PLoS ONE: 26S Proteasome Activity nedreguleres i Lung Cancer Stem-lignende celler opformeres i Vitro

Abstrakt

Kræft stamceller (CSCS) er en lille delmængde af kræftceller i stand til selv-fornyelse og tumor vedligeholdelse. Udryddelse cancer stamceller, roden af ​​tumor oprindelse og tilbagefald, har vist sig som en lovende tilgang til at forbedre lungekræft overlevelse. Kræft stamceller er rapporteret til at opholde sig i siden befolkning (SP) af dyrkede lunge kræftceller. Vi rapporterer her sameksistensen af ​​en særskilt population af ikke-SP (NSP) celler, der har tilsvarende selvfornyelse kapacitet i forhold til SP celler i en lunge tumor sfære assay. Sammenlignet med de tilsvarende celler i monolagskulturer, lunge tumor sfærer dannet af human ikke-småcellet lungekræft cellelinier A549 eller H1299, viste markante morfologiske forskelle og forøget ekspression af stilken cellemarkører CD133 og OCT3 /4. Lungetumor kugler udviste også øget tumorigent potentiale som kun 10.000 lunge tumor sfære celler skulle udarbejde xenografter tumorer i nøgne mus, hvorimod det samme antal monolag celler inducerede ikke tumorer. Vi viser også, at lunge tumor kugler viste faldt 26S proteasom aktivitet sammenlignet med monolag. Ved at bruge ZsGreen-cODC (C-terminale sekvens, der dirigerer nedbrydning af ornithindecarboxylase) reporter assay i NSCLC cellelinjer, var kun mindre end 1% monolagskulturer ZsGreen positiv indikerer lav 26S proteasom, hvorimod lungetumor sfære viste øget antal af ZsGreen- positive celler, hvilket tyder på berigelsen af ​​CSCS i sfære kulturer

Henvisning:. Pan J, Zhang Q, Wang Y, du M (2010) 26S Proteasome Activity nedreguleres i Lung Cancer Stem-lignende celler Formeret

In vitro

. PLoS ONE 5 (10): e13298. doi: 10,1371 /journal.pone.0013298

Redaktør: Xinwei Wang, National Cancer Institute, NIH, USA

Modtaget: April 18, 2010; Accepteret: September 17, 2010; Udgivet: 11 oktober 2010

Copyright: © 2010 Pan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Arbejdet blev støttet af NIH tilskud R01CA134682. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kræft stamceller (CSCS) er en lille reservoir af selvbærende celler med den eksklusive evne til selv-fornyelse og tumor vedligeholdelse [1]. Kun en lille delmængde af cancerceller inden for en tumor har karakter af stamceller, og kan således indlede en tumor, når transplanteret [3], [4]. Formodede CSCS i akut myeloid leukæmi (AML) blev først isoleret i 1994 [5]. Med fremskridt inden for fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS), og nyligt identificerede celleoverflademarkører såsom Sca-1, og CD133, kan CSCS isoleres ikke kun fra blodkræft, men også fra faste tumorer [1].

CSCS i human karcinom er blevet identificeret som en sjælden population af CD44

+ /CD24

– /lav /ESA

+ celler [6]. 100 af disse celler var i stand til at danne nye tumorer, mens andre tumorceller ikke danne tumorer i SCID-mus. Breast CSCS blev også identificeret som CD44

+ /CD24

– /Oct-4

+ af Ponti

et al

. i 2005 [7]. CSCS i tyktarmskræft viste sig at være en mindre end 2,5% af befolkningen med positive CD133 udtryk [8], og for nylig defineret som CD44

+ /CD166

+ /ESA

+ [9]. Bronchioalveolar stamceller (BASCs) blev for nylig identificeret som det formodede stamcellepopulation til lungeadenokarcinom, og kunne isoleres som CD45

– /PECAM

– /Sca-1

+ /CD34

+ celler ved FACS [10]. CSCS i småcellet og ikke-småcellet lungekræft blev også rapporteret som en sjælden population af udifferentierede CD133

+ celler [11]. Disse var i stand til at forny sig selv som tumor kugler i serum-frit medium, og generere tumorxenoplantater fænotypisk ikke kan skelnes fra den oprindelige tumor, når de injiceres i SCID-mus.

En alternativ fremgangsmåde til isolering af stamceller cellepopulationer er gennem berigelse af side befolkning (SP) celler [2]. SP celler identificeres ved evnen til udstrømning Hoechst farvestof, en proces medieret af ATP-bindende kassette transportør brystkræft resistens protein (Bcrp-1) [12]. Da Goodell

et al

. først rapporteret, at SP er beriget i hæmatopoietiske stamceller (HSC’er) [13], SP-celler er blevet identificeret i en række normale og maligne væv, herunder lunge [14]. BCRP-1 deficiente mus manglede SP i knoglemarven endnu havde ingen væsentlige hæmatopoietiske abnormiteter [15]. Således er den præcise funktionelle forhold mellem SP fænotype og stamcelle forbliver uklar. Både SP og NSP fraktioner fra DAOY medulloblastom cellelinien var i stand til at rekonstituere den oprindelige parentale befolkning, og kun lille klonogene berigelse blev observeret i SP fraktionen [16].

Hæmatopoietiske stamceller (HSC’er) rapporteres til bor i SP brøkdel af voksne mus knoglemarven (BM), men viste en nylig rapport sameksistensen af ​​NSP HSC’er som ikke afviger væsentligt fra SP HSC’er i tal, og selv-fornyelse kapacitet [17]. Desuden CD34

– /lowc-Kit

+ Sca-1

+ afstamning markering

– cellepopulation, som er stærkt beriget i muse HSC’er, var næsten ligeligt opdelt i SP og NSP celler. Disse var i en hvilende tilstand og viste ensartede celle-cyklus kinetik, uanset om de var i SP eller NSP [17]. Yderligere karakterisering af SP i kræftceller er derfor nødvendigt for fuldt ud at vurdere den rolle, disse celler spiller i lungekræft.

Nye fund viste, at kemoterapeutiske lægemidler, såsom doxorubicin og cisplatin, kunne fremkalde udbredelsen af ​​CSCS

in vitro

[18]. Disse celler fastholdt deres selvfornyelse kapacitet som påvist af væksten i tumor kugler

in vitro

, og havde høj tumorigen og metastatisk potentiale følgende podning i SCID-mus. Kemoterapeutiske lægemidler, såsom cisplatin og ifosfamid, vides også at trykke ekspressionen af ​​proteasomalaktivitet underenheder [19], og nedregulere ubiquitin-proteasom-afhængig proteolyse [20]. Reducerede 26S proteasom aktivitet viste sig at være en unik funktion af CIC (cancer initierende celler) i gliom og brystcancer, kan det bruges til at spore CSCS

in vivo

[21]. Imidlertid Benzyloxicarbonyl-Leu-Leu-Nle-CHO (LLNle), en γ-sekretase hæmmer, blev rapporteret til effektivt at dræbe humane glioblastom tumorfremkaldende celler (GBM TIC)

in vitro

ved hæmning af den 26S proteasomet . Derfor er yderligere belysning af 26S proteasom aktivitet kræves for fuldt ud at bestemme dens rolle i CSCS og anticancerterapi. I sidste ende kan det hjælpe med identifikation af nye mål for det fremtidige terapeutisk intervention.

I den foreliggende undersøgelse, undersøgte vi, om lunge CSCS udelukkende bor i siden befolkning, og om lunge tumor kugler med selvfornyelse kapacitet fra NSCLC cellelinjer kan være en kilde til berigelse af lunge CSCS.

Metoder

Cell Culture

Menneskelig NSCLC cellelinjer A549 og H1299 blev indkøbt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA) og dyrket i RPMI 1640-medier med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Gibco) og penicillin og streptomycin cocktail (Gibco). 293 FT-celler blev anskaffet fra Invitrogen (Carlsbad, CA) og dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) (Gibco) med 10% FBS og penicillin og streptomycin cocktail. Alle celler blev dyrket i en fugtig inkubator ved 37 ° C ved 5% CO

2.

Farvning af celler med Hoechst 33342

Metoder til identifikation af SP’er blev tilpasset fra tidligere rapporter [ ,,,0],22], [23]. Kort beskrevet blev celler trpsinized og resuspenderet ved 1 x 10

6 celler /ml i DMEM med høj glucose, 2% (vol /vol) FBS og 10 mM N- (2-hydroxyethyl) piperazin-N ‘- (2 -ethansulfonsyre) (HEPES)), inkuberet med 5 ug /ml Hoechst 33342 farvestof (med eller uden Fumitremorgin C (MP Biomedicals, Eschwege) i 90 minutter i et 37 ° C vandbad, og rørene blev forsigtigt vendt hver 20 min at modvirke celle bundfældning og sammenklumpning. celler blev centrifugeret ved 375 x g i 6 min ved 4 ° C og resuspenderes i et passende volumen af ​​kold Hanks balanceret saltopløsning (HBSS) med 2% (vol /vol) FBS. cellerne forblev ved 4 ° C i den resterende del af forsøget. for dødt diskrimination celle, blev 2 ug /ml propidiumiodid (PI) umiddelbart før flowcytometri. Celleprøver blev analyseret på en MoFlo (Beckman Coulter) cellesorteringsapparat, og emission blev indsamlet via et 610 nm lang pasning dichroic spejl (DCLP) til en 620 nm lang pasning (LP) filter til Hoechst røde indsamling og en 424/44 nm band pass (BP) filter for Hoechst blå samling. Den side befolkning “SP” blev identificeret som en gruppe af celler i stand til at udelukke Hoechst farvestof, et karakteristisk afskaffet med 10 pM Fumitremorgin C behandling [22].

Sphere Formation Assay

Lunge tumor kugler blev isoleret gennem kulturen ved lav densitet i serumfrit dyrkningsbetingelser som beskrevet tidligere, hvilket tillod udvælgelse af udifferentierede cancer stamceller og progenitorceller, mens serum-afhængige differentierede tumorceller og ikke-transformerede accessoriske celler negativt blev udvalgt [8], [11], [24]. A549 og H1299 lungecancerceller blev udpladet ved klonal tæthed i serumfrit DMEM-F12-medium suppleret med, 5 mM HEPES, 0,1% natriumbicarbonat, 0,4% BSA, glutamin og antibiotika (Gibco-Invitrogen), og indeholdende 20 ng /ml EGF og 10 ng /ml bFGF. Ubehandlede vævskulturkolber blev anvendt til at reducere celleadhærence og støtte vækst som udifferentierede tumor sfærer. Medium blev udskiftet eller suppleret med frisk vækstfaktorer to gange om ugen, indtil cellerne begyndt at vokse og danne flydende aggregater. Tumor kugler blev indsamlet med en 100 um celle si (BD, Bedford, MA), og udvidet ved enzymatisk og mekanisk dissociation, efterfulgt af re-plating af både enkelte celler og resterende små aggregater i fuldstændig frisk medium.

flowcytometri

i flowcytometri blev tumor kugler eller monolagskulturer mekanisk dissocieret til enkelte celler, vasket og inkuberet med en passende fortynding af kontrol- eller specifikt antistof. Anvendte antistoffer var PE-konjugeret anti-CD133 /1 fra Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Tyskland), FITC konjugeret anti-CD44 (eBioscience, San Diego, CA), og anti-OCT3 /4 (Santa Cruz Biotechology, CA). Til PE konjugeret anti-CD133 /1 blev celler først blokeret med blokerende reagens i 5 minutter, derefter en 20 minutters inkubation med antistof. For OCT3 /4-ekspression blev celler fikseret og permeabiliseret med FIX PERM® reagenser (Invitrogen) efter producentens instruktioner og inkuberet med monoklonalt muse-antistof mod Oct3 /4 (Santa Cruz Biotechnology) i 20 minutter i mørke, efter vasket med PBS blev cellerne derefter inkuberet i mørke med et FITC-konjugeret sekundært antistof ( Invitrogen). Som negativ kontrol blev celler farvet med den passende isotop kontrol. For FITC konjugeret anti-CD44 blev celler inkuberet med antistoffer i 20 minutter i mørke. Efter vasket med PBS blev cellerne analyseret på en FACS Calibur flowcytometer (Becton Dickinson).

proteasomfunktionen Assays

chymotryptisk, tryptiske og caspase proteasom aktiviteter blev målt som tidligere beskrevet [25] med et par mindre ændringer. A549 blev H1299 og deres primære lungetumorceller sfære cellerne vasket med phosphatpufret saltvand (PBS) og pelleteret ved centrifugering. Cellepellets blev sonikeret i homogeniseringsbuffer (25 mM Tris [pH 7,5], 100 mM NaCl, 5 mM ATP, 0,2% (vol /vol) Nonidet P-40 og 20% ​​glycerol og cellerester blev fjernet ved centrifugering ved 4 ° C. proteinkoncentration i de resulterende rå celleekstrakter blev bestemt ved Micro (bicinchoninsyre) protokol (Bio Rad, Rockford, IL) med BSA (Sigma) som standard. til måling 26S proteasom aktivitet, 100 ug protein fra rå celleekstrakter af hver prøve blev fortyndet med puffer i (50 mM Tris [pH 7,4], 2 mM dithiothreitol, 5 mM MgC

2, 2 mM ATP) til et slutvolumen på 1 ml (analyseret firdobbelt). De fluorogene proteasom substrater suc-LLVY-AMC (chymotryptisk substrat; Biomol International, Plymouth Meeting, PA), Z-ARR-AMC (tryptisk substrat; Calbiochem), og Z-LLE-AMC (caspase-lignende substrat; Biomol International) blev opløst i DMSO og tilsat til en slutkoncentration på 80 uM. proteolytiske aktiviteter blev kontinuert overvåget i 2 timer ved 37 ° C ved måling af frigivelsen af ​​den fluorescerende gruppe, 7-amido-4-methylcoumarin (AMC), ved en fluorescenspladelæser (Spectramax M2, Molecular Devices, Sunnyvale, CA) med excitation og emission bølgelængder på 380 og 460 nm, hhv.

Alamar Blå Assay

Cellernes levedygtighed blev målt ved Alamar Blå [26]. A549 og H1299-celler blev podet i 96-brønds plader (BD Falcon) med en densitet på 2 x 10

3 celler pr. For tumor kugle kulturer, enkelt celle var enzymatiske og mekaniske dissocieret. 24 timer efter podning blev cellerne eksponeret for forskellige koncentrationer af cisplatin eller doxorubicin som angivet i 48 timer. Alamar Blå (BioSource, Camarillo, CA) blev tilsat direkte til dyrkningsmediet ved 10% af volumenet medierne under de sidste 10 timer af eksponeringen perioden 48 h. Fluorescerer med en excitation af 544 nm og emission detekteret ved 590 nm blev målt ved hjælp af en mikropladelæser.

Generering af stabile cellelinjer, der udtrykker ZsGreen-cODC fusionsproteiner Brug retroviral transduktion

retroviral ekspressionsvektor pQCXIN-ZsGreen-cODC var en slags gave fra Dr. Frank Pajonk (afdeling for Molekylær og Cellulær Oncology, Institut for Strålebeskyttelse Oncology, David Geffen School of Medicine ved University of California, Los Angeles, Los Angeles, CA), hvor carboxyl terminalen af ​​det murine ornithindecarboxylase (cODC) degron, den sekvens, der dirigerer startstedet for nedbrydning, blev fusioneret til ZsGreen reporter [21]. pQCXIN-ZsGreenc-ODC blev co-transficeret med pVSV-G i GP2-293 pantropiske retrovirale pakkeceller (Clontech) og retrovirus supernatant blev anvendt til at inficere A549 og H1299-celler. 48 timer efter infektion blev cellerne udvalgt med G418 (Invitrogen). Ophobningen af ​​ZsGreen-cODC protein blev overvåget ved fluorescens mikroskop og flowcytometri (FL-1channel).

Generation of Subkutan lungekræft Xenografter i nøgne mus

For mus implanteret, både monolag og tumor sfære celler blev trypsinbehandlet og mekanisk dissocieret til opnåelse enkeltcellesuspensioner før subkutan injektion. Seks uger gamle nøgne hunmus (Harlan Lab, Indianapolis, IN) blev anvendt. Tumor sfære (1 × 10

4) og monolag (1 × 10

4) celler var s.c. injiceret i venstre og højre flanker af samme mus til at evaluere tumorigen aktivitet. Mus blev overvåget dagligt for forekomsten af ​​subkutane tumorer. Mus blev aflivet på dag 60 og tumorvæv blev opsamlet. Tumorvolumen blev beregnet ved formlen 0,52 x længde x bredde

2. Hematoxylin og eosin-farvning efterfulgt af IHC-analyse blev udført for at analysere tumorhistologi. Snit blev også farvet med antistof mod β-catenin med standard IHC-protokollen.

Statistical Analysis

Data er præsenteret som middelværdi ± SD. Forskelle blev bestemt ved tosidet Student t-test. AP værdi 0,05 blev betragtet som signifikant

Resultater

SP og NSP celler danner tumor kugle med samme frekvens i human adenocarcinom cellelinjer

SP celler har været. impliceret som formodede CSCS som de viser forhøjet tumorigenicitet i nøgne /scid mus sammenlignet med NSP-celler [27]. For at bestemme om SP-celler har større selvfornyelse kapacitet end NSP celler i kultur, blev SP og NSP celler fra to humane lunge cancercellelinjer sorteret baseret på evnen til at udstrømning Hoechst 33342 farvestof til at generere en Hoechst blå-rød profil. En selektiv ABCG2 inhibitor, Fumitremorgin C (FTC), blev co-inkuberet med Hoechst 33342 til at blokere aktiviteten af ​​transportøren, og SP gate blev defineret som den formindskede region i nærvær af FTC. De humane adenocarcinom cellelinier A549 og H1299 indeholdt 17,7% og 0,2% SP-celler henholdsvis (fig. 1A). Dyrkning af SP og NSP-celler i tumor sfære dannende medier, som kun giver mulighed for udvælgelse af udifferentierede kloner eller cancer stamceller og progenitorceller [11], resulterede i lungetumor sfære dannelse ud fra begge subpopulationer med nogen forskel i hastigheden for dannelse (fig. 1B og data ikke vist). SP celler typisk give anledning til SP og NSP celler ved hjælp af asymmetrisk celledeling, mens NSP celler ikke har dette potentiale [28]. Ved re-farvning sorteres SP og NSP celler fra A549 og H1299 celler en uge efter, FACS-analyse viste, at SP cellerne gav anledning til en betydelig del af NSP celler. Desuden isolerede NSP celler gav også anledning til lignende andel af SP-celler (Fig. 1C).

A. Karakteristisk Hoechst 33342 farvestof farvning profil viser eksistensen af ​​SP (polygon gated) og NSP (ellipse gated) celler i menneskets A549 og H1299 adenocarcinom celler. Procentdel af SP-celler er angivet. Celler blev farvet med 5 mg /ml Hoechst33342 (HO), og kontrol celler også co-farvet med 10 mM fumitremorgin C (FTC) at angive SP celler. Celler blev sorteret ved hjælp af en Beckman MoFlo cytometer og data blev kommenteret hjælp FCS Express. B. Fase kontrast fotografier af lunge tumor sfærer opnået fra SP og NSP celler. SP og NSP-celler (1000 celler /ml) blev udpladet på ultralave adhærente kolber i serumfrit medium suppleret med vækstfaktorer og dyrket som beskrevet i Materiale og fremgangsmåder. C. Re-plet af SP og NSP celler fra A549 og H1299 med Hoechst 33342 farvestof. Procentdel af SP celler er mærket.

Lung tumor sfærer udviser kræft stamceller funktioner

Da celler i stand til selv-fornyelse bor i begge side og ikke-side befolkninger, vi undersøgt, om tumor sfære celler viste nogen CSC funktioner, såsom ekspression af stamcelle-markører, såsom CD44, CD133 og OCT3 /4. For det første at udelukke effekten af ​​CSC medier på udtrykket blev monolag celler dyrket i CSC medierne kontrolleres, og ingen forskel blev fundet mellem celler vokse i CSC medier og regelmæssig vækstmedier (data ikke vist). Celler fra monolags- og sfære kulturer fra A549 og H1299-celler blev derefter høstet og analyseret for CD44 og CD133. Over 90% af A549 og H1299-celler i monolagskulturer var CD44

+, mens kun en meget lille del af cellerne var CD133

+ (0,2% i A549-celler, og 0,55% i H1299-celler.). Men i lungetumor sfærer, CD133

+ -celler blev stærkt beriget til over 10% i A549, og 1,7% i H1299 (fig. 2A). Transskriptionsfaktoren OCT3 /4 betragtes som en central regulator af humane embryonale stamceller pluripotens og selv-fornyelse kapacitet. Dets ekspression synes at være vigtige for opretholdelsen af ​​den udifferentierede tilstand af embryonal carcinoma, såvel som i andre cancere [29], [30]. OCT3 /4

+ celler i A549 og H1299 monolag var mindre end 4%, mens tallene var signifikant opreguleret i tumor kugler til 36% og 50%, hver for sig.

A. Lunge tumor kugler viste øget CD133 udtryk. Ekspression af CD44 og CD133 i monolag og tumor sfære celler, som bestemt ved tofarvet flowcytometri analyse. Isotype-matchet monoklonale antistoffer og et præimmune anden antiserum blev anvendt som negative kontroller. Procentdelen af ​​enkelt- og dobbelt-positive celler er vist. B. lungesvulst kugler viste øget OCT3 /4 udtryk. En gennemsnitlig fluorescensintensitet af OCT3 /4 i kontrol (gråt område), monolag celler (stiplet linje) og tumor kugler (fuldt optrukket linie) vises. Procenter af positive celler er angivet i tabellen.

Lung tumor sfærer har høj tumorigent potentiale

For at bestemme om lunge tumor kugler fra A549 og H1299 celler er forskellige i deres tumorigent potentiale i forhold til celler dyrket i et monolag, vi injicerede 10.000 celler subkutant fra hver af disse populationer i flankerne af nøgne mus. blev observeret tumorvækst i alle mus inokuleret med tumor sfære celler afledt af A549, hvorimod der ikke blev observeret nogen tumorvækst efter inokulering med monolag A549-celler (tabel 1). Tumor sfære celler fra H1299 celler voksede i 2 ud af 3 nøgne mus, mens det samme antal monolag celler undladt at give anledning til tumor selv med en udvidet 4 flere ugers observation (tabel 1 og data ikke vist). H 0,05, ** p 0,01, og *** p 0,001 (tre gentagelser pr eksperiment)

Lung tumor sfærer. er beriget med celler med lav proteasomaktivitet

proteasomalaktivitet nedbrydning af de fleste proteiner skal først gå gennem ubiquitinering vej, før de nedbrydes af proteasomet. Imidlertid ornithindecarboxylase (ODC) er et velkarakteriseret cellulært protein underlagt ubiquitin-uafhængig proteasomalaktivitet nedbrydning, og når anerkendt af 26S proteasomet, det fører til øjeblikkelig nedbrydning af proteinerne, der indeholder det [21]. Retrovirus udtrykker ZsGreen-cODC (dvs. fusion af et fluorescerende protein ZsGreen, og C-terminalen af ​​det murine ornithindecarboxylase (cODC) degron) muliggør identifikation af celler med reduceret 26S proteasom aktivitet på grund af ZsGreen fluorescens. Dette er tidligere blevet rapporteret at spore CIC’er i gliom og brystkræft

in vitro

baseret på dens evne til at mærke levende celler med lav 26S proteasom aktivitet [21]. For at bekræfte, at tumor sfære celler er beriget til lunge CSCS, vi inficerede A549 og H1299 celler med ZsGreen-cODC udtrykker retrovirus. Vi observerede, monolagskulturer af A549 og H1299 udviste lav baggrundsfluorescens i mere end 98% af cellerne, og kun meget få celler (2%) viste høje niveauer af ZsGreen (fig. 6A og data ikke vist). Interessant, lunge tumor sfærer afledt fra ZsGreen-cODC inficerede A549 og H1299-celler var stærkt beriget for ZsGreen-positive celler, hvilket indikerer lav proteasomaktivitet og dermed en stærkt beriget kilde til CSCS (fig. 6B). For yderligere at bekræfte, at CSCS er beriget i populationen med lav proteasomaktivitet blev ZsGreen-positive og -negative celler også sorteret i 96-brønds plade, og antallet af dannede kugler af 100 sorterede celler blev talt, ZsGreen-positive celler fra både A549 og H1299 cellelinjer havde en statistisk signifikant højere sfære-dannende kapacitet i forhold til de ZsGreen-negative celler (Fig.6C).

a. Hyppighed af ZsGreen celler i A549 og H1299 monolagskulturer. B. Hyppigheden af ​​ZsGreen celler i A549 og H12199-afledte tumor kugler med ophobning af ZsGreen-cODC, og dermed lav proteasom aktivitet er angivet. C. Antal dannede kugler fra ZsGreen positive og ZsGreen negative celler efter sortering med flowcytometri i 96-brønds plader. ZsGree-positive og -negative celler blev sorteret i 96-brønds plade (100 celler /brønd), efter dyrket i tumor sfære medier i 2 uger; Antallet af dannede sfærer blev talt. Students parret, og to-tailed t-test blev udført, *** p 0,001 (tre gentagelser pr eksperiment)

Diskussion

I den foreliggende undersøgelse, vi har vist. at: 1) i overensstemmelse med tidligere beviser [11], må CSC-lignende celler findes i lungekræft; 2) både SP og NSP celler danner tumor kugler med samme frekvens angiver eksistensen af ​​selv-fornyelse CSC-lignende celler i begge populationer; 3) lunge CSC-lignende celler kan opformeres i serumfrie medier; og 4) lav 26S proteasom aktivitet er forbundet med lunge CSC-lignende celler. Kræften stamceller hypotese forudsiger, at SP fraktionen skal kunne regenerere både SP og NSP fraktioner mens NSP fraktionen kun skal kunne regenerere sig selv [28]. Interessant resultaterne præsenteret her viser, at både SP og NSP fraktionerne har kapacitet til helt regenerere begge fraktioner. Den samme konstatering er også blevet observeret i C6 gliom og DAOY medulloblastom cellelinjer hvor begge fraktioner var i stand til at rekonstituere forældrenes cellulære befolkning [16], [33]. I den foreliggende undersøgelse SP celler udviste tumor sfære-lignende vækst, den klassiske

in vitro

assay af selvfornyelse potentiale, hvilket bekræfter tidligere resultater, som SP-celler udviser stamme-lignende aktivitet [34]. Imidlertid NSP-celler var også i stand til at danne tumor sfærer ved en frekvens sammenlignes med SP-celler.

CD133 (human prominin-1), en fem transmembrane domæne glycoprotein, blev oprindeligt identificeret som et celleoverfladeantigen foreliggende på CD34

+ hæmatopoietiske stamceller. For nylig CD133 blev vist som en formodet overflademarkør af cancer stamceller i mange faste tumorer, såsom hjernetumor [35], prostatacancer [36], tyktarmskræft [8], ovariecancer [37] og lungekræft [11] . Den ekstremt lave overflod af CD133

+ eller Oct3 /4

+ celler i tumorer, gør det vanskeligt at isolere disse populationer. I vores undersøgelse viser vi, at berigelse af CD133

+ /oktober 3/4

+ celler ved

in vitro

serumfrit kultur er mulig.

Det har længe været kendt at ikke alle tumorcellen er en tumor-initierende celle, og dermed millioner af tumorceller kræves ofte at transplantere en ny tumor fra en eksisterende. I den foreliggende undersøgelse xenotransplantat tumorvækst i nøgne mus forekom med injektion af 10.000 tumor sfære celler, men ikke ved at injicere et tilsvarende antal monolag celler. Disse tumorer havde store kerner med prominente nucleoli og nuklear farvning af β-catenin, hvilket indikerer mulig aktivering af Wnt-vejen. Nuklear akkumulering af β-catenin [38] har vist sig at spille en rolle i regulering stamcelle selvfornyelse [31], [39].

kemoterapeutiske lægemidler, såsom cisplatin og ifosfamid [19], er kendt for at dræbe hovedparten af ​​tumorer ved nedregulering ubiquitin-proteasom-afhængig proteolyse [20]. Men de også føre til udbredelsen af ​​CSCS [18].