behandlede celler

vs

hypoxiske celler.

Som beskrevet i figur 1A, HIF3α forordning var celle specifikke og dens udtryk var begrænset til DU145 celler blandt prostata tumor-modeller undersøgt. Vi undersøgte, om NF-kB spillede en rolle i den hypoxi-afhængig aktivering af HIF3α og vi observeret, at parthenolid faldt betydeligt HIF3α nuklear niveau efter 48 timer hypoksisk stimulation (-65%, P 0,01). (Figur 6B)

alt i alt, disse data understrege, at parthenolide kan påvirke hypoxisk HIF1α aktivering kun tumorcellerne, hvor NF-kB er lydhør over for ilt afsavn. En inhibitorisk effekt af parthenolid observeres også på HIF3α.

rolle HIF1α i remodellering af pro-inflammatoriske fænotype i DU145-celler. Kombineret virkning af HIF1α knockdown og parthenolide

Til forskel fra LNCaP, i mindre differentierede DU145 og PC3 celler, NF-kB-vejen var dybt involveret i ombygning af pro-inflammatoriske fænotype under hypoxi. At definere bidrag HIF1α i denne proces, vi skabt en stabil HIF1α knockdown kloner (HIF1α shRNA) fra DU145 celler. Figur 7A viser den nukleare HIF1α protein i vægt, i NTshRNA vektor transficerede celler og i en repræsentativ HIF1α shRNA transfekteret klon ud af tre er valgt til forsøgene, efter 4 h oxygen deprivation. Den meget lave niveau af nuklear protein i HIF1α Knockdown celler stammer fra 87% ± 1 gennemsnitlig dråbe HIF1α mRNA (data ikke vist). Som for vildtypeceller, vi kendetegnet NTshRNA og HIF1α shRNA kloner i normoxi og hypoxi til mRNA og kerneprotein niveau af HIF2α og HIF3α og for NF-kB-status. HIF1α Knockdown celler bekræftede HIF2α passivitet til hypoxiske behandling i vore eksperimentelle betingelser (data ikke vist). Både HIF3α mRNA og protein blev induceret ved vedvarende hypoxi i langt mindre grad end i wt celler (figur 7B, 7C). Desuden har parthenolide ikke signifikant indflydelse HIF3α nukleare protein niveau efter 48 h hypoxisk stimulation (Figur 7C). Også i HIF1α Knockdown celler hypoxi forøgede aktiviteten af ​​NF-kB som vist ved den forøgede nukleare niveau af p50 og p65 i 1% oxygen (fig 7D), selv om aktiveringstiden var kortere end i wt celler.

En Vild type, NTshRNA og HIF1α shRNA transficerede DU145 celler blev holdt i normoxi og under hypoxi (1% O

2) i 4 timer. HIF1α blev målt i den nukleare fraktion ved immunoblotanalyse. β-actin blev anvendt som en loading kontrol. C: kontrol normoksiske ubehandlede celler. H: hypoksiske celler. B vildtype og HIF1α shRNA celler blev holdt i normoxi og under hypoxi i 24, 48 og 72 timer. mRNA niveau HIF3α blev analyseret ved real-time PCR og normaliseret til husholdning gen 18S rRNA. Grafen viser forholdet mellem ekspression i hypoxi behandlede celler i forhold til normoxiske kontrol cellekulturer (sat til 1). Middelværdier ± SE. C vildtype og HIF1α shRNA celler blev holdt i normoxi og under hypoxi i 48 timer i nærvær og fravær af 5 uM parthenolide. Indholdet af HIF3α kerneprotein blev påvist ved immunoblotanalyse. β-actin blev anvendt som en loading kontrol. C: kontrol normoksiske ubehandlede celler. P: normoxisk parthenolide behandlede celler. H: hypoksiske celler. HP: parthenolid behandlet hypoxiske celler. D HIF1α shRNA celler blev holdt i normoxi og under hypoxi i 1, 2 og 4 timer. Den nukleare indhold p50 og p65 blev påvist ved immunoblotanalyse. β-actin blev anvendt som en loading kontrol. Densitometrisk analyse af p50 og p65 i forhold til p-actin blev udtrykt som arbitrære enheder og vist som fold induktion med hensyn til normoxiske kontrol cellekulturer (sat til 1). Middelværdier ± SE. * Hypoxic HIF1α shRNA celler

vs

HIF1α shRNA normoxisk kontrol.

Vi målte derefter udtryk for de udvalgte inflammatoriske gener i tid-kursus eksperimenter af akut (2, 4 timer ) og kronisk (24, 48, 72 h) hypoksisk stimulation i fravær og nærvær af 5 pM parthenolide. Som forventet havde NTshRNA celler ikke signifikant forskellige fra wt celler i alle de analyserede parametre (data ikke vist). Derfor samles vi de opnåede data både i vægt og i NTshRNA DU145 celler. Resultater på HIF1α shRNA celler var ganske anderledes. Vi sammenlignede deres værdier med dem opnået i wt celler ved at udtrykke mRNA-niveauerne af hvert gen i HIF1α shRNA celler som gange induktion i forhold til middelværdien normoxisk niveau observeret i wt celler, der blev fastsat til 1. Figur 8A opsummerer vores resultater for VEGF, RAGE, PTX3, COX2 og CXCR4 genekspression på tidspunkter, hvor hypoxi udøves sin maksimale stigning i transskription (2 timer for PTX3, 48 h for VEGF, COX2 og CXCR4). Normoxisk VEGF og PTX3 RNA-værdier var signifikant lavere i knockdown sammenlignet med wt celler, hvilket bekræfter en rolle for HIF1α i deres basale ekspression. Hypoxi markant opreguleres VEGF, COX2 og CXCR4 udtryk for niveau, der svarer til dem, der observeres i wt celler. PTX3 blev også induceret af hypoxia, men i mindre grad i forhold til WT celler. Ingen hypoxisk induktion af RAGE ekspression blev observeret. Fem uM parthenolid betydeligt modvirket opregulering af VEGF, PTX3, COX2 og CXCR4 gener i et tilsvarende omfang til hvad der blev observeret i wt celler.