PLoS ONE: transskriptionsprofilering af perifert blod mononukleære celler i bugspytkirtelkræft Patienter Identificerer nye gener med potentiale Diagnostic Utility

Abstrakt

Baggrund

Det er velkendt, at mange maligniteter, herunder kræft i bugspytkirtlen (PC), besidder evnen til at unddrage sig immunsystemet ved indirekte nedregulering af mononukleære celle maskiner er nødvendige for at lancere et effektivt immunrespons. Denne viden, sammenholdt med det faktum, at trancriptome af perifere mononukleære blodceller er blevet vist at blive ændret i forbindelse med mange sygdomme, herunder renalcellecarcinom, får os til at undersøge, om en sådan ændring i genekspression eksisterer i pc som det kan have diagnostisk anvendelighed.

Metoder og Resultater

PBMC prøver fra 26 patienter PC og 33 matchede raske kontrolpersoner blev analyseret af hele genomet cDNA microarray. Tre hundrede treogfirs gener blev fundet at være signifikant forskellig mellem PC og raske kontroller, med 65, der har mindst en 1,5 gange ændring i ekspression. Pathway-analyse afslørede, at mange af disse gener faldt i pathways, der er ansvarlige for hæmatopoietisk differentiering, cytokin signalering, og naturlige dræberceller (NK) celle og CD8 + T-celle-cytotoksisk respons. Unsupervised hierarkisk clustering analyse identificeret en otte-gen prædiktor sæt, bestående af

SSBP2, Ube2b-RS1, CA5B, F5, TBC1D8, ANXA3, arg1,

og

ADAMTS20, Hoteller, som kunne skelne pc patienter fra raske kontrolpersoner med en nøjagtighed på 79% i et blindet delmængde af prøver fra behandling naive patienter, hvilket giver en følsomhed på 83% og en specificitet på 75%.

konklusioner

sammenfattende vi rapportere den første dybdegående sammenligning af globale genekspression profiler af PBMC’er mellem PC patienter og raske kontrolpersoner. Vi har også identificeret et gen, forudsigelse sæt, der potentielt kan videreudvikles til brug i diagnostiske algoritmer i PC. Fremtidige retninger af denne forskning bør omfatte en analyse af PBMC udtryk profiler hos patienter med kronisk pancreatitis samt at øge antallet af patienter tidlige fase at vurdere nytten af ​​PBMC’er i tidlig diagnosticering af pc

Henvisning:. Baine MJ, Chakraborty S, Smith LM, Mallya K, Sasson AR, Mærke RE, et al. (2011) transskriptionsprofilering af perifert blod mononukleære celler i bugspytkirtelkræft Patienter Identificerer nye gener med Potentiale Diagnostic Utility. PLoS ONE 6 (2): e17014. doi: 10,1371 /journal.pone.0017014

Redaktør: Ludovic Tailleux, Institut Pasteur, Frankrig

Modtaget: December 7, 2010; Accepteret: 19 januar 2011; Publiceret: 10. februar, 2011

Copyright: © 2011 Baine et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health (RO1 CA131944, RO1 CA78590, RO1 CA 133.774, EDRN UO1 CA 111.294, og SPORE P50 CA127297). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Den UNMC Microarray Core Facility modtager delvis støtte fra INBRE Program af National Center for Research Resources, NIH tilskud nummer P20 RR016469

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i bugspytkirtlen (PC) er fortsat en dødelig malignitet med et samlet fem års overlevelse på kun omkring 5% [1]. En væsentlig bidragsyder til dårlig prognose af pc patienter er den manglende opdage tumoren på et tidligt og potentielt resektabel scene. Det skønnes, at kun 8% af PC tilfælde er diagnosticeret med tumorer lokaliseret til bugspytkirtlen, mens kun 15-20% anses resektabel. Endvidere af de patienter, der har haft deres tumor resektion, kun 20% bor mere end 5 år efter diagnosen [2]. Den mest almindelige dødsårsag efter resektion er fjerne metastaser; lokalt recidiv er sjældne. Selvom undersøgelser, der viser forlænget overlevelse i PC patienter er sjældne, er der ingen tvivl, at tidlig påvisning og resektion af PC, især i en lokaliseret tilstand, sandsynligvis ville give en signifikant stigning i overlevelse.

Design en tidlig diagnostisk test til PC dog udgør en særlig udfordring på grund af den relative sjældenhed af sygdommen og det faktum, at sygdommen ofte forbliver asymptomatisk, indtil et fremskredent stadium. Ideelt set ville en tidlig diagnostisk test til PC være minimalt invasiv, og relativt billig, og samtidig være tilstrækkelig følsom til at identificere alle eller de fleste tilfælde af PC. Når det kombineres med en meget specifik bekræftende test, kunne det potentielt tillade tidlig identifikation af patienter med resektabel sygdom.

CA19-9 er i øjeblikket den eneste markør godkendt af FDA til brug i PC. Men mens CA19-9 er nyttig som en markør for sygdom byrde, mangler både følsomhed og specificitet, det (ca. 80% og 73%) som en diagnostisk markør [3] – [8]. Ikke desto mindre er det fortsat guldstandarden, som hver enkelt potentiel biomarkør sammenlignes. I de senere år har flere nye lovende biomarkører opstået som potentielt kan påvise tidlige stadium PC enten i vævene (MUC4, MUC1, CECAM1) eller i blod (MIC-1, NGAL, telomerase og microRNAer) [9]. Ingen af ​​disse potentielle biomarkører er fri for væsentlige defekter, der viser følsomheden og /eller karakteristika, som enten er dårlig eller svingende mellem studier. Således er der et klinisk behov for nye markører til tidlig diagnosticering af PC.

Perifert blod mononukleære celler (PBMC’er) omfatter de cirkulerende mononukleære celler, herunder monocytter, T-celler, B-celler og naturlige dræberceller (NK-celler), og er dukket op i de seneste år som surrogatmarkører for flere sygdomme, herunder inflammatoriske (f.eks præeklampsi, leddegigt og kronisk pancreatitis) og maligne (kronisk lymfatisk leukæmi og renalcellecarcinom) sygdomme [10] – [14]. Men fortsat begrænset, deres rolle i påvisning og prognosticering af solide tumorer. I den foreliggende undersøgelse har vi den hypotese, at en ændring i den globale genekspressionsprofilen af ​​PBMC’er forekommer hos patienter med PC og identifikation af PC-specifikt gen delmængder i PBMC’er kunne være potentielt nyttige til tidlig påvisning af dette malignitet.

den seneste udvikling har tilladt udviklingen af ​​gen-chips, der indeholder et sæt af sygdomsspecifikke gener for enten diagnose eller forudsige prognosen af ​​flere maligniteter, herunder bryst- og esophageal kræft [15] – [18]. Resultaterne af vores undersøgelse tyder på, at en otte-gen prædiktor sæt (udvalgt fra 383 differentielt udtrykte gener ud af 39.200 gener) kan skelne mellem PC og raske individer med en følsomhed og specificitet på 83% og 64%.

Materialer og metoder

studiepopulation

undersøgelsen af ​​blod-baserede biomarkører i PC blev godkendt af Institutional Review Board (IRB) på University of Nebraska Medical center (UNMC) (IRB nummer 209-00). Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter og kontroller inden indskrivning i undersøgelsen. For denne undersøgelse, 26 PC patienter og 33 alder, race og køn matchede raske kontrolpersoner blev rekrutteret. I alt 35 prøver blev opnået fra pc’en og 33 fra den raske gruppe. Baseline demografiske oplysninger for begge grupper er beskrevet i tabel 1.

Diagnosen PC var baseret på en positiv biopsi af en pancreas masse eller en metastatisk læsion. PC-patienter blev yderligere klassificeret som lokaliseret (trin 1 og 2a) eller ikke-lokaliseret (fase 2b og højere), før eller efter kirurgi, og før eller efter kemoterapi. En patient blev klassificeret som værende post-kirurgi, hvis de havde gennemgået en pancreaticoduodenectomy før prøven blev trukket. Alle andre prøver, herunder prøver fra patienter, der aldrig har haft kirurgi i løbet af deres sygdom, blev klassificeret som præ-kirurgi. Enhver prøve trukket før patienten havde undergået nogen kemoterapi til PC blev klassificeret som præ-kemoterapi. Hvis patienten nogensinde havde haft kemoterapi til PC, uanset om denne patient blev undergår kemoterapi på det tidspunkt prøven uafgjort, blev prøven klassificeret som post-kemoterapi. For patienter, hvor flere prøver blev trukket på forskellige datoer, blev alle prøver anvendt i dataanalyse medmindre det udtrykkeligt er angivet i resultatafsnittet

PC iscenesættelse var baseret på en af ​​fire kriterier:. 1) patologisk iscenesættelse post- kirurgi, 2) MR /CT /ultralyd staging, 3) endoskopisk stadieinddeling, eller 4) biopsi af metastatisk sygdom.

Isolering af totalt RNA fra PBMC’er

PBMCer blev isoleret fra helblod ved anvendelse af PharmLyse RBC lysis opløsning (BD, San Jose, CA) ifølge producentens instruktioner. Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse af Qiagen RNAeasy RNA-isolering (QIAGEN, Valencia, CA, USA) og derefter omdannet til cDNA under anvendelse af SuperScript II-cDNA-syntese kit (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge en tidligere offentliggjort protokol [19].

cDNA microarray analyse af globale genekspression profil PBMC’er

microarray analyse blev udført af UNMC microarray core facilitet hjælp etableret lab-protokollen på en Phalanx hele genomet cDNA microarray indeholder 30,275 funktioner sondering for ca. 22.000 unikke gener. En universel menneskelig reference (Stratagene, kat: 740000, Cedar Creek, TX) blev anvendt som reference, som alle prøver blev normaliseret

Statistisk analyse

Log

2 transformation blev anvendt. til alle forhold efterfulgt af normalisering til “center” hver array ved hjælp af Lowess glattere gennem BRB ArrayTools udviklet af Dr. Richard Simon og Amy Peng [20]. Helst gen, hvori procentdelen af ​​pletter mangler eller filtreres ud over 50% var udelukket. Dobbelte pletter blev ikke gennemsnit, men behandles som separate gener til analyse. Blandede effects modeller blev derefter til at bestemme, hvilke gener betydeligt blev differentielt udtrykt mellem pc’en og de sunde kontrolgrupper, der giver mulighed for en 10% falsk opdagelse sats. Diagnose gruppe (kræft vs normalt) blev inkluderet i modellen som en fast effekt og en tilfældig emne effekt blev også inkluderet for at tage højde for flere prøver pr person.

Hierarkisk klyngedannelse analyse af arrays baseret på lighed udtryk profiler blev udført ved anvendelse af normaliserede og log

2-transformerede data. Clustering blev udført ved hjælp af Gene Cluster version 3.0, ved hjælp af “centreret” Pearson korrelation lighed metriske og komplet kobling klyngedannelse metode, og visualiseres ved hjælp af Java TreeView.

Validering af microarray data Q-RT-PCR

mikroarrayet resultaterne blev valideret ved kvantitativ realtids-PCR (Q-RT-PCR). Alle Q-RT PCR-reaktioner anvendte SYBR green baseret kemi. For validering, seks af de mest differentielt udtrykte gener: 3 opreguleret (

ANKRD22, ANXA3, ARG1

) og 3 nedreguleret (

FCER1A, GRAMD1C, og MS4A1

) ved microarray var valgt. Validering blev gjort i en tilfældigt udvalgt delmængde af de oprindelige prøver (indsendt til microarray analyse), der omfattede ni raske kontrolpersoner og tolv PC patienter. Fold-ændring i genekspression blev bestemt ved 2

-ΔΔCt metode under anvendelse af samme humane henvisning RNA som der blev anvendt i mikroarrayet. At bestemme korrelationen mellem mikroarrayet og Q-RT-PCR resultater, vi beregnet median gange ændring i ekspression (for et givet gen) til PC vs. raske kontroller, og sammenlignet det med den fold-change set af microarray at bestemme, om genet var stadig udtrykkes forskelligt i den samme retning.

Korrelation af gen signaturer med clinicopathologic karakteristika i PC

for at afgøre, om der er den differentielle ekspression af gener i PC patienter korrelerer med patientens karakteristika, en blandet effekter model blev anvendt på pc-prøver, der blev grupperet efter følgende kriterier: kirurgisk status (før vs. post-kirurgi), kemoterapi status (før vs. efter kemoterapi), historie af type-II-diabetes mellitus før diagnosen PC (stede vs. fraværende), placering af tumor (head vs. organ /hale), og fase af PC (lokaliseret vs. ikke-lokaliseret, og metastatisk vs. ikke-metastatisk). Væsentlige gener blev valgt ud fra en tilladelig falsk opdagelse på mindre end 10%. Stage 1a og 2a PC blev anset lokaliseret, mens trin 2b, 3, og 4 stk blev betragtet som ikke-lokaliseret, og scene 4 tumorer blev anset metastatisk. For to patienter rekrutteret til undersøgelsen, ikke kunne opnås oplysninger om tumor scenen, tumor placering og historie af type-II-diabetes mellitus.

Identifikation af et gen, forudsigelse sæt, der adskiller PC fra raske individer

BRB-ArrayTools Version 3.8.0 blev brugt til at analysere alle mulige kombinationer af de 21,671 gyldige gener identificeret ved microarray at afgøre, om en genetisk signatur kunne identificeres som ville adskille PC patienter fra raske kontrolpersoner med den optimale kombination af følsomhed og specificitet . De microarray data for 24 tilfældigt udvalgte pc-prøver og 20 raske kontrolpersoner blev indgået i analysen. Gener, der skal vælges til prædiktor sættet skulle være væsentligt forskellig mellem PC og sunde kontrolgrupper med et signifikansniveau på p ≤ 0,0001 og med en fold forskel udtryk mellem de to grupper ≥ 1,5. Krydsvalidering af genet prædiktor sæt blev gentaget 1 gange K-fold (K = 10). Genet prædiktor sæt nås gennem disse metoder blev analyseret ved forskellige metoder, herunder Compound kovariat Predictor, Diagonal Linear Discriminant Analysis, 1-Nærmeste nabo, 3-nærmeste naboer, Nærmeste tyngdepunkt, Support Vector Machines, og Bayesian forbindelse kovariat Predictor. Af disse er forbindelsen covariat Predictor gav de bedste prædiktive kapaciteter ved hjælp af gen prædiktor sæt og følgelig anvendes.

Validering af genet prædiktor indstillet

Når prædiktor sæt blev etableret, blev det valideret i et andet sæt af tilfældigt udvalgte PC og sunde prøver. Den statistiker blev blindet til identiteten af ​​prøverne. Anvendelse af cut-off opnået gennem Compound kovariant forudsigelse metode blev prøverne klassificeret som enten “PC” eller “ikke-PC”. Analysatoren (M.B.) blev derefter afblindet og nøjagtigheden af ​​forudsigelsen bestemt ved sammenligning med den faktiske diagnose. Vi anvendte også den samme ligning til en delmængde af præ-kemoterapi pre-kirurgiske PC patienter for at bestemme evnen af ​​forudsigeren indstillet til at klassificere patienter korrekt i PC vs. ikke-PC. Dette er vigtigt, da indflydelsen af ​​kemoterapi og /eller kirurgi på genekspressionsprofilen af ​​PBMC’er kan ikke udelukkes. Endvidere sidstnævnte gruppe patienter repræsenterer det ideelle patientpopulation, hos hvem testen, hvis de er valideret ville blive anvendt i et klinisk miljø.

Resultater

Efter normalisering og filtrering af microarray data, 21.671 gener forblev til analyse. Af disse blev 383 gener fundet at have en signifikant forskellen udtryk mellem PC patienter og raske kontroller (tabel S1). Af disse blev 65 gener observeret at have en differentieret udtryk ≥1.5 gange mellem de to grupper (tabel 2-3).

En hierarkisk klyngedannelse af microarray data identificeret to klynger af prøver, der er vist i figur 1 og i dendrogram formular i figur 2, en PC-gruppe og en sund kontrolgruppe. To PC prøver dog grupperet med raske kontrolpersoner, mens en sund kontrol faldt i klyngen, der indeholder størstedelen (32/35) af de pc-prøver. Derudover gjorde genekspressionsprofilen af ​​én pc prøven ikke klynge med enten raske kontroller eller de andre PC prøverne.

Hierarkisk klynge analyse af globale genekspression profil ved cDNA hele genomet microarray sammenligne sund kontrol og pc prøver ved anvendelse af alle gener viser sig at være statistisk forskelligt udtrykt mellem de to grupper (FDR 0,10, n = 383 gener). I intet tilfælde samlet var prøver.

Red

angiver gener, hvis udtryk er forhøjet i forhold til den universelle menneskelige reference (bruges til at normalisere alle arrays) og

grøn

angiver gener, hvis udtryk er reduceret i forhold til den universelle menneskelige reference.

En dendrogram af prøve beslægtethed fra bundtet analysen vist i figur 1 under anvendelse af de statistisk signifikante differentielt udtrykte gener. Prøver grupperet på hovedgrupper, der tilpasser godt med klassificering af PC eller HC. PC PBMC prøverne er angivet med

grå søjler

mens sunde PBMC prøver er angivet med

gule stænger

.

Q-RT-PCR Validation

Seks af de mest differentielt udtrykte gener (

ANKRD22, ANXA3, ARG1, FCER1A, GRAMD1C

, og

MS4A1

) blev valgt til validering af Q-RT-PCR i en tilfældigt udvalgt delmængde af 21. PBMC prøver (bestående af 12 stk prøver og 9 raske kontrolprøver fra den oprindelige 68 anvendes i microarray). Medianen fold udtryk for fem af dem var i den samme retning som i microarray, giver os en validering på 83%.

FCER1A

var det eneste gen, for hvilket en positiv korrelation ikke blev opnået. Resultaterne er afbildet i tabel 4.

Korrelation af PBMC udtryk profil med clinicopathologic egenskaber

For at afgøre, om en sammenhæng eksisterede mellem PBMC genekspression profil i pc-patienter og klinisk relevant patient egenskaber, vi delte pc prøver baseret på kirurgisk status (23 pre-kirurgi vs. 12 efter kirurgi), historie af kemoterapi (15 pre-kemoterapi vs. 20 efter kemoterapi), diagnose af type-II-diabetes mellitus før diagnose af PC (14 med en positiv historie vs. 19 med en negativ historie), placering af den primære tumor (25 hoved vs. 8 krop /hale), og fase af pc på diagnose (6 lokaliseret (etape 1 /2A) vs. 12 ikke-lokaliserede ikke-metastatisk (fase 2B /3) vs. 15 metastatisk (fase 4) PC). Men vi ikke observere nogen signifikant forskel i genekspression mellem nogen af ​​disse patientgrupper, der anvender kriteriet om en FDR. 10%

Gene Predictor Set

Vi undersøgte næste, om vi kunne identificere en minimal gen-forudsigelse sæt, der nøjagtigt ville diskriminere PC tilfælde fra raske kontroller. For at gøre dette, blev 44/68 prøver omfatter 24 PC og 20 raske kontrolprøver tilfældigt valgt. Alle 21,671 gener for hver af prøverne blev indgået i analysen. En otte-gen prædiktor sæt blev opnået, og består af

SSBP2, Ube2b-RS1, CA5B, F5, TBC1D8, ANXA3, ARG1

, og

ADAMTS20

. Brug af Compound kovariant Prediction Method (CCPM), denne indikator sæt gav en korrekt klassificering af PC vs. ikke-PC med en nøjagtighed på 73%, hvilket giver en følsomhed på 71% og en specificitet på 75%. Vægtene givet til hvert gen under anvendelse af CCPM var -4,97, -4,83, -4,38, 4,43, 4,44, 4,53, 4,84, og 4,96 henholdsvis med en tærskelværdi på 38,98 således at hvis Σ

i

w

i

x

jeg var tærsklen for en prøve blev det forudsagt som værende fra en PC patient (hvor

w

i = gen vægt,

x

i = log

2 genekspression intensitet).

Validering af Gene Predictor Set

Brug denne otte-gen prædiktor sæt, klassificering af en prøve som værende enten pc eller en sund kontrol blev forsøgt i et blindet måde ved hjælp af et prøvesæt bestående

kun

af prøverne, der ikke blev brugt til at skabe den prædiktor sæt (dvs. 24/68). I denne blindet validering, under anvendelse af ligningen udledt ovenfor, genet prædiktor indstillet forudsiges nøjagtigt diagnosen PC med 73% nøjagtighed, hvilket giver en følsomhed på 83% og en specificitet på 64%.

I et forsøg på yderligere at teste potentialet diagnostiske anvendelighed af dette gen prædiktor sæt, en ny delmængde af prøver, bestående af 12 stk prøver opnået fra patienter, der var både før kemoterapi og præ-kirurgi, sammen med et tilsvarende antal af tilfældigt udvalgte raske kontroller, blev igen blindet og analyseres for at forudsige deres klassificering. Denne gang otte-genet prædiktor var i stand til korrekt at klassificere disse prøver 79% af tiden, hvilket giver en 83% sensitivitet og 75% specificitet for diagnosen.

Diskussion

I de senere år har det gentagne gange blevet påvist, at genetisk ekspression i PBMC’er ændres i forbindelse med malignitet [13], [14], [21], [22]. Denne observation af en ændret PBMC genetisk ekspression profil hos kræftpatienter blev først rapporteret i diffust storcellet B-celle lymfom og kronisk lymfatisk leukæmi og senere forlænges ud over blodkræftsygdomme gennem analyse af PBMC udtryk profilering hos patienter med fremskreden renalcellecarcinom (RCC) [ ,,,0],13] – [14]. I begge blodkræftsygdomme og RCC, blev det rapporteret, at variationen i genekspression mellem patienter med sygdom og raske kontrolpersoner var meget større end den inter-prøve variation observeret for de raske patienter alene, hvilket tyder på, at PBMC’er kunne være nyttige surrogatmarkører med potentiale diagnostiske og prognostiske anvendelser i cancer. Endvidere er der i RCC blev det vist, at en 8-gen klassifikator sæt udviklet fra de differentielt udtrykte gener kunne forudsige diagnosen malignitet med 100% nøjagtighed [14].

For nylig Huang et al. har rapporteret, at en differentieret genekspression profil findes i PBMCer fra PC patienter [22]. Mens denne undersøgelse også brugt microarray og Q-RT-PCR validering at etablere differentieret genetisk ekspression i det perifere blod af pc patienter, dens formål var at etablere potentielle biomarkører, der kunne differentiere nydiagnosticerede diabetespatienter med pc fra diabetikere uden PC. Mens undersøgelsens forfattere rapporteret, at 48 gener differentielt blev udtrykt mellem PC patienter og raske kontrolpersoner med microarray blev kun 8 prøver anvendt i hver af de to grupper, og de gav ikke yderligere oplysninger om disse gener. Den mindre stikprøvestørrelse og mangel på blindet validering yderligere kontrast denne undersøgelse med denne rapport. Derudover har vi ikke finde nogen signifikant differentielt udtrykte gener baseret på historien om enten før kirurgi eller kemoterapi, historie af type-II-diabetes mellitus, eller fase af PC i vores undersøgelse. Vigtigere, studiet af Huang et al. udnyttet

GAPDH

som husholdning gen mod hvilken ekspressionen af ​​hvert gen blev normaliseret. I vores undersøgelse dog bemærkede vi, at

GADPH

var en af ​​de mest signifikant overudtrykt gener i PBMCer fra PC patienter. Opregulering af

GAPDH

er også blevet rapporteret i flere maligniteter, herunder æggestokkene, skjoldbruskkirtel, hepatocellulær og pancreascancer [23] – [26]. Valget af den ideelle interne reference gen i studier, der undersøger potentielle kliniske biomarkører ved microarray fortsat et vigtigt spørgsmål, som bliver nødt til at blive behandlet i fremtidige studier.

Denne foreliggende undersøgelse er den første dybdegående analyse af transkriptomet af PBMC’er fra patienter med PC sammenlignet med raske kontroller, og kun den tredje forekomst af en sådan profilering for faste tumorer i almindelighed. Etablering af en sådan differentieret udtryk har potentiale til at give en rig samling af potentielle gener for yderligere forfølgelse som nye diagnostiske eller terapeutiske mål. Endvidere gen net identificeret i vores undersøgelse give hidtil ukendte indsigt i disregulering af immunsystemet i PC (figur 3). Med det faktum, at kun 15-20% af pc-patienter er diagnosticeret med resektabel sygdom og givet den stædige modstand af malignitet at kemoterapi og strålebehandling, tidlig påvisning af sygdommen giver det største håb for en umiddelbar indflydelse på at forbedre patientens prognose.

Alle viste gener fandtes at være nedreguleret større end 1,5 gange. Den pågældende mængde differentiel ekspression pr gen samt den angivne funktion kan ses i tabel 3. Den differentielle ekspression af disse gener viser, at der er en global nedgang i celleantal, aktivering, og effektiviteten af ​​det adaptive immunsystem hos patienter med PDAC der kan have en betydelig effekt på både deres sygelighed og dødelighed. Stiplede linjer angiver associering af celler, mens optrukne linier angiver differentiering eller proliferation af en særlig celletype. Tal repræsenterer enkelte punkter for interaktion mellem gener og immunforsvar differentiering og respons pathway: 1, Præsentation af antigen til Th0 celler; 2, Differentiering af Th0 celler ned Th1 eller Th2-vejen; 3, Immun celleproliferation; 4, Stimulering af cytotoksisk T-celleaktivitet af Th1-celler; 5, Stimulering af humorale immunitet ved Th2 celler; 6, anerkendelse og respons til at målrette celler ved cytotoksiske T-lymfocytter (CTL); 7, Differentiering af naive B-celler; 8, Lyse af målceller ved CTL’er. Breve repræsenterer individuelle cellepopulationer: a, cytotoksiske T-lymfocytter (CTL); B, B-celler. Fald i gener, der er forbundet med punkter a og b kan repræsentere et fald i deres respektive tilhørende celle befolkning.

Potentialet for PBMC differential genekspression profilering, eller af et forudbestemt gen prædiktor sæt etableret fra det , at være nyttig til tidlig diagnosticering af PC er teoretisk ganske høj; især når det vurderes, at de to mest sandsynlige mekanismer bag denne forskel udtryk er immunsystemets genkendelse af kræft og unddragelse af immunsystemet ved kræft. Mens andre biomarkører, såsom CA19-9, frigives fra cancercellerne og således stiger med stigende tumorbelastning, differentiel ekspression i PBMC’er kan begynde, i det mindste delvis, så snart cancer immunogenicitet eller immun svig er etableret. Immunsystemet unddragelse har vist sig at blive påbegyndt så tidligt som præ-malign sygdom i PC, hvilket understøtter den forudsætning, at analysen af ​​differentiel genekspression i immunceller kan tilbyde muligheden for at opdage en neoplastisk læsion endnu før det får invasive kapaciteter [27] .

Selvom denne undersøgelse ikke selv forsøge at se på de tidlige diagnostiske evner PBMC’er, de opnåede fra arbejdet resultater er et nødvendigt første skridt i retning af en multiplex assay baseret på ændring af genekspression i PC til potentielle anvendelse i høj risikogrupper [28]. Det faktum, at en 8-gen prædiktor sæt var i stand til at etablere en følsomhed på 83% med en specificitet på mellem 64 og 75% i et blindet sæt prøver er lovende og skal valideres i en stor prøve sæt. Mens antallet af prøver er for lille til at udføre nogen yderligere detaljeret analyse, den omstændighed, at følsomheden for genet prædiktor sæt ikke faldt når de anvendes på PC patienter før kemoterapi eller kirurgi peger mod den potentielle anvendelighed af denne 8-gen prædiktor sæt i en diagnostisk indstilling, det vigtigste område, hvor CA19-9 mangler [4] – [8]. Derudover PBMC genekspression analyse er ikke mere invasiv af en test end CA19-9, begge er modtagelige for en simpel venopuncture, og den samlede analyse behøver ikke være væsentligt dyrere end de nuværende kliniske metoder til afprøvning CA19-9. Hvis der kun anvendes 8-genet klassificeringen sæt til analyse, kunne PBMC test opnås ved brug af mini-cDNA microarray chips eller via multiplex PCR-reaktioner, som begge er klinisk levedygtige og ville være forholdsvis enkelt at føje til repertoiret af tests leveret af en standard klinisk laboratorium.

Ud over diagnostiske potentiale i denne PBMC differentiel ekspression profil, de normale funktioner og retning af differentiel ekspression af hvert af generne, især 65, der var ≥1.5 fold differentielt udtrykt, antyder potentielle patofysiologiske mekanismer. 18/65 gener har potentiale til direkte sænke T-celleproliferation, T-celle-receptor signalering, eller cytotoksisk T-lymfocyt (CTL) cytotoksicitet, mens fire direkte kan modulere et fald i B-celle-aktivering /differentiering eller signalere et fald i antallet af cirkulerende B-celler. Tre af de gener kan direkte reducere cytotoksiciteten af ​​NK-celler, og to kan falde makrofagreaktion. Tilsammen resultaterne af vores undersøgelse tyder på, at PC er kendetegnet ved et signifikant fald i evnen af ​​immunsystemet til at reagere på ikke-selv-antigener, herunder tumor-associerede antigener, som opsummeret i figur 3. En delvis antydning om mekanismerne bag denne immun kompromis kan komme fra den observerede opregulering af

ARG1

, observeret at være opreguleret mere end 2-fold i PBMC’er af pc patienter. Et udtryk for ARG1 er nært forbundet med en stigning i tilstedeværelsen af ​​myeloide afledte suppressorceller (MDSCs) [29]. MDSCs er klassisk kendt for at falde CTL-respons, hovedsagelig gennem destabilisering af T-cellereceptorer og nedsat ekspression af visse CD3 undertyper, i sidste ende fører til CTL apoptose. Dog er MDSCs kendt for specifikt at forårsage nedregulering af CD3Z, som ikke blev vist at være differentielt udtrykt i PBMC’er analyseret i denne undersøgelse [29]. Derudover er MDSCs kendt for at forårsage en kanalisere af immunsystemet væk fra cellulær immunitet og mod humoral og allergisk respons immunitet, en egenskab, der ikke er tydeligt angivet i PBMC differentiel ekspression data. Omvendt fremgår det (fra ændringen i genekspression), at antallet af cirkulerende B-celler er faldende, mens både

FCER1A

, en receptor centralt for allergisk reaktion og

MS4A1

, som spiller en rolle i B-celle til plasma celledifferentiering, er nedreguleret. Medens MDSCs kan spille en rolle i modulering den differentielle ekspression set i PBMCer fra PC patienter, de sandsynligvis fungere sammen med andre mekanismer til at påvirke en nedregulering af både kroppens cellulære og humorale immunrespons maskiner.

En sammenligning af genekspressionsprofilen observeret i vores undersøgelse med det rapporterede i andre sygdomme afslørede lidt lighed med andre godartede (præeklampsi, rheumatoid arthritis (RA), og kronisk pancreatitis (CP)) og maligne sygdomme (RCC). I alt, 6 gener (

CD160, GOLGA8B, RABGAP1L, MMP8, CRISP3

, og

ARG1

), der viste sig at være udtrykkes forskelligt i PBMC’er af patienter med præeklampsi blev også forskelligt udtrykt i PBMCer fra PC patienter, med 4 (

CD160, MMP8, CRISP3

, og

ARG1

) er differentielt udtrykt i samme retning (1% ensartethed) [10]. Tolv gener (

BTG2, CCND3, CD151, CD7, Clu, CTSB, KLRK1, SPN, GSTO1, PCMT1, PRDX6

, og

PRF1

), der viste sig at være udtrykkes forskelligt i PBMC’er af patienter med RA blev også udtrykkes forskelligt i PBMCer fra PC patienter, hvoraf 8 (

CCND3, CD151, Clu, CTSB, GSTO1, PCMT1, PRDX6

, og

PRF1

) var i samme retning (2% ensartethed) [11]. To gener (PDE3B og GADD45a) fundet at være differentielt udtrykt i PBMCer fra CP-patienter blev også udtrykkes forskelligt i PBMCer fra PC patienter, hvoraf ingen bliver differentielt udtrykt i den samme retning (0% ensartethed) [12].