PLoS ONE: Identifikation af Androgen receptor Splice Varianter i PTEN Mangelfuld Murine prostatakræft Model

Abstrakt

Androgen receptor (AR) varianter er forbundet med resistens over for anti androgen terapi både i humane prostata cancer cellelinjer og klinisk prøver. Disse observationer støtter den hypotese, at AR isoform akkumulering er en konsekvens af selektivt terapeutisk pres på den fulde længde AR. Den PTEN mangelfuld prostatakræft model fortsætter med veldefinerede kinetik, herunder progression til kastrationsresistent prostatacancer (CRPC). Mens kirurgisk kastration og enzalutamide behandlinger giver en initial terapeutisk respons,

PTEN

– /-

epitel fortsat formere udbytte lokalt invasiv primær tumor patologi. At de fleste epitel forbliver AR positiv, men ligand uafhængig, antyder tilstedeværelsen af ​​onkogene AR varianter. For at løse denne hypotese har vi anvendt et panel af nyligt beskrevet

PTEN

– /-

tumorcellelinjer afledt af både hormon intakt (E4, E8) og kastrerede PTEN mutanter (CE1, CE2) efterfulgt ved RACE PCR at identificere og karakterisere tre nye afkortede, aminoterminus indeholder AR-varianter (mAR-Va, b, c). Varianter synes ikke kun bevares gennem hele progression men er korreleret med næsten fuldstændig tab af fuld længde AR (AR-FL) på kastrationsniveau androgen niveau. Overekspressionen af ​​varianter fører til øget transkriptionel aktivitet af AR mens banke ned undersøgelser viser reduceret transkriptionel output. Kollektivt, identifikation af trunkerede AR varianter i den betingede PTEN sletning model understøtter en rolle for at opretholde CRPC fænotype og giver yderligere terapeutiske anvendelser af denne præklinisk model

Henvisning:. Liang M, Adisetiyo H, Liu X, Liu R, Gill P, Roy-Burman P, et al. (2015) Identifikation af androgen receptor Splice Varianter i PTEN Mangelfuld Murine Prostata Cancer Model. PLoS ONE 10 (7): e0131232. doi: 10,1371 /journal.pone.0131232

Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, ØSTRIG

Modtaget: April 1, 2015; Accepteret: 29 maj 2015; Udgivet: 21 jul 2015

Copyright: © 2015 Liang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information fil

Finansiering:.. Dette arbejde blev støttet af NIH tilskud RO1CA059705 til PR, PCF Young Investigator Award og Icahn School of Medicine kræftforskning tildelt DJM

konkurrerende interesser: forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostata kræftceller er blevet antaget at gå videre til kastration modstand gennem et væld af androgen receptor (AR) modifikationer. herunder amplifikation, gen omlejringer eller mutationer, ændret ekspression af transkriptionelle co-regulatorer og

de novo

steroidogenese [1-6]. For nylig har undersøgelser med human prostatacancer-cellelinier og væv identificerede tilstedeværelsen af ​​AR splejsningsvarianter (AR-Vs), som kan opreguleres som respons på kastration og fremme resistens over for androgen receptor målrettet terapi [7-9] [10 ] [11]. Androgenreceptoren tilhører steroidreceptoren transkriptionsfaktor familie og er sammensat af en N-terminal transkriptionelle aktiveringsdomæne (NTD, exon1), DNA-bindende domæne (DBD, exon 2 og 3), en hængselregion (exon 4), og den C-terminale ligandbindingsdomæne (LBD, exon 4-8) [12,13]. Til dato op til 15 forskellige AR-Vs mangler forskellige dele af LBD er blevet rapporteret i humane prostata cancer cellelinjer CWR-R1, 22rv1, VCAP og LuCaP xenografter [14-21]. På trods af dette, AR isoformer forbliver langt dublerede i prækliniske musemodeller af prostatakræft væv er begrænset til to AR-Vs som rapporteret ved brug af Myc-CaP cellelinje [15]. Til dato er der ikke rapporteret om AR varianter fra den primære organ i et præklinisk musemodel for prostatakræft.

PTEN

null musemodel af prostatakræft er dårligt lydhøre over for androgen ablation behandling inklusive kirurgisk kastration og androgenreceptor målrettet terapi [22] [23] [24]. Mens øget PI3K /Akt signalering har vist sig at give betydelige overlevelse stikord under kastrerede betingelser, forbliver de fleste epitel androgen receptor positiv. Denne iagttagelse rejser den mulighed, at ligand uafhængige former af androgen receptor kan eksistere lette overlevelse og fortsatte progression. Vi har taget en flerstrenget tilgang til at løse denne hypotese herunder karakterisering og anvendelse af flere roman, PTEN mangelfulde, murine prostatakræft-cellelinier [25] [26] og tilsvarende primære tumor model.

Vi har identificeret tre hidtil ukendte varianter af androgenreceptoren (betegnet mAR-Va, b, c). Disse AR varianter alle indeholde AR-NTD med kun én indeholder en delsekvens overlap med AR-LBD. Den relative udtryk for disse varianter ikke kun øger reaktion på kastration, men som svar på AR målrettet behandling inklusive bicalutamid og enzalutamide. Bemærkelsesværdigt, efter progression på lang sigt af kastrationsniveauer androgen niveauer, observerede vi en signifikant reduktion i fuld længde AR men vedligeholdelse af de identificerede isoformer. Funktionelle undersøgelser viste, at overekspression eller vælte af AR-Va og AR-Vc kunne regulere AR transkriptionel output.

Kollektivt, støtte vores data tilstedeværelsen af ​​nye AR varianter, der kan tjene som vigtige bidragsydere under progression til CRPC. Variant identifikation også væsentligt forbedrer anvendeligheden af ​​PTEN null prostatakræft model både med hensyn til at forstå funktionen af ​​AR og som et system til vurdering af behandlinger rettet mod resistente former af androgen receptoren.

Resultater

Identifikation af nye AR varianter i cellelinjer afledt af PTEN null prostatakræft model

Som en del af vores undersøgelser af androgen receptor (AR) funktion og mekanismer CRPC progression, vi for nylig karakteriseret fire nye murine prostatakræft cellelinjer afledt fra enten hormon intakt (E4, E8) eller kastreret (CE1, CE2)

PTEN

null mutant mus. Cellelinjer blev karakteriseret som værende

PTEN

– /-

have aktiveret PI3K /Akt signalering og funktioner i den primære tumor model [25] [26]. Til analyse for tilstedeværelsen af ​​androgen receptor (AR) varianter, vi anvendte 3′-RACE på cDNA’er genereret fra E8 og CE1 linjer ved hjælp fremad primere forankret i exon1 af muse AR (S1 tabel). Ved anvendelse af denne saglig tilgang, vi amplificeret AR mRNA’er med poly (A) haler herunder dem AR-Vs med potentielle hidtil ukendte 3′-sekvenser. Følgende med nested PCR, vi observeret flere unik sekvens produkter (figur 1a, S1 Fig). Som forventet den længste (~ 2 kb) bånd var den fulde længde AR (AR-FL) indeholdende sekvenser opstrøms for poly (A) -regionen, der matchede med 3’UTR af muse AR (MAR) mRNA. Kloning og sekvensanalyser af de ~ 850 bp PCR-produkter angivet eksistensen af ​​flere unikke mus AR-Vs (MAR-Vs) i E8 og CE1 celler. Vi fokuserede på tre unikke udskrifter. For det første at en kort AR isoform fundet i E8 linje, bevarer exons 1-4 fra Mar mRNA, efterfulgt af et unikt 175 bp sekvens fundet tilpasse til AR intronområde tilstødende til exon 4, som vi betegnet exon 4a (m4a) eller variant AR-Va (fig 1a og 1b). Den molekylære struktur AR-Va er analog med 5′-fastholde exoner 1-4, men som afviger i sammensætningerne af 3′-sekvenser af tidligere beskrevne muse Mar-V4 [15] og human ARV

567es [27]. Derefter blev to nye AR-Vs med potentielt unikke alternative splejsningssteder påvist i CE1 celler. Ved kortlægning deres sekvenser til musegenomet, fandt vi, at 442-bp og 495 bp sekvenser tilpasset til intron 1 og splejset exon 1, som vi nævnt M1B og M1c varianter. For at undgå potentiel forvirring med nomenklaturen for ARV rapporteret i humane prostatakræft modeller, vi navngivet disse tre nye AR varianter som mus AR-Va, b, c (MAR-Va, b, c), hvoraf Mar-Va først blev identificeret i E8, med mAR-Vb og mar-Vc i CE1 (S1 fig). Anvendelse af de ovennævnte cellelinier bestemte vi de relative ekspressionsniveauer af hver variant. Interessant, mar-Va-ekspression var højest i E4 og E8 linjer mens MAR-Vb og Mar-Vc udviste højere udtryk i CE1 og CE2 linjer. Alle varianter var signifikant lavere i ekspression end AR-FL (S2 Fig).

a) Identifikation af MAR varianter (a, b, c) i afledte cellelinier visualiseret under anvendelse af konventionel PCR. b) Real time PCR evaluering af AR varianter amplificeret fra E8-celle-cDNA visualiseret ved gelelektroforese. c, venstre) Påvisning af AR isoformer i humane og mus prostata cancer cellelinjer og c, højre) densitometrianalyse af variant og AR-FL proteinekspression normaliseret til p-actin (*, p 0,05). d) Skematisk struktur MAR varianter (a, b, c) og AR fuld længde (AR-FL). Solid-farvede kasser repræsenterer de fælles exons af AR-FL og udklækket kassetter angiver kryptiske exons. Fed lige linjer henviser til de transskriberede sekvenser i deres mRNA’er. Den forudsagte aminosyresekvens oversat af m4a og M1c er noteret (lavere diagrammer).

Brug APE plasmid editor software var vi i stand til at udlede de molekylære vægte af Mar-Va som ~ 80 kDa og Mar- Vb, Vc at være ~ 54 og 56 kDa svarende til vores identificerede transskripter (fig 1d, S2 Table, S3 tabel). At undersøge, om AR-Vs kunne påvises på proteinniveau vi anvendte et antistof rettet mod animo terminalen af ​​AR (Santa Cruz, N-20) og undersøgt lysater fra E8, CE1 og kastrerede androgen derivater (E8-CSS, CE1 -CSS). Vurderet på sammen med de menneskelige linjer, LNCaP- og PC3, vi opdaget AR-FL (~ 110 kDa) og tre store bands, der er bosiddende på ~ 75 kD, 85kD og lavere arter ~ 50 kD og ~ 56 kD (fig 1c, S2 Table).

androgen ablation øger den relative ekspression af AR varianter

for yderligere at understøtte en rolle for AR varianter under CRPC, betragtede vi virkningen af ​​anti-androgen behandling. For at gøre dette, vi udfordrede E8 og CE2 cellelinier med enten kastrere androgen dyrkningsbetingelser (kul-strippet serum, CSS) eller Casodex (10 uM) i 3 dage. Slående, i CSS dyrkningsbetingelser vi observeret forøget udskrift udtryk i alle tre varianter med den største fold stigning observeret i Mar-Va i E8 celler (MAR-Va, 3,5 fold, MAR-Vb, 2,5 fold, MAR-Vc 2,2 fold, s 0,05), når normaliseret til fuld længde AR (figur 2a). Ved hjælp af Casodex, vi også observeret en statistisk signifikant forbedring af alle AR varianter ved hjælp af E8 og CE2 linjer (figur 2b).

a) Kultur af murine prostatacancer (E8) cellelinier med anti androgen behandling, herunder trækul strippet serum (CSS) (3 dage) eller b) Casodex (10 uM, 3 dage) resulterer i signifikant forøget ekspression af AR isoformer normaliseret til AR fuld længde. c) Kirurgisk kastration af PTEN mutanter (

C

+

; PTEN

L /L

, n = 7) resulterer i en signifikant stigning i den relative ekspression af AR isoformer som detekteret ved western blotting. d) AR variant udskrift udtryk fra

Wt

, hormon intakte og kastrerede mutant mus normaliseret til AR-FL niveauer (*, p 0,05, **, p. 0,01)

Vi derefter overvejet, om AR isoformer eksisterede

in vivo

hjælp hormon intakte PTEN-null tumorer (

C

+

; PTEN

L /L

, n = 6) og om progression på kastrationsniveauer androgen niveauer kan ændre deres udtryk. Under anvendelse operativt fjernede lapper i prostata (ventral, dorsal lateral, anterior) vurderede vi ekspression af ARs i hormon intakte mutanter ved 2, 13 og 23 måneder og påvist tilstedeværelsen af ​​AR-FL (~ 110 kD) og tre store varianter af reduceret størrelse omtrent 45-50, 64 og 75 kD (figur 2c). Af de 6 mutanter analyserede, vi kun observeret en i 13 måneder kohorte med reduceret AR-FL udtryk (*, stjerne). Slående, i PTEN mutanter, som blev kirurgisk kastreret (

C

+

; PTEN

L /L

; n = 7) vi observeret 6/7 for at have betydeligt tab af AR-FL men fastholdt udtryk for AR isoformer (fig 2c, højre). Kvantitativ RNA (q-PCR) måling af Mar-Va, b og c bekræftede højde af isoformer i hormon intakte og CRPC PTEN mangelfulde kræftformer med hensyn til

Vægt

prostata og normaliseret til AR-FL (Fig 2d ) (**, p 0,01). For yderligere at knytte tilstedeværelsen af ​​afkortede AR-Vs med kastrationsresistent progression, vi behandlede PTEN hormon intakte mutanter (

C

+

; PTEN

L /L

, n = 6) med enzalutamide (10 mg /kg,

via

mus chow

ad libitum

) i 10 uger, efterfulgt ved immunhistokemi hjælp antistoffer mod enten AR aminoterminalen (AR, N-20) eller AR c-terminus (AR, C-19). I overensstemmelse med biokemisk analyse, observerede vi meget lav påvisning af fuld længde AR men robust farvning for amino, indeholdende varianter (S3 Fig). Disse observationer indikerer, at progression på kastrationsniveauer androgen niveauer kan selektere mod den fulde længde AR men ikke AR varianter.

Den transkriptionelle aktivitet af fuld længde androgenreceptoren forstærkes af AR varianter

Vores

in vivo

analyse tyder på, at den relative ekspression af AR isoformer kan overleve under CRPC og fik os til at undersøge konsekvenserne af en relativ stigning i ekspression af mar-vs i PTEN mangelfuld prostatakræft. For at gøre dette, vi gennemført en række transkriptionelle assays ved anvendelse af PSA-luciferasereporterplasmid [28]. For det første, hver variant og AR-FL blev sub klonet til ekspressionskonstruktioner efterfulgt af ekspression validering anvendelse af Western blotting og AR (N-20) antistof (Fig 3a).

a) Western blotting under anvendelse af AR ( N-20) antistof bekræfter ekspression af klonede AR varianter i COS-1-celler. b) Overekspression af AR varianter i E8 celler behandlet med kontrol, DHT (0,03, 0,3 nM) eller DHT + Casodex (BiC, 1 pM). (Kontrol

vs

MAR-Va = sammenligninger 1-4;.. Kontrol

vs

MAR-Vc = sammenligninger 5-6) (*, p 0,05, **, p 0,01 ). c) Co-immunopræcipitationer fra COS-1 celler transficeret med AR-FL og enten AR-Va-myc (midten) eller AR-Vc-myc (til højre).

Vi fandt kontrol E8 celler til reagere på DHT på en dosisafhængig måde (0,03-0,3 nM) (fig 3b), mens CE1 cellerne ikke var responsiv til DHT medmindre exogen rotte AR-FL blev indført gennem transfektion (S4 fig). Vi næste overudtrykt Marva, b, eller c til E8 og CE1 celler og bemærkede, at MAR-Va isoform markant øget transkriptionel reporter aktivitet sammenlignet med kontrol plasmid transfektioner (søjlediagram sammenligninger 1-4, *, p 0,05, ** , p 0,01). Interessant, mar-Vc transfektion augmented reporter niveauer kun i overværelse af androgener (sammenligninger 5-6 *, p 0,05), mens MAR-Vb havde en statistisk ubetydelig effekt (p 0,05). (Fig 3b)

for at forstå en potentiel mekanisme, hvormed mAR-vs aktivere funktionen af ​​AR-FL, vi udførte co-immunopræcipitationer analyse for variant til AR-FL interaktion. Plasmider, der koder myc-tagget MAR-Va og MAR-Vc blev genereret for dette assay baseret på det fund, at disse to ARV kunne co-aktivere AR-FL i en af ​​flere af de testede cellelinier. AR negative, COS-1-celler blev transficeret med rotte-AR alene (+ tom vektor) eller i kombination med MAR-Va-myc (Va-myc) eller MAR-Vc-myc (Vc-myc) ekspressionskonstruktioner efterfulgt af immunopræcipitationer for Mar -va /Vc proteiner ved anvendelse af myc epitopen. Western blot analyser blev derefter udført under anvendelse af et antistof specifikt for den C-terminale ende af AR, som kun genkender AR-FL. Vi fandt 110 kDa AR-FL band til at være til stede i de Va-myc immunopræcipitater indikerer, at MAR-Va kunne danne et kompleks med AR-FL. da en betydelig AR-FL band ikke blev påvist i Vc-myc immunpræcipitater, vi udledte dog, at stabil kompleksdannelse var mindre effektiv eller ej dannet mellem AR-FL og AR-Vc-en observation, der er i overensstemmelse med væsentligt reduceret AR-Vb og AR-Vc medieret co-aktivering af PSA reporter (fig 3c). Disse data antyder, at forøget ekspression af MAR-Vs kan forøge stabiliteten af ​​AR-FL dermed forbedre androgenafhængig reporter assay output. Disse observationer er også lig dem, der opnås med human AR-V5, 6, 7ES [27].

Vi derefter overvejet effekten af ​​variant hæmning på PSA transkriptionel reporter output. For at gøre dette har vi designet Dicer substrat siRNA’er (DsiRNAs), der specifikt vil målrette Mar-Va eller c, men ikke fuld længde AR. Gennem transfektion af disse siRNA’er til E8 eller CE1-celler sammen med luciferase reporter plasmider, blev det observeret, at knockdown af enten Mar-Va og Vc reduceret AR transkriptionel aktivitet i begge cellelinier (figur 4a). Variant siRNA’er var lige potente i E8 celler, mens i CE1 celler, knockdown af MAR-Vc gav det mest robuste effekt (data ikke vist). Effektiviteten af ​​variant banke ned er eksemplificeret ved q-PCR målinger af Mar-Vc niveauer i kontrol og Mar-Vc-siRNA behandlede E8 celler (Fig 4b).

a) E8 celler blev transficeret med siRNAs rettet mod enten mar-Va eller c og evalueret for PSA-luc reporter aktivitet 48 timer senere (kontrol siRNA

vs

mAR-Va siRNA = sammenligninger 1-3;.. styre siRNA

vs

mAR-Vc siRNA = sammenligninger 4-7). b) Validering af siRNA knockdown af Mar-Vc målt ved q-PCR (*, p 0,05, **, p. 0,01)

Disse resultater viser, at MAR-Vs bidrage til AR transkriptionsaktivitet i både E8 og CE1 celler, og at deres hæmning imod AR-aktivitet. For yderligere at undersøge, hvordan aktiviteten af ​​AR-signalering kan modificeres under CRPC målte vi ekspressionsniveauer af AR målgen,

Fkbp5

[29], under anvendelse af to forskellige

in vivo

manipulationer. Først, vi kastreret

C

+

; PTEN

L /L

mutanter på 6 wks og analyseret mus ved 30 wks og andet vi slettede epitelial AR i PTEN mangelfulde prostata (

C

+

; PTEN

L /L

; Ar

L

/Y

) -a model vi tidligere har karakteriseret (S5 fig) [30]. Svarende til vores enzalutamide behandlede mutanter (S3 Fig), observerede vi reduceret /tab af ekspression af den distale AR targeting antistof (AR-C19) og holdt ekspression af aminoterminale targeting antistof (AR-N20). Sammenlignet med hormon intakte (AR +) regioner (S5b Fig, øverste venstre panel, AR + pile), blev FKBP5 udtryk væsentligt formindsket i kastrationsniveauer prøver. Som genetisk validering og kontrol for FKBP5 androgen afhængig modulation, vurderede vi AR og FKBP5 udtryk i PTEN-nul, AR-null regioner af

C

+

; PTEN

L /L

; AR

L

/Y

mutanter observere fuldstændig tab af epitelial AR (AR region) og nær tab af FKBP5 proteinekspression (S5b fig, øverst til venstre, Ar pile). Yderligere, ved anvendelse CRPC linier afledt fra PTEN null musemodel [30], vi valideret androgen aktivering af

Fkbp5

ved tilsætning af exogent androgen (S5c Fig). Disse data viser, at under kirurgisk eller genetisk induktion af CRPC i PTEN-null tumorgenese, er AR-FKBP5 signalering akse forringet.

Discussion

Overekspression af androgenreceptorer (ARS) forekommer i en signifikant antallet af sene fase prostatakræft herunder dem udvikler sig til kastration modstand. Identifikationen af ​​AR varianter i humane CRPC cellelinier og kliniske prøver tyder på, at AR varianter kan lette fortsat AR onkogen funktion trods af tilstedeværelsen af ​​AR målrettet terapi [31]. Dette kan tilskrives det faktum, at størstedelen af ​​AR-Vs identificeret hidtil forudsiges at kode for proteiner, der mangler LBD, men bibeholder den N-terminale transaktiveringsdomæne derved fungerer som konstitutivt aktive transkriptionsfaktorer. Dette indikerer, at AR LBD er undværlig for AR transkriptionel aktivitet og fortsat bidrag til cancer progression [27] [32] [33]. Som følge heraf forstå den proces, hvorved AR varianter opstår, og deres bidrag til fremkomsten af ​​CRPC er blevet et område med intens efterforskning.

Homologe systemer af prostatakræft (hormon afhængighed, kastration modstand og afledte cellelinjer) som opnået ved anvendelse af PTEN null model, giver en fremragende platform til at vurdere sygdommens initiering og progression [22]. Vores undersøgelse, der for første gang beskriver den naturlige forekomst af disse AR NTD varianter i PTEN deficiente mus prostatacancerceller og det primære organ site. Vigtigt er det, viser vi, at den identificerede AR-Vs er ikke statisk, men ændres i udtryk under CRPC progression. De tre mus AR varianter identificeret i denne undersøgelse er sammensat af nye molekylære strukturer. MAR-Va, som bevarer de sammenhængende exonerne 1-4 efterfulgt af gennemlæsning i intron 4 og er omtrent analog med den rapporterede MAR-V4 [15] og AR

V567es [27] med undtagelse af den unikke aminosyre kodes af 3′-enden. MAR-Vb og MAR-Vc er sammensat af to forskellige regioner, der ligger inden for intron 1 splejset efter exon 1, hvilket fører til den udledte AR-Vs proteinsekvensen kun indeholdende NTD. Den såkaldte AR-V8 identificeret i 22rv1 humane prostatacancerceller vises som den nærmeste menneskelige modstykke indeholdende AR-NTD efterfulgt af en længere 33-aa hale kodet af et exon 3 ‘placeret inden intron 3 [19]. Ligheden mellem identificerede mus varianter og dem, der tidligere er identificeret i humane cellelinjer, tyder på, at den cellulære stress hormon ablation terapi kan handle i fælles måde under selektion for varianter AR variant populationer

Seneste kliniske undersøgelser har vist HAR-V7 at være forhøjet i CRPC, metastase, association med biokemisk recidiv og dårlig klinisk resultat [11] [17] [18] [34]. En af de væsentligste konklusioner fra vores undersøgelse er muligheden for kastration eller AR målrettet terapi for at selektere for muse AR isoformer. Disse data ikke blot viser en yderligere mekanisme, ved hvilken

PTEN

deficiente prostatacancerceller kan udvikle sig til CRPC men har også betydelige virkninger for terapier bestemt til direkte målrette ligandbindingsdomænet af androgenreceptoren. Interessant, mens vi observeret forøget relative ekspression af mARVs i afledte cellelinier i kultur, ekspression af AR-FL blev opretholdt som er forskellig fra, hvad der blev observeret i mus primære tumorer. Dette kan tilskrives det monoklonale natur celle afledning

versus

den meget heterogene karakter af delprøver. Det kan også være forbundet med almindelig vedligeholdelse af cellelinier i hormon intakt betingelser

versus

de lange kastrationsniveauer betingelser, der anvendes til at opretholde primære tumorer. Den slående observation, at AR-FL faldt i progression på kastrationsniveauer androgen niveauer eller ved tilstedeværelse af kronisk enzalutamide eksponering, giver overbevisende støtte, AR-FL er valgt imod, og at ARV kan lette fortsatte AR funktion. Tidligere rapporter har vist, at

PTEN

null mutanter er dårligt lydhøre over for både kastration og enzalutamide terapi [23] [35] [24]. Vores data viste den relative stigning i AR-NTD-varianter, både

in vitro

in vivo

, hvilket er i overensstemmelse med manglende respons på AR målrettet terapi i denne model.

Vi observerede kapaciteten til mar-Va, men reduceret til mAR-Vb og mar-Vc, for at øge aktiviteten af ​​AR transkriptionelle reporter assays. Dette kan skyldes, at mar-Vb og Vc mangler en DNA-bindende motiv. Vores data kan imidlertid ikke udelukke muligheden for varianter, såsom Mar-Vb og Vc at have onkogene funktion gennem alternative mekanismer. Interessant blev en hidtil ukendt AR variant af lignende struktur identificeret i adskillige humane prostatacancer-cellelinier [19]. Den såkaldte AR8 mangler også et DNA-bindende domæne og dermed ligesom MAR-Vb og MAR-Vc identificeret her, er det usandsynligt at fungere som en transkriptionel faktor på egen hånd. Snarere AR8 blev vist at associere med Src og EGF-receptoren og derved fremme øget phosphorylering af AR [19]. Det vil være interessant for fremtidige undersøgelser af, om Mar-Vb og Vc er i stand til lignende plasma membran foreninger og et potentielt bidrag til CRPC.

Vores AR-V vælte undersøgelser, hvilket resulterede i reduceret AR transkriptionsaktivitet , afslører potentielle terapeutiske anvendelser af variant målretning under progression til CRPC. Tilstedeværelsen af ​​trunkerede varianter i PTEN mangelfuld mus er også i overensstemmelse med den kliniske observation fastholdt AR udtryk på trods af tilstedeværelsen af ​​potente AR målrettede behandlingsformer såsom enzalutamide. Men da Mar-Va, b og c viste, differentierede reaktioner i udtryk ændringer kastration eller Casodex i vores studier, den nøjagtige bidrag (e) af de enkelte varianter, og deres potentielle cooperativitet mod CRPC mangler at blive belyst, og sandsynligvis afhænge af cellulære kontekst [8]. Fremtidige progression undersøgelser kan overveje MAR-V cellulære lokaliseringer, interaktioner med andre onkogene veje og virkninger på

in vivo

progression.

Resultater præsenteres her bevis for tilstedeværelsen af ​​romanen varianter påvises i den primære organsystemer af gensplejsede PTEN null mus fremhævet af den forbedrede variant udtryk under progression på kastrationsniveau androgen niveauer. Fremtidige terapeutiske undersøgelser kan overveje, om tidlig målretning af disse identificerede AR isoformer kan forhindre eller forsinke progression til CRPC. At Mar-Va og Vc hæmning resulterede i reduceret AR transkriptionel funktion giver begrundelsen for afprøvning af farmakologiske målretning AR varianter. Givet vores resultater, er det fristende at spekulere, at indførelsen af ​​AR-FL tilbage til visse PTEN mangelfuld CRPC celler, der indeholder AR Vs kan genoprette sådanne celler til androgen deprivation terapi.

Metoder

Cell kultur og mus prostata prøver

E4, E8, CE1 CE2 [25] [26] og CaP8, P8 [36] cellelinje blev etableret fra den betingede

PTEN

-null musemodel. LNCaP og PC-3-celler blev indkøbt fra ATCC. C4-2B og COS-1 celler var en gave fra Dr. Baruch Frenkel (University of Southern California, LA, CA) og Dr. Allen Epstein (University of Southern California, LA, CA), hhv. Derivaterne af parentale cellelinier blev frembragt gennem kultur 10% CSS (kul-strippet serum, Cellgro) i op til 18 dage. E8 og CE2 celler blev også behandlet i normale opretholdelse medier med tilsætning af 10 uM af antiandrogen, bicalutamid (Sigma-Aldrich) i 6 dage. Prostata væv blev indsamlet fra mus, der bærer ADCA eller CRPC tumorer samt vildtype dem på forskellige aldersgrupper. Dissekerede prostata blev forarbejdet ved hurtig frysning i flydende nitrogen og opbevaret i -80 ° C til yderligere analyse.

Kloning og konstruktioner

totale cellulære RNA’er blev isoleret fra E8 og CE1 af RNAqueous-4PCR Kit (Life Technologies), der anvendes som kilde. Påvisningen af ​​muse AR splejsningsvarianter fra dem blev opnået ved Generacer kit med SuperScript III RT og TOPO TA Cloning Kit til sekventering (Life Technologies) ifølge producentens protokoller. Kort beskrevet ekstraherede RNA’er blev første revers transkriberet under anvendelse af Generacer oligo (dT) primer og SuperScript III RT modul fra kittet. RACE-klar cDNA’er blev underkastet 3’hurtig amplifikation af cDNA ende PCR (3′-RACE-PCR) under anvendelse af en forlæns gen-specifik primer (GSP) og revers Generacer 3′-primer fra Generacer Module. En anden runde af nested PCR blev udført for yderligere forstærkning ved hjælp af en fremad GSP nested primer og reverse Generacer 3 ‘Indlejret primer leveres i kittet. SuperTaq Plus Polymerase (Life Technologies) blev anvendt til både 3’-RACE og nested PCR. Forward GSP og indlejrede primere forankret inden exon1 (S1 Table) for forudsagte varianter (S2 tabel) ved hjælp af variant specifikke RACE primere (S3 tabel). 3 ‘RACE og indlejrede PCR-produkter blev derefter undersøgt ved standard TA sub kloning og sekventering ved hjælp af TOPO TA Kloning Module. APE plasmid Editor blev anvendt i denne undersøgelse for at analysere sekventeringsresultaterne, forudsige proteinsekvenser og generere tekst kort til mARVs (S3 Table)

plasmidkonstruktioner anvendt i denne undersøgelse omfattede:. Rotte AR fuld længde (Dr. Robert Matusik, Vanderbilt University, Nashville, TN), human AR fuld længde (Dr. Jeremy Jones, City of Hope, Duarte, CA), og PSA-luciferase reporter og pcDNA3.1-myc (Dr. Parkash Gill, Syddansk Universitet California, LA, CA). pCR4-TOPO blev købt i TOPO TA Cloning Kit til sekventering (Life Technologies).

CDS (kodende sekvenser) for Marva, Vb og Vc blev amplificeret ved PCR fra cDNA’er af E8 og CE1 under anvendelse af primersæt omslutter hele den åbne læseramme (ORF), og sub klonet i pcDNA3.1-myc-HisC. At generere Arva-myc og ARVC-myc-konstruktioner, reverse primere blev re-designet til at blive forankret opstrøms for deres egne stopkodoner og i-indrammet med ORF på ekspressionsvektoren. Hifi AccuStart Taq DNA Polymerase (Quanta Biosciences) og Hotstar Taq DNA Polymerase (Qiagen) blev anvendt i PCR-kloning. Sekvenser af primeren anvendt til at klone Va, Vb, Vc, Va-myc og Vc-myc blev leveret i S4 tabel.

PCR og kvantitativ real-time PCR

Totalt cellulært RNA’er blev ekstraheret fra alle forældre og andre afledte cellelinjer og derefter omvendt transskriberet under anvendelse af oligo (dT) primer og SuperScript III First-Strand syntese (Life Technologies). RNA-prøver, der anvendes til forskellige assays blev isoleret fra celler med forskellige batches. Konventionel PCR blev udført på cDNA’er, der anvender samme fremadrettede primer forankret i exon1 parret med revers primer specifik for MAR-Va, b, c og AR-FL, henholdsvis (S5 tabel). Kvantitativ realtids-PCR og dataanalyse er tidligere blevet beskrevet. De realtid primer sæt designet specielt og udelukkende til at forstærke hver ARV og AR-FL optaget i S6 tabel.

Transfektion og luciferase reporter assay

1-2 dage før transfektion, celler blev anbragt i medier indeholdende kul-strippet serum (CSS). For alle transfektioner blev pools af celler transficeret under anvendelse af Lipofectamine Plus (Invitrogen) med tom vektor kontrol plasmid, fuld længde AR plasmid, eller AR splejsningsvariant plasmider sammen med androgen-responsive konstruktioner MMTV-ildflueluciferase eller PSA-ildflueluciferase [28 ] og androgen-ufølsom Renilla luciferase kontrol pRL-SV40 (Promega). Tom vektor kontrol plasmid blev anvendt til ækvilibrering total DNA i alle transfektioner. Den følgende dag blev cellerne udpladet i fire med lægemidler i 96 brønds plader. 24 timer senere luciferaseaktiviteter blev kvantificeret (Dual luciferase assay kit, Promega) på en pladelæser (Tecan) og ildflue signal normaliseret til renilla signal til kontrol af celleantal.

Co-immunpræcipitationsassay

COS-celler blev transficeret med Marva-myc eller mARVc-myc sammen med Rat AR-FL anvendelse af lipofectamin 2000 (Life Technologies) ifølge fremstillingen protokol. Omkring 48 timer.