PLoS ONE: histon-deacetylasehæmmerne bevidstgøre Lung Cancer Cells til Hypertermi: Inddragelse af Ku70 /SIRT-1 i Thermo-Protection

Abstrakt

Denne undersøgelse beskriver overfølsomhed mekanisme for termisk stress ved histondeacetylaseinhibitorer (HDACi) i lunge kræftceller og viser, at Ku70, baseret på dens acetylering status, medierer beskyttelse af lungekræft fra hypertermi ( 42,5 ° C, 1-6 timer). Ku70 regulerer apoptose ved sekvestrering pro-apoptotisk Bax. Imidlertid er dens rolle i termisk spænding ikke fuldt klarlagt. Resultaterne viste, at forbehandling af lungecancerceller med HDACi, nicotinamid (NM) eller Trichostatin A (TSA) eller begge signifikant forøget hypertermi-induceret Bax-afhængig apoptose i PC-10 celler. Vi fandt, at hypertermi inducerer SIRT-1, sirtuin, opregulering men ikke HDAC6 eller SIRT-3, derfor transfektion med dominant negativ SIRT-1 (Y /H) også fjernet beskyttelsen og resulterede i mere celledød ved hypertermi, i H1299 celler gennem Bax-aktivering. Hypertermi alene primet lungekræft celler til apoptose uden fremtrædende død. Efter hypertermi Bax blev opreguleret, Bcl-2 blev nedreguleret, Bax /Bcl-2-forhold blev inversed og Bax /Bcl-2 heterodimer blev dissocieret. Selvom hypertermi ikke påvirkede total Ku70 udtryk niveau, det stimulerede Ku70 deacetylering, hvilket igen kunne binde mere Bax i PC-10 celler. Disse resultater antyder en flugt mekanisme fra hypertermi-induceret Bax-aktivering. For at verificere rolle Ku70 i denne beskyttelsesmekanisme, blev Ku70 tavshed af siRNA. Ku70 silencing betydeligt sensibiliseret de lungecancerceller til hypertermi. De Ku70 KD celler undergik cytotoksisk G1 anholdelse og caspase-afhængig apoptose sammenlignet med scrambled transfektanter, som viste kun G2 /M cytostatisk anholdelse i de undersøgte cellelinjer, hvilket tyder på en ekstra cellecyklus-afhængige, roman, rolle Ku70 i beskyttelse mod hypertermi. Tilsammen vore data viser en Ku70-afhængig beskyttelsesmekanisme fra hypertermi. Målretning Ku70 og /eller dets acetylering under hypertermi kan repræsentere en lovende terapeutisk tilgang til lungekræft

Henvisning:. Hassan MK, Watari H, Salah-Eldin A-e, Sultan AS, Mohamed Z, Fujioka Y, et al. (2014) histon-deacetylasehæmmerne bevidstgøre Lung Cancer Cells til Hypertermi: Inddragelse af Ku70 /SIRT-1 i Thermo-Beskyttelse. PLoS ONE 9 (4): e94213. doi: 10,1371 /journal.pone.0094213

Redaktør: Sue Cotterill St. Georges, University of London, England

Modtaget: 30 august, 2013; Accepteret: 14. marts 2014 Udgivet: 11 April, 2014

Copyright: © 2014 Hassan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev delvist understøttet af et tilskud-in-hjælp HW for Videnskabelig Forskning (C 22.591.844 og 20.659.255) fra Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi i Japan. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

En mangeårig forskning interesse har været rettet de særlige mekanismer, der er ansvarlige for udviklingen af ​​kræft celle resistens overfor forskellige behandlingsformer. Målretning disse mekanismer kan forøge den specifikke destruktion af cancerceller. Hypertermi er en modalitet, der anvendes i kliniske omgivelser, til behandlingen af ​​mange cancere; Det anvendes sædvanligvis i kombination med stråleterapi og /eller kemoterapi [1], [2]. Men en væsentlig hindring for effektiviteten af ​​hypertermi er udviklingen af ​​cellulær resistens, som blokerer apoptotisk signalering og øger celleoverlevelse [3], [4]. Denne modstand forårsager begrænsning af apoptose efter hypertermi [5], [6]. Således identifikation af de mekanismer, der er ansvarlige for udviklingen af ​​termo-resistens i kræftceller, kan hjælpe med at forbedre specifik målretning at øge cellulære følsomhed behandlingsresultater til hypertermi. Resistens over for apoptose er en almindelig egenskab ved cancerceller [3], [7]. Apoptose induceret af, ydre og indre veje [8]. Binding af ligander til en død receptor aktiverer ydre vej; den indre vej aktiveres af celle stress, såsom DNA-beskadigelse. Bcl-2-protein familien regulerer indre vej; det påvirker permeabiliteten af ​​den ydre mitokondriemembran [9]. Medlemmer af Bcl-2-familien er opdelt i proapoptotiske proteiner, såsom Bax, Bak, og Bok, og antiapoptotiske proteiner, herunder Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, og Mcl-1 [10] – [13].

Akkumulering af Bcl-2 og Bcl-xL kan beskytte celler mod apoptose, fremme celleoverlevelse og accelerere tumorvækst ved sekvestrering pro-apoptotisk Bax. Ku70 er et andet anti-apoptotisk molekyle; det naturligt binder Bax, udskille det fra aktivering eller mitokondrie translokation i tryksvage celler [14], [15]. Ku70 er en af ​​komponenterne i Ku70 /Ku80 heterodimer, der er involveret i DNA beskadigelse reparation [16]. Acetylering af to kritiske lysiner, på carboxylterminalen af ​​Ku70, regulerer bindingen /dissociation til Bax og dette påvirker den efterfølgende følsomhed af cellen til apoptotiske stimuli [14]. Kun deacetylerede Ku70 kan binde til Bax. Høj udtryk for Ku70 i cancerceller ville øge DNA-reparation evne og reducere Bax-medieret apoptose; derfor kan Ku70 spille en rolle i behandlingen modstand. Den apoptose-relaterede aktivitet af Ku70 er uafhængig af dets rolle i DNA-reparation [17]. Den Ku70 acetylering /deacetylering cyklus er reguleret af histon acetyl transferaser og histondeacetylaser (HDAC). Ku70 er et mål for nogle medlemmer af klasse I /II HDAC og klasse III-HDAC [18], [19]. Den HDAC familie af proteiner er opdelt i to kategorier: zink-afhængige enzymer (HDAC1-11), opdelt i klasse I og klasse II, som hæmmes af Trichostatin A (TSA) og NAD

+ – afhængige enzymer (klasse III; SIRT1-7), som inhiberes af nicotinimide (NAM). Mere præcist, SIRT-1, et medlem af klasse III HDAC’er, spiller en afgørende rolle i Ku70 deacetylering, som forbedrer beskyttelsen af ​​celler fra Bax under kaloriefattige begrænsning [19]. Størstedelen af ​​cancerceller over-udtrykker SIRT1 [20]. Således rettet mod Ku70-afhængige beskyttelse mod apoptose ved HDAC-hæmmere, som hæmmer SIRT-1, kunne være en effektiv strategi for sensibilisering kræftceller til forskellige behandlinger. I denne undersøgelse vores model er, at lungecancerceller betydeligt dræbt ved hypertermi når forbehandlet med HDACi sammenlignet med kun hypertermi. SIRT-1 og dets mål, Ku70, er centrale for den mekanisme, hvormed lunge kræftceller kan undslippe termisk-induceret død. Ændringer i aktiviteten af ​​Bax, Ku70 acetylering og cellecyklussen blev undersøgt under eksponering for hypertermi. Desuden blev effektiviteten af ​​sekvensspecifik målretning af Ku70, ved hjælp siRNA, også undersøgt med hensyn til sensibilisering lungecancerceller til hypertermi. Ku70 synes at spille en afgørende rolle i beskyttelsen af ​​celler fra hypertermi sandsynligvis ved at udskille opreguleret Bax.

Materialer og metoder

Cellelinjer

To menneskelige, ikke- småcellet carcinom-cellelinier: PC-10 [21], og H1299, blev indkøbt (American Type Culture Collection, ATCC) og dyrket i RPMI 1640 medium (Gibco, Grand Island, NY, USA) indeholdende 10% føtalt bovint serum ( Sigma, St. Louis, MO, USA) (komplet medium) i en fugtig atmosfære af 5% CO

2 ved 37 ° C. Den dyrkede medium blev erstattet med frisk komplet medium hver tredje dag.

Antistoffer og reagenser

Anti-humant Bax kanin-polyklonalt antistof (pAb) og anti-humant Ku70 muse-monoklonalt antistof (mAb) var indkøbt fra BD Bioscience (Erembodegem, Belgien); et andet anti-humant Ku70 muse mAb til immunopræcipitation, anti-human HDAC-6 og anti-humant SIRT-3 kanin (pAb) blev indkøbt fra Abcam (Cambridge, UK); anti-humant Ku80 muse mAb fra signaltransduktion (USA), anti human SIRT-1 og anti pan-K (Acetylated lysin) fra Upstate (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY, USA); anti human Bcl-2 muse-mAb blev indkøbt fra DAKO (Glostrup, Danmark). Påvisning ved immunoblotting blev udført med anti-mus eller anti-kanin sekundære HRP-konjugerede antistoffer (Dako) fortyndet 1: 2.000. Immunofluorescens-farvning blev udført under anvendelse af anti-kanin FITC-konjugeret sekundære antistoffer (Dako) fortyndet ved 1:. 50. histondeacetylaseinhibitorer (HDACi), nicotinamid (NAM) og Trichostatin (TSA) blev erhvervet fra Wako Chemicals, Japan

HDACi behandling optimering

Hver HDACi brugt blev screenet for dens sub-dødelig dosis i et pilotforsøg. Cellelevedygtighed blev vurderet ved anvendelse af MTT-assayet, med eller uden DMSO alene, og tilføjelsen af ​​forskellige doser af hver af de HDACi; 300 nM TSA og 20 mM NAM blev valgt som ikke-toksiske doser og længere anvendt i de efterfølgende eksperimenter.

Varmebehandling

Cellerne fastgjort til bunden af ​​dyrkningsskålene, var præ-kultur i 48 timer, og blev derefter inkuberet i en fugtig atmosfære af 5% CO

2 ved enten 37,0 ° C (kontrol) eller 42,5 ° C i 1-9 timer.

Flowcytometri, cellecyklusanalyse og Annexin V farvningsresultater

efter eksponering for hypertermi, blev cellerne inkuberet igen ved 37 ° C i 0 timer, 24 timer, eller 48 timer. Derefter blev analyseret cellecyklusfaser. Kort fortalt blev cellerne fikseret med 70% ethanol ved 4 ° C natten over. Efter vask med Ca

2 + -Mg

2 + -fri Dulbeccos PBS, blev cellerne behandlet med 0,1 mg /ml RNase (type IA, Sigma, St. Louis, MO, USA) og derefter farvet med 100 ug /ml propidiumiodid (PI; Sigma), i mørke ved stuetemperatur i 20 minutter. Efter passage gennem en 40 nm nylonnet blev prøverne opbevaret på is indtil målinger. de data, ved hjælp af FACS kalibrator, blev anvendt til at analysere fase proportioner cellecyklus med ModFit software. En celle brøkdel af DNA, under sub-G0 /G1 peak, angivet apoptotiske celler; DNA histogrammer blev anvendt til estimering.

I Annexin V-farvning blev cellerne direkte farvet med PI og Annexin-V Flous (Roche) i 10 minutter og derefter vasket med inkubationsbuffer. Cellerne blev identificeret med en FACS kalibrator efter indstilling af spænding ved hjælp af ikke-behandlede farvet kontrol celler. Cellerne blev analyseret ved hjælp af Cell Quest-software og klassificeret i fire forskellige faser: ufarvede levende celler, tidlige alder apoptotiske celler farvet kun med Annexin-V, midaldrende apoptotiske celler dobbelt farves, og sen alder apoptotiske og nekrotiske celler farvet med PI kun

Immunopræcipitation

cellerne (5 x 10

6 /skål) blev vasket med kold PBS, lyseres på is i RIPA-lysepuffer (50 mM Tris, pH 7, 150 mM NaCl, 0,5% natriumdeoxycholat og 0,1% NP-40) (NP-40; Nacalai Teque, Kyoto, Japan) eller CHAPS lysispuffer (150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7,4, 1% CHAPS) [22] suppleret med en proteaseinhibitorcocktail (Sigma) i 1 time og derefter centrifugeret ved 15.000 rpm i 10 min. Supernatanten blev blandet med protein A-Sepharose (for pAb) eller protein G-sepharose (for mAb) (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA), præ-kvældet i PBS og præ-coatet med det ønskede antistof mod Bax, Ku70, Acetylated lysin eller SIRT-1 ved forsigtigt rystning i 1 time ved 4 ° C og centrifugeret i 1 min ved 3000 rpm. Efter vask med lysepuffer blev immunkompleks fraktioneret ved SDS-PAGE (10-12% geler) og derefter undergik Western blot analyse. Salg

Western blot-analyse

Efter SDS-PAGE, proteinerne blev overført til en PVDF-membran (Amersham, Buckinghamshire, UK). Membranen blev blokeret ved 4 ° C natten over med blokerende buffer. Membranen blev inkuberet i 1 time ved stuetemperatur med det ønskede Ab. Efter vask tre gange med TPBS blev membranerne inkuberet i 1 time med sekundær Ab, ved stuetemperatur, efterfulgt af tre gange vask med TPBS. Membranen blev udviklet ved anvendelse af ECL reagenser (Amersham). Den kemiluminescens blev visualiseret med en polaroid kamera (Amersham Pharmacia) og kvantificeres ved hjælp af densitometri.

siRNA design og transfektion

siRNA oligomerer mod Ku70 mRNA (Ku70-siRNA) og en kontrol sekvens, der ikke gjorde matche enhver gensekvens (Cont-siRNA) blev enten købt som en valideret on (Ambion, USA; Ku70-siRNA-2 og cont-siRNA-2, henholdsvis) eller designet af undersøgerne og derefter syntetiseres af Ambion ifølge den følgende sekvens : Ku-siRNA, 5_UUCUCUUGGUAACUUUCCCdTdT_3 (Ku70-siRNA-1) og 3_dTdTAAGAGAACCAUUGAAAGGG_5; Cont-siRNA, 5_GCG CGC UUU GUA GGA UUC GdTdT_3 og 3_dTdTCGCGCG AAA CAU CCU AAG C_5 (fortsat-siRNA-1). Denne sekvens targeting valideret [23]. siRNA oligomerer mod Bax mRNA (Bax-si) blev købt fra Qiagene (kat nr SI04948202). Bax-si, den Ku70-siRNAs eller cont-siRNA’er blev transficeret ind i lungecancerceller (10

5 celler /60 mm skål) under anvendelse SiPORT

Neofex

(Ambion, USA) til en endelig koncentration på 200 nM, to gange. En dag efter den sidste transfektion blev cellerne trypsineret og udpladet på 60 mm skåle (50.000 celler pr skål) i tre eksemplarer. Efter cellebinding blev cellerne eksponeret for hypertermi i de angivne tidsintervaller ifølge det eksperimentelle design. Hvert forsøg blev gentaget mindst tre uafhængige gange for reproducerbarhed og statistisk beregning.

Statistisk vurdering

Statistiske analyser blev udført ved hjælp af Minitab Release (Ver.12). Data er udtrykt som middelværdi ± S.E.M. Envejs variansanalyse (ANOVA) blev anvendt til at vurdere den statistiske signifikans mellem midler. Forskelle mellem midler blev betragtet som signifikante ved p-værdier mindre end 0,05.

Resultater

HDACi betydeligt lettet celledød med hypertermi

Som en kendsgerning, SIRT-1, et menneske deacetylase, blev specifikt rettet af små molekyler kaldet HDACi, for eksempel NAM. Desuden blev Ku70 deacetylering inhiberet af inhibitormolekyler der er målrettet mod klasse I /II HDAC; f.eks TSA. Vi først forbehandlet PC-10 celler med forskellige HDACi, NAM (20 mM), TSA (300 nM) eller begge, til 4 h lige før udsættelse for hypertermi. Denne kombinerede behandling signifikant forøget apoptose, mere end to folder, sammenlignet med hypertermi behandling alene, som observeret ved fasekontrastmikroskopi (fig. 1A) og Annexin V-farvning (fig. 1B). Bax ekspressionsmønster blev analyseret i helcellelysater fra behandlede og ubehandlede PC-10 celler. Bax ekspression (21 kDa) blev forhøjet med hypertermi. Interessant HDACi (NAM og TSA) øget produktion af 18 kDa Bax, som er kendt for at være en N-terminal trunkeret form af Bax. I betragtning af at Bax aktivering induceret af enten den N-terminale eksponering ved konformationel ændring (reversibel ændring) eller N-terminal trunkering (irreversibel ændring), tyder disse resultater på, at bæredygtig forbedret apoptose med hypertermi og HDACi er Bax-afhængig og denne apoptose kan afhænge på opregulering af Bax eller frigivelsen af ​​Bax fra antiapoptotisk protein (er) for at fremme apoptose (fig. 1C). Vigtigt er det, at behandling af lungecancerceller med HDACi, kun på udvalgte doser, havde ingen væsentlig toksisk virkning. Lignende virkninger af HDACi blev observeret i H1299 celler (figur. S1 og S2). Uventet, den tredobbelte kombination af NAM, TSA og hypertermi var mindre effektivt i H1299 end dobbelt kombination. Selv om den nøjagtige molekylære mekanisme af dette fænomen forbliver uklar, en mulig årsag er, at den tredobbelte kombination kan forbedre fordelingen af ​​de overlevende celler undslap den udfordring tredobbelt behandling, som kan give produktionen af ​​nye datterceller inden for 48 timer efter behandling ( før annexin V-farvning påvisning) og forårsage reduktion af annexin V-farvning procentdel endelig. For at bekræfte at Bax spiller en stor rolle i hypertermi-induceret apoptose efter målrette Ku70 deacetylering blev Bax målrettet med specifikke siRNA i PC-10 celler (se materialer og metoder). Bax var modtagelig for siRNA transfektion (Bax-si) sammenlignet med kontrol scrambled oligo siRNA (fortsat-si) som påvist ved western blot-analyse (figur 1 D,. Øvre panel). Igen, når Bax-slået ned PC-10-celler blev behandlet med hypertermi i 6 timer i nærværelse af HDACi blev hypertermi celledød signifikant inhiberet (figur 1D;. Nedre panel). I mellemtiden blev celledød ikke blokeres fuldstændigt under hypertermi behandling alene (figur 1D;. Nedre panel og fig S3.). Dette resultat kan indikere inddragelse af andre pro-apoptotiske molekyler i den begrænsede celledød induceret af hypertermi.

A

. Fase kontrast fotografier af PC-10 celler, to dage efter behandling med HDACi Then hypertermi i 6 timer. Billedet viste begrænset antal af genvundne celler såvel som de afrundede og flydende apoptotiske celler i kolonierne forbehandlet med HDACi derefter hypertermi.

B

. Forbehandling af PC-10 celler med HDACi signifikant øget hypertermi-induceret apoptose. Komparative cytogrammer viser Annexin V-farvning efter hypertermi i PC-10-celler forbehandlet med nictotinamide (20 mM), Trichostatin A (300 nM) eller begge (øvre panel). Oversigt over gennemsnitlige annexin V resultater afsluttes (nederste panel).

C

. Bax ekspressionsniveauerne, ved Western analyse, i PC-10 celler efter hypertermi (6 timer) forbehandlet med forskellige HDACi. Lavere bånd (18 kDa) angiver afkortet, aktiv, Bax kun øges, når celler behandlet med en kombination af HDACi og hypertermi.

D

. Et repræsentativt western blot viser ændringen af ​​Bax for den specifikke siRNA brugt. PC-10-celler blev enten transficeret med Bax-si eller cont-si to gange. Actin immunoblot blev anvendt som en loading kontrol (øvre panel). Væsentlig reduktion af annexin V farvning efter hypertermi og HDACi i Bax KD celler sammenlignet med kontrol (ler), der angiver, at Bax er nøglen proapoptotiske aktør i den dobbelte behandling-induceret apoptose (nederste panel). Hvert datapunkt repræsenterer gennemsnittet af tre eksperimenter; barer betegner SD; ** Angiver forskel fra kontrol transfektant ved P 0,01

Effekt af hypertermi på ekspressionen af ​​apoptose relaterede proteiner i PC-10 celler

For at undersøge effekten af ​​hypertermi på Bax og. dets vigtigste bindingsmolekyler, blev nogle af de apoptose-relaterede proteiner (Bax, Bcl-2, Ku70 og Ku80) undersøgt ved Western blot-analyse i en repræsentativ cellelinie, PC-10. Fordi de fleste af husholdning gener er lydhøre over for hypertermi, blev således Ponceau S farvning bruges til at vise lastning kontrol. Hypertermi (42,5 ° C) i 1-9 timer inducerede kvantitative ændringer i Bax og Bcl-2-ekspression uden nogen observerbare ændringer i Bd-XL, Ku70 og Ku80 (fig. 2A) Bax-ekspression var lidt opreguleret mens Bcl-2 ekspression blev nedreguleret i PC-10 celler. Den Bax /Bcl-2 steg gradvist efter hypertermi behandling (figur. 2B, øverste panel). Western blot analyse af Bax og Bcl-2, med forskellige belastningstilstande mængder protein (20 ug, 40 ug og 60 ug /bane), efter 0 h og 6 h hypertermi behandling bekræftede en forøget Bax /Bc-l2-forhold (figur. 2B , nederste panel) som verificeret denstimetrically (ved hjælp af Scion billede software). Lignende observationer blev også opnået i H1299 celler (figur. S4). Derfor havde vi meget interesse for at besvare spørgsmålet, hvorfor kræftceller, med vildtype Bax, som blev opreguleret, ikke viser fremtrædende apoptose efter hypertermi medmindre DHACIs tilsættes. Mærkbart, ved immunocytokemi Bax og Bcl-2 viste primært cytosoliske lokalisering i cellelinierne undersøgt (fig. S5). Derfor flyttede vi til at studere Bax dimerisering.

A

.Whole celleekstrakter blev udarbejdet på angivne perioder efter 42,5 ° C hypertermi og Bax, Ku70, Ku80 og Bcl-2 blev analyseret ved immunoblotting . Svag stigning i Bax først efter 6 og 9 timer hypertermi og begrænset Bax aktivering efter 9 h er observerbare. Hypertermi reducerede Bcl-2, mens Bd-XL og Ku70 ikke var blevet tydeligt påvirket. Anaysis blev udført i den samme blot så hvert protein arbejdede som loading kontrol for den anden. Et repræsentativt Ponceau S-farvning af membranen blev vist at verificere normaliseringen fordi de fleste af de grundlæggende hus-føring gener (for eksempel: actin og tubulin) reagerer på hypertermi.

B

. Kvantitative analyser af Bcl-2 og Bax proteinekspression under hypertermi. Hvert bånd blev kvantificeret densitimetrically. Et repræsentativt sæt Bax /Bcl-2-forhold er vist. Western-analyse med forskellige belastningstilstande mængde PC-10 celler lysater efter 6 timer hypertermi kontrollerer ændringen i Bax /Bcl-2-forhold, mens Bd-XL-ekspression blev anvendt som en loading kontrol fra samme blot.

Forstyrrelse af Bax heterodimerisering ved hypertermi

i tryksvage celler, Bax heterodimeriserer med mange, anti-apoptotiske, partner molekyler; det homodimerizes under stress at inducere apoptose. At undersøge virkningen af ​​hypertermi på Bax dimerisering blev Bax immunopræcipiteret fra PC-10 cellelysatet efter 6 timers udsættelse for hypertermi. Figure.3A, shows faldt Bax /Bcl-2 heterodimer formation; Bax /Bcl-XL heterodimer blev ikke påvirket af hypertermi, i henhold til resultaterne af Western blot analyse. Af note, var, at mængden af ​​Ku70 bundet til Bax steg med øget eksponeringstid til hypertermi. Den Ku70 immunpræcipitering bekræftede forbedret Bax /Ku70 binding efter 6 timers udsættelse for hypertermi, mens Ku70 /Ku80 binding viste ingen ændring (fig. 3B). Lignende observation blev opdaget, da CHAPS buffer blev anvendt til immunopræcipitationsforsøg (figur. S6)

En

. PC-10-celler blev inkuberet ved 42,5 ° C i 0, 1, 3 og 6 timer. Bax blev co-immunpræcipiteret fra 2 mg totalt protein og Bcl-xL, Bcl-2 og Ku70 blev påvist i immunoprecipitant ved western-analyse. Hypertermi inducerer Bax opregulering og Bax afstandtagen fra Bcl2 og forbedrer sammenhængen mellem Bax og Ku70, mens ingen virkning på Bax /Bel-XL forening. I modsætning hertil Ku70 blev co-immunpræcipiteret fra lignende cellelysater. Bax og Ku80 vises i immunoprecipitant.

B

. Efter hypertermi viste samlede Ku70 niveauer ingen ændringer, men association mellem Ku70 og Bax blev forstærket.

Hypertermi reducerede Ku70 acetylering i PC-10 celler

Acetylering af enten K539 eller K542 på Ku70 C-terminale linker er tilstrækkelig til fuldstændigt at blokere Ku70 suppression af Bax-medieret apoptose [14]. Virkningerne af hypertermi på Ku70 acetylering status blev derfor undersøgt ved sondering blottet for Ku70 immunoprecipitant med antiacetylated lysin Ab (figur 4A.); resultaterne viser en signifikant reduktion i Ku70 acetylering efter 6 timers udsættelse for hypertermi i PC-10 celler. Desuden er mængden af ​​Ku70 detekteret, i det acetylerede protein immunoprecipitant, faldt i en tidsafhængig måde (Figur. 4B).

A

. Ku70 blev immunpræcipiteret fra ens protein mængder (3 mg) af PC-10 celler Lysat efter hypertermi på angivne tidspunkt. Ku70 og acetyl Lysin blev påvist i immunoprecipitant. Total Ku70 viste ingen ændring efter 6 timer hypertermi (i put), men acetyleret Ku70 faldt.

B

. Alle acetylerede proteiner blev immunopræcipiteret, fraktioneret, blottet og Ku70 blev detekteret i blottet. Anførte bånd acetyleret Ku70 blev svagere med stigende hypertermi tid.

C

. Hypertermi forbedret både Ku70 udtryk og Ku70 /SIRT-1 binding. SIRT-1 blev immunpræcipiteret fra PC-10 efter hypertermi (0-6 timer). Blot angiver SIRT-1 opregulering (i put lavere panel) og forbedret binding til Ku70, i samme blot blev opreguleret (øverste paneler).

D

. Tilsvarende hypertermi behandling i H1299. Totalt Ku70 blev udfældet. Ku70 og SIRT-1 blev påvist i immunoprecipitant ved Western-analyse. SIRT-1 /Ku70-binding blev forøget, hvilket indikerer en forbedret Ku70 deacetylering i lungekræft celler ved hypertermi.

SIRT-1 medierer Ku70-afhængige cytoprotektion fra hypertermi

Det er velkendt at Ku70 acetylering specifikt vendes ved SIRT-1, en human deacetylase, under mild stress (såsom, kaloriefattige begrænsning); Under sådanne betingelser, Ku70 sekvestrerer mere Bax og beskytter celler fra Bax-medieret apoptose [19]. For at undersøge om acetylering hæmning, med udsættelse for hypertermi, skyldtes aktivering af SIRT-1, analyserede vi SIRT-1-ekspression efter eksponering for hypertermi (0-6 timer). Western blot-analyse afslørede, at SIRT-1-ekspression blev induceret ved hypertermi i PC-10 celler (figur. 4C). Endvidere blev SIRT-1 immunpræcipiteret fra PC-10 hele cellelysater og derefter underkastet Western blotting-analyse. Mængden af ​​Ku70 immunpræcipiteret med SIRT-1 blev forøget ved udsættelse for hypertermi (fig. 4C). Tilsvarende blev mængden af ​​SIRT-1 immunpræcipiteret med Ku70 også forøget ved udsættelse for hypertermi (0-6 timer), hvilket bekræfter, at Ku70 /SIRT-1-binding blev styrket ved hypertermi i PC-10 celler (Figure.4D). Vi spekuleret på, at opreguleres SIRT-1, under betingelser med hypertermi, binder til Ku70 og ændrer den fra acetyleret til deacetylerede form, hvilket giver Ku70 at sekvestrere mere Bax, enten befriet fra Bcl2 eller nyligt induceret under hypertermi, at inhibere hypertermi-induceret apoptose endelig. Disse resultater forklarer, i det mindste delvis, hvorfor HDACi, såsom NAM, kan forbedre apoptose ved hypertermi, sandsynligvis ved at målrette visse HDAC’er som SIRT-1. Især gjorde andre histondeacetylaser herunder HDAC6 og SIRT-3, ikke viser signifikante ændringer i udtrykket profil efter udsættelse for hypertermi (figur. S7). For at bekræfte de ovenstående resultater, H1299 celler (med relativt høj transfektionseffektivitet, 50% som bestemt ved beta gal transfektion) blev transient transficeret enten med vildtype-SIRT-1 eller dominant negativ H363Y /SIRT-1. Hypertermi-induceret apoptose blev betydeligt forbedret i de H363Y /SIRT-1-transficerede celler sammenlignet med kontrolvektoren transfektanter (figur 5A;. P 0,01). Vigtigere, viste svag men signifikant vildtype SIRT-1-transficerede celler (P 0,05) beskyttelse mod hypertermi i de testede celler, hvilket indikerer, at anti-apoptotiske virkning af det eksogene SIRT-1 er signifikant men begrænset. Dette var sandsynligvis fordi det endogene SIRT-1 havde udløst meste af den spontane beskyttelse mod hyerthermia som angivet ved eksperimenter DNA-indholdet (fig. 5A). Tilsvarende resultater blev opnået fra Annexin V-farvning; H363Y /SIRT-1 transfektion ind H1299 celler signifikant forøget apoptose efter udsættelse for hypertermi sammenlignet med tom vektor transfektant (fig. 5B). Især hverken vildtype SIRT-1 eller dominant negativ H363Y /SIRT-1 transfektion viste individuelt mærkbare forandringer i cellecyklus.

A

. SIRT-1 er involveret i cytoprotektion fra hypertermi. Western blot viser overeksprimeret SIRT-1. FACS-analyse af H1299-celler efter transient transfektion med enten bred typen SIRT-1, dominant negativ SIRT-1 eller FLAG ekspressionsvektor. H363Y /SIRT-1 væsentligt forbedret hypertermi-induceret celledød, mens bred typen SIRT-1 havde ingen signifikant effekt (øverste panel).

B

. Resultater af annexin V farvning af H1299 celler, fra tilsvarende forsøg, bekræfter, at H363Y /SIRT-1-induceret celledød er apoptose (nederste panel).

Målretning Ku70 af siRNA forbedret hypertermi-induceret celledød

for at undersøge, om Ku70 var en central mægler i den førnævnte beskyttelse af cellerne fra hypertermi, Ku70 mRNA blev rettet af sekvens specifikke Ku70-siRNA-1, -2. Ku70 mRNA var modtagelig for Ku7-siRNA-1 (custom design) og efterfølgende blev niveauet af protein-ekspression betydeligt reduceret (dosis, 200 nM) i PC-10 celler (figur 6A.). Styringen siRNA (fortsat-siRNA-1) transfektion påvirkede ikke Ku70 udtryk. Desuden Ku70-siRNA-2 transfektion (se materialer og metoder) blev bekræftet til effektivt Knockdown Ku70 (fig. 6A, nedre panel). Derefter blev både Ku70 knockdown (KD) og kontrolceller udfordret med udsættelse for hypertermi. De Ku70 KD PC-10 celler viste øget celledød efter hypertermi eksponering i en tidsafhængig måde (Figur. 6B, C) i forhold til cont-siRNA transfektant, to dage efter behandlingen, som angivet ved FACS-analyse (ved anvendelse Ku70- siRNA-1). Lignende resultater blev opnået med anvendelse af H1299-celler (ved anvendelse Ku70-siRNA-2 og cont-siRNA-2 (fig. S8)). Disse resultater tyder på, at Ku70 medierer cytoprotektion fra hypertermi eksponering og sandsynligvis spiller en central rolle i hypertermi-induceret apoptose.

A

. Et repræsentativt western blot viser ændringen af ​​Ku70 for begge siRNAs anvendt. PC-10-celler og H1299-celler blev transficeret ved én siRNA to gange. Den vestlige Resultatet viser signifikant banke ned af Ku70-siRNA-1, -2 sammenligne med cont-siRNA-1, -2, hhv. Actin immunoblot blev anvendt som en loading kontrol. Eksperimentet blev gentaget tre uafhængige gange for reproducerbarhed. PC-10 celler blev transficeret med Ku70-siRNA-1 eller cont-siRNA-1 (200-nM) to gange. 24 timer efter sidste transfektion blev lige celleantal subdyrket i yderligere 24 timer, og derefter behandlet med hypertermi for angivne tidsintervaller, og derefter igen dyrket ved 37 ° C i 24 timer (B) eller 48 timer (C) Celler blev erhvervet ved FACS-analysator til cellecyklus-analyse. De viste resultater er et repræsentativt én fra mindst tre uafhængige forsøg for hvert tidspunkt (24 timer og 48 timer).

D

. Ku70 er nødvendig for cytostatisk anholdelse ved hypertermi. Histogrammer viser forskellen ophobning af cellepopulationer i G2 /M-faser i celler med eller uden Ku70, en og to dage efter 0, 1, 3 og 6 timer hypertermi behandling. Befolkninger i forskellige cellecyklus faser, G1, S og G2 /M faser, blev beregnet ved hjælp af computer efter hypertermi behandling. De viste resultater er gennemsnit fra tre uafhængige forsøg.

E

. Betydelig forøgelse af annexin V farvning efter hypertermi i Ku70 KD celler sammenlignet med kontrol indikerer, at Ku70 lyddæmpning-baserede celledød ved hypertermi er apoptose. Hvert datapunkt repræsenterer gennemsnittet af tre eksperimenter; barer betegner SD; * Angiver forskel fra kontrol transfektant ved P . 0.001

Ku70 medieret hypertermi-induceret G2 /M ophobning

Pulse-mærkning eksperimenter med bromdeoxyuridin (BrdUrd; 20 uM) i PC- 10 celler viste, at udsættelse for hypertermi induceret cytostatisk men ikke cytotoksisk arrest (data ikke vist). Den hypertermi-induceret cellecyklus forstyrrelse blev analyseret 24 timer og 48 timer efter 1-6 h eksponering for hypertermi. G2 /M-subpopulationer blev signifikant forøget 24 h efter udsættelse for hypertermi og derefter gradvist faldt til normale subpopulationer 48 timer efter udsættelse for hypertermi (fig. 6D). Samtidig procentdelen af ​​G1 og S-fase subpopulationer nedtrappes 24 timer efter udsættelse for hypertermi og genvundet 48 timer efter fjernelse hypertermi.

B

.