PLoS ONE: In vivo Near-Infrared Fluorescence Imaging af Apoptose Brug histon H1-Targeting peptid Probe efter Anti-Cancer Behandling med cisplatin og Cetuximab for tidlig afgørelse om tumorrespons

Abstrakte

Tidlig beslutning om tumor respons efter anti-cancer behandling er stadig et udækket medicinsk behov. Her undersøgte vi, om

in vivo

billeddannelse af apoptose ved lineær og cyklisk (disulfidbundet) form af ApoPep-1, et peptid, der genkender histon H1 eksponeret på apoptotiske celler, på et tidligt tidspunkt efter behandling kunne forudsige tumor respons på behandlingen senere. Behandling af mave tumorceller med cistplatin eller cetuximab alene induceret apoptose, mens kombinationen af ​​cisplatin plus cetuximab mere effektivt induceret apoptose, som detekteret ved binding med lineære og cykliske form af ApoPep-1. Forskellene mellem enkelt middel og kombinationsbehandling var mere bemærkelsesværdig som detekteret med cykliske form i forhold til den lineære form. I tumorbærende mus, blev apoptose billeddannelse udført 1 uge og 2 uger efter påbegyndelse af behandlingen, mens tumorvolumener og vægte blev målt 3 uger efter behandlingen.

In vivo

fluorescens billeddannelse signaler opnået ved optagelsen af ​​ApoPep-1 til tumor var mest bemærkelsesværdige i den gruppe, injiceret med cyklisk form for ApoPep-1 ved 1 uge efter kombineret behandling med cisplatin plus cetuximab. Korrelation analyse afslørede, at billeddiagnostiske signaler ved cyklisk ApoPep-1 ved 1 uge efter behandling med cisplatin plus cetuximab i kombination blev mest tæt forbundet med ændringer tumor volumen (r

2 = 0,934). Disse resultater viser, at

in vivo

apoptose imaging hjælp Apopep-1, især cyklisk ApoPep-1, er et følsomt og intelligent værktøj til tidlig afgørelse på maven tumor respons efter anti-cancer behandling.

Henvisning: Jung HK, Wang K, Jung MK, Kim IS, Lee BH (2014)

In Vivo

Near-Infrared Fluorescence Imaging af Apoptose Brug histon H1-Targeting peptid Probe efter Anti-Cancer Behandling med cisplatin og Cetuximab for tidlig afgørelse om tumorrespons. PLoS ONE 9 (6): e100341. doi: 10,1371 /journal.pone.0100341

Redaktør: Subhash Gautam, Henry Ford Health System, USA

Modtaget: April 2, 2014 Accepteret: 23. maj 2014 Udgivet: 20 Jun 2014

Copyright: © 2014 Jung et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle data er inkluderet i manuskriptet

Finansiering: Denne undersøgelse blev støttet af en bevilling fra nationale F D Program for Cancer Control Sundhedsministeriet . Velfærd, Republikken Korea (0.720.550 til 2 til Byung-Heon Lee) og et tilskud NRF-2012M2A2A7035589 (til Byung-Heon Lee) gennem Grundforskningsfonden Korea. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft er den anden hyppigste årsag til kræft død på verdensplan [1]. Single-agent kemoterapi for avanceret mavekræft omfatter capecitabin eller 5-fluorouracil, mens kombinationsterapi inkluderer cisplatin plus 5-fluorouracil eller cisplatin plus capecitabin [2]. Desværre har mavekræft vist lav ansvar for kemoterapi. Svarprocenten af ​​avancerede mavekræft varierer fra 10-30% til enkelt-agent terapi og 30-60% til kombineret kemoterapi [2]. Desuden molekylær målrettede lægemidler, såsom cetuximab (anti-epidermal vækstfaktor receptorantistof) og trastuzumab (anti-Her2-receptor-antistof) er blevet anvendt i kombination med kemoterapi, hvilket resulterer i forskellige responsrater [3] – [5]. I lyset af disse lave svarprocenter, overvågning og tidlig afgørelse af mave tumor respons efter behandling med anti-cancer medicin er derfor meget vigtigt i forvaltningen af ​​cancerbehandling.

Traditionelt beslutning om tumor respons er udført ved måling af ændringer i tumorstørrelse hjælp computertomografi (CT). En sådan tumorstørrelse baseret afgørelse om tumorrespons er imidlertid normalt muligt til to måneder efter påbegyndelse af behandlingen. I henhold til retningslinjerne af respons evalueringskriterier i faste tumorer (RECIST), når der er mindst 30% reduktion i tumorstørrelse er behandlingen betragtes som en delvis reaktion, mens når der er en 20% eller større stigning i tumorstørrelse, det er defineret som en progressiv sygdom [6]. For at reducere forbrugende af tid og omkostninger for en anti-tumor terapi, er det nødvendigt at gøre go /no-go beslutning om behandlingen tidligere end den nuværende metode baseret på tumorstørrelse måling ved CT.

Måling optagelsen af ​​

18F-fluorodeoxyglukose (

18F-FDG) ved tumor hjælp positron emission tomografi (PET) scanning har gjort det muligt for os at foretage en tidligere beslutning om tumor respons efter, at anti-tumor terapi end størrelse-baserede CT-scanning.

18F-FDG optagelse af tumorvæv er faldet med reduktionen i stofskiftet og byrden af ​​tumorceller efter kemoterapi. Imidlertid er det kendt, at optagelsen af ​​

18F-FDG afhænger primært af histopatologiske typer af mavekræft. For eksempel Signet-ring celle karcinom og mucinøs adenocarcinom optagelse

18F-FDG på et lavt niveau på grund af lave niveauer af GLUT-1 transporteren [7], [8]. Disse funktioner gør beslutning om mavekræft svar fra

18F-FDG optagelse begrænset. Desuden er nogle typer af tumor, som brystkræft, viser metabolisk flare, en midlertidig forhøjelse af

18F-FDG optagelse efter kemoterapi, som er vanskeligt at skelne det fra tumor tilbagefald [9].

når tumorceller behandles med kemoterapi og molekylære målrettede lægemidler, de generelt dø af apoptose [10] – [12]. Apoptotisk celledød synes at forekomme før anatomisk ændring eller reduktion i tumorstørrelse [13], [14]. I denne hilsen, ville billeddannelse af apoptose giver os mulighed for at afgøre, om tumor er lydhøre over for en behandling på et tidligere tidspunkt, end billeddannelse af neddeling. Endvidere apoptose direkte repræsenterer tumorcelledød, medens

18F-FDG-optagelse repræsenterer tumor metabolisme og dermed indirekte betegner tumor celledød. Apoptotiske celler sætte underskrifter eller biomarkører på deres overflade, såsom phosphatidylserin og histon H1, der er ringe eller fraværende på overfladen af ​​sunde celler [15] – [17]. Apoptose billeddannende prober såsom annexin V og dipicoyl zink amid, som binder til phosphatidylserin er blevet udnyttet til overvågning tumorcelle apoptose

in vivo

[15] – [17].

Vi har tidligere identificeret ApoPep -1, som genkendte apoptotiske og nekrotiske celler gennem binding til histon H1 på overfladen af ​​apoptotiske celler og i kernen af ​​nekrotiske celler, henholdsvis [18]. ApoPep-1 er blevet vist at akkumuleres ved tumor efter behandling med doxorubicin [18]. Det har også været anvendt til afbildning af myocardial celledød på et tidligt tidspunkt efter myokardieinfarkt for vurderingen af ​​den langsigtede hjertefunktion [19]. Til terapeutiske formål har ApoPep-1 blevet anvendt som en målsøgende del, der kan forbedre lægemiddel og T-celle levering til tumoren efter induktion af apoptose med kemoterapi [20], [21]. I denne undersøgelse har vi undersøgt, om

in vivo

billeddannende signaler af apoptose opnået ved optagelsen af ​​lineære og cykliske (disulfidbundet) form af ApoPep-1 på et tidligt tidspunkt efter behandling er korreleret med ændringer i tumorvolumen senere og er i stand til at gøre en tidlig beslutning om tumorrespons muligt.

Materialer og metoder

Syntese og fluorescens mærkning af peptider

Lineær (CQRPPR) eller cyklisk (CQRPPRC, ringslutning via disulfidbinding ved amino- og carboxyterminale ender) form af ApoPep-1-peptider blev syntetiseret og oprenset ved anvendelse af højtydende væskekromatografi (HPLC) til . 90% renhed ved Peptron Inc. (Daejeon, Sydkorea). Peptider blev mærket med FPR675 nær-infrarødt (NIR) fluorescens farvestof (Bioacts Inc., Incheon, Korea.)

In vitro binding af peptider til apoptotiske celler

SNU16 human mavekræft cellelinje var købt fra KCLB (Seoul, Korea). For at inducere apoptose blev celler behandlet med cisplatin (300 ng /ml), cetuximab (200 ug /ml), og cisplatin (300 ng /ml) plus cetuximab (200 ug /ml) i kombination i 24 timer. Koncentrationerne af cisplatin og cetuximab blev valgt ifølge de foregående rapporter [22], [23]. Efter behandling blev cellerne inkuberet med 10 pM af fluoresceinisothiocyanat (FITC) -konjugeret lineær eller cyklisk form af ApoPep-1 ved 4 ° C i 1 time. Som kontrol blev celler farvet med Alexa488-konjugeret annexin V (Life Technologies, Carlsbad, CA) i 15 minutter ved stuetemperatur. Procenter af fluorescerende (peptid-bundne eller annexin V-bundet) celler blev målt ved flowcytometri.

Anti-tumor behandling af mus og tumorstørrelse måling

Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med institutionelle retningslinjer og i henhold til dyret protokol godkendt af retningslinje af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) af Kyungpook National University (tilladelse nr KNU 2012-15).

Otte uger gamle kvindelige athymiske (

nu /nu

) Balb /c mus blev købt fra Orient laboratorier (Seongnam, Sydkorea) og blev opstaldet under specifik-patogenfrie betingelser med laboratorie chow og vand

ad libitum

. Mave tumorxenografter blev oprettet ved subkutan injektion 1 x 10

7 SNU-16 celler i 100 pi saltvand ind i højre flanke. Tumorer fik lov til at nå 50-60 mm

3 af volumen før randomisering og påbegyndelse af behandling. Behandling af tumor-bærende mus med cisplatin og cetuximab blev udført i overensstemmelse med en tidligere beskrevet protokol [24]. Musene blev inddelt i fire behandlingsgrupper (

n

= 6 pr gruppe) og behandles i to uger: 1) saltvand kontrol; 2) cisplatin (5 mg /kg, intraperitonealt (i.p.) injektion en gang om ugen for alt to injektioner); 3) cetuximab (1,5 mg /kg, i.p., to gange om ugen i alt fire injektioner); 4) cisplatin (5 mg /kg, i.p., en gang om ugen for alt to injektioner) plus cetuximab (1,5 mg /kg, i.p., to gange om ugen i alt fire injektioner). En runde af behandling indbefatter injektion af cisplatin på dag 1 pr uge og cetuximab på dag 1 og dag 4 per uge. Ændringer i tumorstørrelse blev målt over tre uger. Diametre tumor blev målt med automatisk skydelære. Tumorvolumener blev beregnet ved anvendelse af formlen: volumen = (længde x bredde x højde) /2, hvor længde, bredde og højde betyder den længste dimension, kortere dimension parallelt til muse krop, og diameteren af ​​tumor vinkelret på længden og bredden , henholdsvis. Tumor vægte blev målt efter isolering af tumor masse.

In vivo

NIR fluorescens billeddannelse af tumor apoptose

In vivo

NIR fluorescens billeddannelse blev udført efter den første og anden runde af behandlingen. Hver behandlingsgruppe (

n

= 6) blev opdelt i to undergrupper (

n

= 3) til billeddannelse med lineær og cyklisk form af ApoPep-1 hhv. Lineære og cykliske form af FPR675-mærket ApoPep-1 (1,45 mg /kg og 1,54 mg /kg, svarende til en 800 nmol /kg af hvert peptid) blev injiceret gennem halevenen i mus. Ved 90 min efter indgivelse blev musene bedøvet og underkastet billeddannelse. NIR fluorescens (typisk mellem 650 og 1100 nm) er foretrukket for

in vivo

optisk billeddannelse på grund af sin lave væv absorption og dybe væv penetration egenskaber [25]. Excitation /emission bølgelængden af ​​FPR675 farvestof anvendt i denne undersøgelse var 675/698 nm. Billeder blev taget ved hjælp af Udforsk Optix optiske billeddannende system (ART Inc., Montreal, Canada). Denne tidsdomæne tomografi systemet har vist sig at være mere følsomme med højere påvisning dybde og rumlig opløsning end en kontinuerlig bølge plan imaging system [26]. Købet tid til en hel-kropsscanning var 15 min per mus. Fluorescens intensitet på område af interesse (ROI) blev målt ved hjælp af en analyse software, der leveres af fabrikanten (ART Inc.).

Histologisk analyse af apoptose

Efter

in vivo

billeddannelse blev musene aflivet, og tumorerne blev fjernet og frosset hurtigt i OCT indlejringsmedium (Sakura Finetechnical, Tokyo, Japan). Væv blev skåret i 6 um snit og farvet med DAPI (4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol) til nucleus kontrastfarvning. Terminal deoxy-nukleotidyltransferase-medieret dUTP nick-end mærkning (TUNEL) farvning blev udført ved hjælp Apoptag Red In Situ Apoptose Detection kit ifølge instruktionerne fra producenten (Millipore, Billerica, MA). Vævssnit blev observeret under et fluorescensmikroskop (Carl Zeiss, Jena, Tyskland).

Korrelationsanalyse mellem fluorescensintensitet og tumorvolumen

Ved 3 uger efter behandling (endepunkt af forsøg), tumorvolumener blev målt og tumorer blev isoleret for vægten måling. Korrelationen mellem NIR fluorescensintensitet og tumorvolumen blev bedømt ved den lineære regressionsanalyse ved anvendelse af Graphpad software.

Stabilitet af peptider i serum

Peptide stabilitet i serum blev undersøgt som tidligere beskrevet [ ,,,0],27]. Blod fra mus blev opsamlet og fik lov til at størkne, og derefter blev serum opnået ved centrifugering ved 4 ° C to gange efterfulgt af filtrering (0,22 um pore). Peptid (100 ug i 50 pi PBS) blev inkuberet med 50 pi filtreret serum ved 37 ° C i den angivne tidsperiode. De inkuberede prøver blev fortyndet 100 gange og fraktioneret ved C18 omvendt fase FPLC med lineær gradient af acetonitril (Vydac protein og peptid C18, 0,1% trifluoracetat i vand til ækvilibrering, og 0,1% trifluoracetat i acetonitril til eluering). For at bekræfte identiteten af ​​toppen fra profilerne for C18 omvendt fase FPLC, blev hver top opsamlet, vakuumtørret og analyseret ved massespektrometri (MS) under anvendelse af et MALDI-TOF massespektrometer (Life Technologies, Carlsbad, CA).

statistisk analyse

Den statistiske signifikans af forskelle mellem forsøgs- og kontrolgrupper blev analyseret ved hjælp af envejs variansanalyse (ANOVA).

Resultater

In vitro

påvisning af apoptose af mave tumorceller ved hjælp ApoPep-1 efter behandling med cisplatin og cetuximab

for at undersøge påvisning af apoptose ved ApoPep-1 blev mave tumorceller behandlet med cisplatin, cetuximab, og cisplatin plus cetuximab og derefter inkuberet med lineær og cyklisk form af ApoPep-1. Cyklisk form af ApoPep-1 (CQRPPRC) blev fremstillet ved tilsætning af cystein rest ved carboxyterminalen af ​​lineær form af ApoPep-1 (CQRPPR) og ringslutning gennem disulfidbinding. Procentdelene af apoptotiske celler detekteres af den lineære form af ApoPep-1 var ca. 28%, 25% og 34% efter behandling med cisplatin, cetuximab, og cisplatin plus cetuximab henholdsvis (figur 1A). Procentdelen af ​​apoptotiske celler detekteret af den cykliske form af ApoPep-1 var ca. 56%, 49%, og 78% efter behandling med cisplatin, cetuximab og cisplatin plus cetuximab henholdsvis (figur 1B). Procentdelene af apoptotiske celler påvises ved annexin V var ca. 43%, 40% og 45% efter behandling med cisplatin, cetuximab, og cisplatin plus cetuximab henholdsvis (figur 1C). Disse resultater viser, at den kombinerede behandling af cisplatin og cetuximab inducerer apoptose af maven tumorceller på højere niveauer end behandling af cisplatin eller cetuximab alene gør. Også disse resultater antyder, at den cykliske form af ApoPep-1 mere følsomt detekterer apoptose af maven tumorceller end den lineære form af ApoPep-1 eller annexin V betyder.

Celler blev inkuberet med cisplatin (300 ng /ml ), cetuximab (200 ug /ml), og cisplatin (300 ng /ml) plus cetuximab (200 ug /ml) i kombination i 24 timer. Celler blev høstet og inkuberet med FITC-mærket ApoPep-1 ved 4 ° C i 1 time eller med annexin V ved stuetemperatur i 15 minutter. Data repræsenterer procentdele af apoptotiske celler som målt ved flowcytometri. (A-C) Procent af apoptotiske celler påvises ved lineær form for ApoPep-1, cyklisk form af ApoPep-1, og annexin V hhv. PBS, phosphatpufret saltvand; CPT, cisplatin; CET, cetuximab; CPT + CET, cisplatin plus cetuximab.

In vivo

billeddannelse af apoptose af mave tumor ved hjælp ApoPep-1 som respons på cisplatin og cetuximab

For at undersøge

in vivo

detektion og billeddannelse af apoptose af mave tumor under anvendelse ApoPep-1 målte vi fluorescensintensiteten ved tumor ved akkumulering af NIR fluorescens farvestof mærkede ApoPep-1 til tumorvæv efter første og anden runde af behandling (svarende til en uge og to uger efter påbegyndelse af behandlingen, henholdsvis). Kvantificering af fluorescensintensiteten ved tumorstedet af enten lineær eller cyklisk form af ApoPep-1showed at intensiteterne var signifikant højere i grupperne behandlet med cisplatin, cetuximab, og cisplatin plus cetuximab, sammenlignet med ubehandlede kontrolgruppe, efter den første eller anden runde af behandling (figur 2A, 2B). Fluorescensintensiteter ved lineær ApoPep-1 var højere i gruppen behandlet med cisplatin plus cetuximab i forhold til gruppen behandlet med cisplatin alene (

s

0,05 og

s

0,05 efter den første og anden runde af behandling henholdsvis figur 2A) og cetuximab alene (

s Restaurant 0,01 og ikke signifikant efter den første og anden runde af behandling henholdsvis figur 2A). Især fluorescensintensiteter på tumorsted ved cyklisk ApoPep-1 var bemærkelsesværdigt højere i gruppen behandlet med cisplatin plus cetuximab i forhold til gruppen behandlet med cisplatin alene (

s

0,01 og

s

0,01 efter første og anden runde af behandling henholdsvis figur 2B) og cetuximab alene (

s

0,001 og

s

0,01 efter første og anden runde af behandling henholdsvis figur 2B). Repræsentative hele kroppen fluorescensbilleder ved lineær og cyklisk form af ApoPep-1 blev vist (figur 2C, 2D, henholdsvis). Lidt baggrund fluorescenssignaler blev observeret i andre organer, herunder lever og lunge (figur 2C, 2D).

SNU-16 mave tumor-bærende mus blev behandlet med cisplatin, cetuximab, og cisplatin plus cetuximab. Efter den første og anden runde af behandling, lineær eller cyklisk form af FPR675 NIR fluorescensmåling farvestof-mærkede ApoPep-1 blev intravenøst ​​injiceret i mus.

In vivo

NIR fluorescens billeder blev taget ved 90 min efter administration. (A) (B) Kvantificering af NIR fluorescenssignal intensitet regionen af ​​interesse (ROI) i grupper injiceret med lineære og cykliske ApoPep-1. Søjler repræsenterer signalintensiteten ved ROI opnået fra tre individuelle mus (middelværdi ± S.D.). Asterisker repræsenterer statistisk signifikans sammenlignet med PBS. Stjerner på parentes er signifikans i forskellen mellem de to grupper. *

s

0,05, **

s

0,01, og ***

s

0,001 ved envejs ANOVA (

n

= 3 per gruppe). (C) (D) repræsentant NIR fluorescensbilleder ved optagelsen af ​​lineære og cykliske ApoPep-1 til tumoren blev vist. Scale søjler repræsenterer normaliseret fluorescens-intensitet. Cirkler repræsenterer ROI.

Måling af tumor volumen og vægt efter anti-tumor behandling med cisplatin og cetuximab

For at undersøge anti-tumorvækst effekt af cisplatin eller cetuximab alene og i kombination , tumorvolumener og vægte efter behandling blev målt. Behandling med cisplatin, cetuximab og cisplatin plus Cetuximabs reduceret tumor volumen, sammenlignet med ubehandlede kontrol, i det lineære ApoPep-1 gruppe (

s

0,05,

s

0,05, og

s

0,001 henholdsvis Figur 3 A) og i den cykliske ApoPep-1 gruppe (

s

0,05,

s

0,01 og

s

0,001 henholdsvis figur 3B). Kombineret behandling af cisplatin og cetuximab mere effektivt reduceret tumor volumen, sammenlignet med behandling med cisplatin eller cetuximab alene, i den lineære ApoPep-1 gruppe (

s

0,05 og

s

0,05 henholdsvis Figur 3 A) og i den cykliske ApoPep-1 gruppe (

s

0,01 og

s

. 0,01, henholdsvis figur 3B)

SNU-16 mave tumorbærende mus, som blev analyseret for billeddannende signaler efter første og anden runde af behandling blev opretholdt for måling af tumorstørrelse. (A) (B) Måling af tumorvolumener ved 3 uger efter behandling. (C) (D) Måling af vægte af isolerede tumor masse på 3 uger efter behandlingen.

* p

0,05, **

s

0,01, og ***

s

0,001 ved envejs ANOVA. Pile repræsenterer tidspunkterne behandling. Asterisker repræsenterer statistisk signifikans sammenlignet med PBS. Stjerner på parentes er signifikans i forskellen mellem de to grupper. (E) TUNEL farvning af tumorvæv. Grøn, apoptotiske celler; Blå, nucleus. PBS, phosphatpufret saltvand; CPT, cisplatin; CET, cetuximab; CPT + CET, cisplatin plus cetuximab. Scale søjler repræsenterer 50 um.

Lignende mønster af ændringer i tumor vægte efter behandling med cisplatin, cetuximab og cisplatin plus cetuximab i forhold til ubehandlede kontrol blev observeret i den lineære ApoPep-1 gruppe (

p

0,01,

s

0,01 og

s

0,001 henholdsvis figur 3C) og i den cykliske ApoPep-1 gruppe (

p

0,01,

s

0,01 og

s

0,001 henholdsvis figur 3D). Behandling med cisplatin plus cetuximab mere effektivt reduceret tumor vægte, sammenlignet med behandling med cisplatin eller cetuximab alene, i den lineære ApoPep-1 gruppe (

s

0,05 og

s

0,05, henholdsvis figur 3C) og i den cykliske ApoPep-1 gruppe (

s

0,01 og

s

0,01, henholdsvis figur 3D). Niveauerne af reduktion i tumor volumen og vægt efter behandlingen mellem grupperne injiceret med lineær og cyklisk form af ApoPep-1 var ens, og der var ingen forskel i tumor volumen mellem disse to grupper på tidspunktet for billeddannelse. Højere niveauer af apoptose efter behandling med cisplatin plus cetuximab i kombination sammenlignet med cisplatin eller cetuximab alene, blev yderligere demonstreret ved TUNEL farvning af tumorvæv (figur 3E).

Sammenhæng mellem fluorescensintensitet og tumor volumen

Vi undersøgte sammenhængen mellem fluorescensintensiteten af ​​

in vivo

billeddannelse af apoptose efter første og anden runde af behandling (svarende til en uge og to uger efter påbegyndelse af behandlingen, henholdsvis) og tumorvolumen senere (efter 3 uger efter indledning af behandling). De fluorescens intensiteter af billeder taget af cyklisk ApoPep-1 efter den første runde af behandlingen var omvendt korreleret med tumor volumen med den stærkeste aftale (korrelationskoefficient r

2 = 0,934, figur 4C), sammenlignet med dem, der træffes af cyklisk ApoPep- 1 efter den anden runde af behandlingen (r

2 = 0,705, figur 4D) og ved lineær ApoPep-1 efter den første (r

2 = 0,631, figur 4A) og anden runde af behandlingen (r

2 = 0,402, figur 4B).

data viser korrelation mellem NIR fluorescensintensiteter opnået i figur 2A og 2B og tumorvolumener fremstillet i figur 3A og 3B. (A) (B) Korrelation mellem fluorescensintensiteter opnået ved lineær ApoPep-1 efter den første og anden runde af behandlings- og tumorvolumener. (C) (D) Sammenhæng mellem fluorescensintensiteter opnået ved cyklisk ApoPep-1 efter første og anden runde af behandling og tumor volumen.

Stabilitet af lineære og cykliske ApoPep-1 i serum

Vi undersøgte, om højere niveauer af billeddannende signaler ved den cykliske ApoPep-1 sammenlignet med dem for den lineære ApoPep-1 skyldtes forskellen i serum stabilitet af peptider. Efter inkubering af den lineære og cykliske form af ApoPep 1 med museserum op til 24 timer blev mængden af ​​peptidet forbliver i serummet analyseres. Toppens peptid var adskilles fra ikke-specifikke toppe af serum, og mængden af ​​lineære og cykliske form af peptidet forbliver i serummet, som beregnet af topareal blev ikke signifikant ændret op til 24 timer (figur 5A og 5B, henholdsvis). MS-analyse af hvert peptid top bekræftede identiteten af ​​den lineære (figur 5C) og cyklisk (figur 5D) form af ApoPep-1. Disse resultater antyder, at både lineære og cykliske former af ApoPep-1 er stabile i serum op til 24 timer med nogen forskel i stabilitet i inkubationstiden periode.

lineære og cykliske ApoPep-1-peptider blev inkuberet med museserum ved 37 ° C i de indikerede tidsperioder. (A) (B) lineære og cykliske form af ApoPpep-1 prøver og museserum blev fraktioneret ved C18 omvendt fase FPLC. Y-aksen repræsenterer absorbansen enhed ved 215 nm. Hver top peptid blev angivet med en pil og adskilles fra serum toppe. (C) (D) MS spektrum af lineære og cykliske peptid peak indsamlet fra 24 timer FPLC fraktion og syntetisk lineære og cykliske ApoPep-1.

Diskussion

Her er vi viste, at

in vivo

billeddannelse af apoptose ved optagelsen af ​​ApoPep-1 til tumoren på et tidligere tidspunkt (en uge efter behandling) kunne forudsige maven tumorrespons og efterfølgende reduktion i tumorvolumen på et senere tidspunkt (tre uger efter behandling). Desuden den cykliske form af ApoPep-1 viste højere niveauer af

in vitro

binder til apoptotiske celler og

in vivo

billeddannende signaler og mere bemærkelsesværdig forskel mellem cisplatin eller cetuximab alene og cisplatin plus cetuximab i kombination end den lineære form af ApoPep-1 gjorde (mere følsom detektion). Intensiteten af ​​billedbehandling signaler, der træffes af den cykliske ApoPep-1 efter den første runde af behandling viste tættere sammenhæng med ændringer i tumor volumen end gjorde dem ved lineær ApoPep-1 (mere specifik detektion). Disse resultater viser, at billeddannelse af apoptose ved hjælp af den cykliske ApoPep-1 kunne være et nyttigt redskab for en tidligere afgørelse af mave tumor respons efter anti-cancer behandling end i øjeblikket tilgængelig værktøj baseret på tumorstørrelsen måling ved CT-scanning.

Apoptose imaging sonder, der genkender forskellige biomarkører er blevet mærket med forskellige imaging-dele og udnyttes til overvågning af tumor respons efter anti-cancer behandling. For eksempel blev fluorescens farvestof-mærket annexin V gives i kolon tumorbærende mus efter en uges cetuximab behandling og viste en top akkumulering ved 24 timer efter intravenøs administration, som blev forbundet med et fald på epidermal vækstfaktor optagelse og aktivering af caspase -3 [28].

3H-mærket butyl-2-methyl-malonsyre der binder til anioniske phospholipid blev givet i kolon tumorbærende mus 24 timer efter kemoterapi og blev akkumuleret i tumor ved 2 timer efter injektion, som blev ledsaget af et fald på tumorvægte [29]. Fluorescens farvestof-mærkede caspaseaktivitet-baserede peptid probe blev givet i mus, som bærer colontumor ved 12 timer efter behandling med Apomab at inducere apoptose, hvilket igen viste fluorescenssignaler ved 50 min efter injektion [30].

124I-mærket phosphatidylserin antistof blev injiceret i mus, der bærer prostata tumor 24 timer efter behandling med kemoterapi eller strålebehandling, hvor billederne blev taget 48 timer efter antistof injektionen og viste forøget optagelse af antistoffet i tumoren og invers korrelation mellem antistof optagelse og ændringen i tumorvolumen (r

2 = 0,85) [13]. I forhold til de tidligere rapporter, vores resultater tyder på, at ApoPep-1 er en lovende sonde i form af hurtige optagelseshastighed (2 timer) og tæt korrelation med tumor volumen ændring (r

2 = 0,934).

en cyklisk form af et peptid er generelt mere stabile mod nedbrydning ved hjælp af protease og mere selektiv i target binding end dens lineære form [31]. En cykliske form af RGD peptid, for eksempel, viser forbedret stabilitet mod pH-ændringer [32]. Kliniske undersøgelser som en potentiel angiogenese hæmmer gennemgår med cyklisk form for RGD peptid [31]. I nogle tilfælde er der imidlertid lineær form af et peptid viste bedre bindingsaktivitet og billeddannende signaler [31]. I den foreliggende undersøgelse sammenlignede vi lineær og cyklisk form af ApoPep-1 for at se, hvilken form viser bedre aktivitet i detektering apoptose. Vi fandt, at cyklisk form af ApoPep-1 var mere følsomme i binding og påvisning apoptotiske celler end dens lineære form. Hvorfor har den cykliske form af ApoPep-1 viser bedre

in vitro

bindende og

in vivo

afsløring aktivitet på apoptotiske celler? Vi undersøgte stabiliteten af ​​peptider i serum. Det er tidligere blevet beskrevet, at ApoPep-1 var stabilt op til 2 timer i serummet [33]. I denne undersøgelse har vi forlænget inkubationstid periode og fandt, at både de lineære og cykliske form af ApoPep-1 var stabile i nærværelse af serum indtil 24 timer. Dette antyder, at forskellen i serumstabilitet ikke bidrager til det forbedrede målretning aktivitet af den cykliske form af ApoPep-1 over den lineære form af ApoPep-1. En alternativ forklaring kan være, at dannelsen af ​​indsnævret struktur ved disulfidbinding kan føre til gunstigere binding til apoptotiske celler ved den cykliske ApoPep-1 over dens lineær form.

Foruden fluorescensfarvestoffer, ApoPep-1 kan mærkes med radioisotoper, såsom

123I,

18F, og

68Ga, gennem kemiske linkere og anvendes som en probe til enkelt foton tomografi (SPECT) eller PET-billeddannelse. Som fremtidige retning, PET billeddannelse af apoptose ved hjælp af

18F-mærket lineær eller cyklisk ApoPep-1 mangler at blive undersøgt for overvågning af tumor respons. ApoPep-1-baserede billeddannelse af apoptose ville være nyttig i behandlingen af ​​terapeutiske strategier i klinikker og bidrage til udviklingen af ​​nye antikræftmidler.