PLoS ONE: Forhøjet ekspression af AKR1C3 Øger Resistance af kræftceller for ioniserende stråling via Modulation af oxidativt stress

Abstrakt

Med det formål at belyse ætiologien af ​​radioresistance, vi udforskede de genetiske ændringer i ikke-radioresistente vs. resistente esophageal kræftceller erhvervet af langsigtet fraktioneret stråling. Vi fandt AKR1C3, en aldo-keto reductase udtrykt sjældent i de fleste humane væv, udtrykt højere i radioresistance-erhvervet celler. Undertrykkelse af AKR1C3 via RNAi eller kemiske inhibitorer restaureret følsomheden af ​​de erhvervede tumorceller og xenograft BALB /c nøgne mus for ioniserende stråling (IR). Cellulær overvågning af oxidativt stress i AKR1C3-forhøjede celler viste, at IR-induceret ROS ophobning og samtidig DNA-skader var signifikant afhjælpes, og en sådan beskyttende konsekvens forsvandt på AKR1C3 knockdown. Disse resultater afdække potentielle inddragelse af AKR1C3 i fjernelse af cellulær ROS og forklare, i det mindste delvist, den erhvervede radioresistance af AKR1C3 overekspression. En retrospektiv analyse af esophageal karcinomer oplyste også en betydelig udtryk for AKR1C3 i radio-resistente, men ikke radio-følsomme kirurgiske prøver. Vores undersøgelse kan give en potentiel biomarkør for at forudsige prognosen for strålebehandling og endda direkte målrettet terapi for kræft i spiserøret og andre tumorer

Henvisning:. Xiong W, Zhao J, Yu H, Li X, Sun S, Li Y et al. (2014) Forhøjet ekspression af AKR1C3 Øger Resistance af kræftceller for ioniserende stråling via Modulation af oxidativ stress. PLoS ONE 9 (11): e111911. doi: 10,1371 /journal.pone.0111911

Redaktør: Marianne Koritzinsky, University Health Network, Canada

Modtaget: 18 juni 2014 Accepteret: 2 oktober 2014; Udgivet: November 24, 2014

Copyright: © 2014 Zhou et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer. Ifølge PLoS ONE krav og MIAME retningslinjer, har vores microarray data er deponeret i NCBI Gene Expression Omnibus som GSE61620, GSE61772 og GSE61816

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Basic Research Program Kina (973 Program 2010CB12300 for DM Zhou), National Natural Science Foundation of China (91.029.711, 20.932.001 og 20.852.001) og finansiering fra undervisningsministeriet (20110001110054). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

ioniserende stråling (IR) er den mest effektive kirurgisk behandling for de fleste tumorer [1]. Sådan terapeutisk indgriben normalt er afhængig af interaktionen mellem IR- og vandmolekyler i celler, der producerer store reaktive oxygenarter (ROS) og dermed placerer cancerceller under omfattende oxidativt stress [2]. De meget ustabile ROS reagerer med DNA og andre makromolekyler i nærheden, der producerer gendefekt, kromosomafvigelser og andre skader [3]. Mitokondrier skader ved IR kan endda føre til forlænget oxidativt stress og således yderligere skader DNA og andre cellulære molekyler [4]. Ophobning af DNA-skader er en vigtig faktor i udløsningen IR-induceret svigt af celledeling og proliferation, der fører til celle apoptose [5].

På trods af den terapeutiske betydning, IR modstand er en stor hindring for kræftbehandling [ ,,,0],6]. Det er blevet rapporteret, at reparation af IR-induceret DNA-beskadigelse, enten dobbelt- strengbrud eller enkelt streng defekter, er en vigtig mekanisme underliggende cancertilbagefald og radioresistance [7] – [11]. Fjernelse af IR-genereret ROS ved antioxidant enzymer udgør alternativ mekanisme, der fører til radioresistance. Glutathionperoxidase (GPX), peroxiredoxin (TPX) og superoxiddismutase (SOD), den største klasse af antioxidante enzymer, har en sådan evne til at formindske IR-induceret ROS akkumulering [12] – [14]. Visse cancerceller og cancer stamceller indeholder en højere ekspression af antioxidant enzymer og således fortrinsvis forskånet bestråling [15], [16]. Opdagelsen af ​​andre cellulære enzymer involveret i at modvirke oxidativ stress kan være nyttige til diagnosticering af ikke-følsomme patienter til strålebehandling og endda lede en effektiv målrettet behandling for maligne tumorer.

Kræft i spiserøret er en almindelige kræftform med en 5-årig overlevelse på 5-19% [17]. Der er stærke beviser tyder på, at radioresistance af kræft i spiserøret kan være medfødt,

dvs..

Relateret til køn og etnicitet, eller induceres af livsstil såsom rygning [18]. Derfor kan esophageal carcinoma en ideel model til identifikation af cellulære faktorer, som radioresistance er fremkaldt. I denne undersøgelse fandt vi, at det overtagende af radioresistance faldt sammen med forhøjet udtryk for AKR1C3 i esophageal kræftceller, og undertrykkelse af AKR1C3 udtryk restaureret følsomheden af ​​de erhvervede tumorceller og xenograft dyr for ioniserende stråling (IR). Desuden cellulære overvågning af oxidativt stress i AKR1C3-forhøjede celler viste, at ROS ophobning og samtidig DNA-skader var signifikant afhjælpes, og en sådan beskyttende konsekvens forsvandt på AKR1C3 knockdown. En retrospektiv analyse viste en signifikant AKR1C3 udtryk i radio-resistente, men ikke-resistente kirurgiske esophageal karcinomer. Vores resultater kan give en ny biomarkør til forudsigelse af ikke-følsomme patienter til strålebehandling og endda direkte målrettet terapi for kræft i spiserøret og andre tumorer.

Materialer og metoder

Cell kultur og bestråling

KY170 og TE13, to human esophageal skællede cancer cellelinjer, og deres afledte radioresistente cellelinier KY170R og TE13R blev leveret som en gave ved Radiologisk afdeling, MD Anderson cancer center, USA. Disse cellelinjer, der oprindeligt rapporteret af en japansk gruppe [19], blev godkendt og testet af vha korte tandem repeat profilering og karyotypebestemmelse tests. Celler blev passeret i mindre end 1 måned før eksperimenter. En alikvot af underområdet lager blev anvendt til undersøgelserne, er beskrevet her. Celler blev dyrket i høj glucose RPMI 1640 (

Invitrogen

) suppleret med 10% føtalt bovint serum (

HyClone

) og 50 enheder /ml penicillin og 50 ug /ml streptomycin. Celler blev holdt i en befugtet inkubator med 5% CO

2 ved 37 ° C og delt hver 3-4 dage. Tumor celle bestråling blev udført med en 6mV-X-ray lineær accelerator.

RNAi, AKR1C3-tavshed stabile celler

AKR1C3-målretning shRNA og scramble-shRNA kassetter blev konstrueret ved PCR bruge op -primer (hU6 promotor): TGGATCCaaggtcgggcaggaagag, ned-primer (scramble): AGGATCCAAAAACAACAAGATGAAGAGCACCAACTCGAGTTGGTGCTCTTCATCTTGTTGGGTGTTTCGTCCTTTCGTCCTTT; ned-primer (shRNA1): 5′-AGGATCCAAAAACCA GAGGTTCCGAGAAGTAAACTCGAGTTTACTTCTCGGAACCTCTGGCCGGTGTTTCGTCCTTTCCAC-3 ‘, (shRNA2): 5′-AGGATCCAAAAACCTAGACAGAAATCTCCACTACTCG AGTAGTGGAGATTTCTGTCTGGCCGGTGTTTCGTCCTTTCCAC-3′, (shRNA3): 5’-AG GATCCAAAAACTCACTGAAGAAAGCTCAATTCTCGAGAATTGAGCTTTCTTCAGTGAGCCCGGTGTTTCGTCCTTTCCAC-3 ‘. De opnåede kassetter blev klonet ind pSD31 for konstitutiv ekspression af shRNA følge fremgangsmåden, der tidligere [19] blev ordineret. Lentiviral vector produktion blev udført ifølge Invitrogens standardprotokol. Eksperimenter for lentivector stabil transduktion blev udført som følger: 1 × 10

6 af replikon-celler i en T25-kolbe blev podet og transduceres på dag 2 i nærvær af 8 mg /ml polybren. Selektion blev udført efter dag 3 ved 800 ng /ml puromycin indtil de parentale celler i parallelle forsøg fuldstændig døde.

Kolonidannelse assay og tumorbestråling

Et monolag af celler ved den eksponentielle fase af vækst blev bestrålet under anvendelse af en 6 MV-røntgen lineær accelerator ved passende doser (2, 4, 8 Gy), og de bestrålede celler blev udpladet til at vokse i seks-brønds plader. Efter inkubation i 7-10 dage, blev de overlevende celler farvet med krystalviolet og derefter talt. Hvert eksperiment blev udført i tre eksemplarer og gentaget to gange. Tumorbestråling blev udført som følger: når diameteren af ​​xenotransplantattumorer nåede 6-8 mm, blev bagbenene af xenograft mus bestrålet med en enkelt dosis (15 Gy). Efter bestråling blev overvåget tumorvæksten i op til 36 dage.

RNA-ekstraktion og Microarray

RNA blev ekstraheret fra hver dyrket cellelinje ved hjælp SV Total RNA Isolation Kit (

Promega

) ifølge fabrikantens protokol. Den ekstraherede RNA blev derefter behandlet med RNase-fri DNase sæt (

QIAGEN

) til fjernelse af eventuelt kontaminerende genomisk DNA ifølge producentens protokol. Gene profilering, i tre eksemplarer, blev udført af Illumina Shanghai Corporation ved hjælp af et microarray af oplyse Menneske-6 V3 og data blev indsamlet og analyseret med Belyst Beadstudio Application software (GSE61620, GSE61772 og GSE61816). Gener med en Illumina DifferScore af ≥20 blev anset for at udgøre op-regulering, mens dem med en Illumina DifferScore på ≤-20 blev betragtet som nedregulering. P 0,05 indikerede en signifikant forskel

Real-time RT-PCR

Den isolerede total RNA blev kvantificeret med en UV-spektrofotometer (

Eppendorf

) og derefter 1,0 ug. RNA blev revers transkriberet under anvendelse af første streng cDNA syntesekit (

TOYOBO, Japan

) med tilfældige primere i et reaktionsvolumen på 20 pi. PCR-reaktionen blev udført under anvendelse Go Taq qPCR Master Mix kit (

Promega

) ifølge protokollen tilvejebragt af producenten, og cDNA blev derefter anvendt som en skabelon til detektering af de forskellige genekspressioner. PCR-primere blev designet af Primer 3.0 og en BLAST-søgning for at kontrollere deres specificitet. Primere til PCR-amplifikation af AKR1C3 var 5’ATTTGGCACCTATGCACCTC 3 ‘(opstrøms) og 5’TGAGTTTTCCAAGGCTGGTC 3’ (nedstrøms) og β-virkende 5 ‘AGCGAGC ATCCCCCAAAGTT 3’ (opstrøms) og 5’GGGCACGAAGGCTCATCATT 3 ‘(nedstrøms). De relative mRNA-niveauer for de forskellige gener blev beregnet som følger: ACt (prøve) = CT (gen) – CT (GAPDH); ΔΔCT = ACt (efter bestråling tidspunkt) – ACt (0 h); Relative ekspression = 2

-ΔΔCT. Hver RT-PCR blev gentaget mindst to gange.

Western blot assay

Dyrkede celler blev vasket en gang med PBS-buffer og derefter lyseret i lysebuffer (1% SDS, 50 mM Tris, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 1 mM NaF, 10 mM phenylmethylsulfonylfluorid, 1 mM natriumorthovanadat, 1 mM EDTA) i 5 minutter og ledt gennem en 27-gauge nål. Lysater blev centrifugeret ved 12.000

g

i 1 min og proteinkoncentrationer blev bestemt ved anvendelse af et Bio-Rad DC-proteinassay. Lige store mængder protein blev separeret ved 4~20% SDS-PAGE og overført til nitrocellulosemembraner. Membraner blev blokeret med 5% skummetmælk eller 3% bovint serumalbumin i TBST (10 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20) i 1 time. Primære og sekundære antistoffer blev anvendt ifølge producentens instruktioner, og dette blev efterfulgt af påvisning med et forøget kemiluminescens-teknik (

Amersham Biosciences

). Western quantitations blev udført som følger: Western blots blev scannet af et densitometer til opnåelse af densiteten af ​​hvert bånd. Derefter er forholdet mellem densiteten af ​​et bånd af interesse med den for dens interne kontrolbånd (GAPDH) blev i forhold til forholdet fra de negative kontrolforsøg. Hver Western blotting blev gentaget mindst to gange

Overekspression af AKR1C3

Humant AKR1C3 cDNA blev købt (

Origene

, Cat No:. SC321532)., Klonet ind pcDNA3.1 og derefter transficeres ind KY170 celler ifølge protokollen tilvejebragt.

flowcytometri assays

Ethanol-fikserede celler blev behandlet med RNase A (0,1 mg /ml) i 30 minutter efterfulgt af inkubering med PI (35 ug /ml). DNA-indholdet i PI-farvede celler blev analyseret ved FACScan (Becton Dickinson) og procentdelen af ​​celler med G1, S og G2 /M DNA-indhold blev beregnet ved anvendelse MODFIT software. Flowcytometri målinger af dihydroethidium (DHE)-fluorescens blev anvendt til at måle cellulære ROS-niveauer. Monolagskulturer blev inkuberet i 10 uM DHE i 45 minutter og derefter høstet. DHE-fluorescens blev analyseret ved flowcytometri (excitationsbølgelængde 488 nm, emission 585 nm). Den gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI) blev beregnet efter korrektion for autofluorescens og fold ændring blev beregnet i forhold til scramble-KY170R celler. Hver flowcytometri assay blev gentaget to gange.

Dyreforsøg

Male BALB /c nøgne mus (SPF, købt fra Vital River Laboratories, Beijing, Kina), i alderen 4-6 uger, blev huset med en omvendt 12 timers dag-nat cyklus med lys på ved 8:30 i en temperatur (22 ± 1 ° C) og luftfugtighed (55 ± 5%) kontrolleret rum. Alle mus fik vand og chow

ad libitum

på alle tidspunkter. Xenograft nøgne mus blev frembragt som følger: KY170R-shRNA1 og KY170R-kapløbet celler blev dyrket i komplet medium til 70% til 80% tæthed. Efter trypsinbehandling blev celler vasket en gang med PBS og talt. Den mandlige, 4 uger gamle til 6 uger gamle nøgne mus blev randomiseret i to gruppe og injiceres i den øvre del af et bagben med en densitet på 2 * 10

6/100 pi KY170R-shRNA1 og KY170R-scramble celler. Tumorvækst blev overvåget dagligt, og når tumoren diameter nåede 6 til 8 mm, blev de “bestråling gruppe” dyr bestrålet en gang med en dosis på 15 Gy. Den regression i orthotrop tumorvækst blev fulgt i op til 36 dage, idet tumor volumen beregnet som formlen V = π /6 (a * b

2), hvor a er den længste og b er kortere vinkelret tumor akse. Tumor volumen blev målt indtil tumorerne nåede et volumen på ca. 1,0 cm

3. Derefter blev musene aflivet ved cervikal dislokation for efterfølgende eksperimenter.

Immunhistokemi af vævssnit

Immunhistokemi af humane kræft i spiserøret vævssnit, erhvervet fra patologi afdeling af Peking University First Hospital, og xenotransplantattumorer blev udført som følger: 4-6 um vævssnit blev monteret og opvarmet ved 72 ° C i 30 minutter. Snit blev afparaffiniseret med xylen, rehydratiseret i graduerede EtOH og skyllet med 0,1 M Tris-HCl (pH 7,6). Endogen peroxidaseaktivitet blev blokeret ved at inkubere vævssnit med 3% H

2O

2 i 30 min. Antigen genfinding blev udført med 0,01 M natrium citronsyre-buffer (pH 6,0) ved 95 ° C i 1 time. Ikke-specifik binding blev blokeret ved inkubering af vævssnittene med 0,1 M Tris-HCl indeholdende 10% gedeserum i 2 timer. AKR1C3 blev derefter bestemt ved inkubering af sektionerne med muse-anti-AKR1C3 monoklonalt antistof i en 1:200 fortynding i ovennævnte blokeringsopløsning i et fugtigt kammer ved 4 ° C natten over. Efter vaske med 0,1 M Tris-HCI, blev sektionerne behandlet med 1:400 fortynding af biotinyleret heste anti-mus sekundært antistof og inkuberet ved stuetemperatur i 2 timer. Efter yderligere skylning med 0,1 M Tris-HCI, binding antistof blev påvist ved inkubation af vævssektioner med HRP-konjugeret streptavidin ved stuetemperatur i 30 min. DAB-H

2O

2 substrat blev derefter tilsat til objektglassene som blev inkuberet ved stuetemperatur i yderligere 4 min. Vævssnit blev farvet med hematoxylin, dehydreret i gradueret alkohol, klaret i xylen, og monteret med Permount Montering Media for visualisering af lys-mikroskopi.

Statistisk analyse

anvendtes The Student t-test at bestemme den statistiske forskel hjælp af to grupper og data. P-værdier. 0,05 blev betragtet som signifikante

Etik Statement

Dyret Undersøgelsen blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i Vejledning for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes Sundhedsstyrelsen. blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse. Og skriftlige informerede samtykke blev opnået fra alle patienter eller deres familier til forskning ved hjælp af disse vævsprøver. Alle celle, dyreforsøg og Immunhistokemi af vævssnit undersøgelse er blevet godkendt af Peking University Institutional Review Board (Certifikat nr IRB00001052-12037).

Resultater

De differentierede udtryk for AKR1C3 i kræftceller

for at belyse ætiologien af ​​radioresistance, to radioresistente esophageal tumor-kloner, KY170R og TE13R, er blevet etableret ved kontinuerlig fraktioneret bestråling af deres forældre celler, KY170 og TE13 [20]. Genom-dækkende profilering af genekspression i KY170R

v.

KY170 og TE13R

v.

TE13 hjælp oplyse Menneske-6 V3 microarray viste, at over 900 gener viste sig at være bemærkelsesværdigt differentierede (fig. 1A), i overensstemmelse med tidligere rapport [21]. Blandt dem, AKR1C3, en aldo-keto-reduktase eksisterende på et lavt niveau i de fleste humane væv, tiltrak vores opmærksomhed på grund af sin betydelige udtryk i både radioresistente celler. Real time RT-PCR (. Fig 1B) og Western blotting (. Figur 1C) analyser bekræftede den forhøjede ekspression af AKR1C3 i KY170R og TE13R celler, henholdsvis i forhold til deres parentale celler: ~ 10-fold ved mRNA-niveauet og meget højere på proteinniveauet. Denne profil afslørede sammenfaldet af forhøjet udtryk for AKR1C3 og radioresistance i esophageal KY170R og TE13R kræftceller. Colony-formation analyser bekræftet, at KY170R og TE13R var faktisk mere modstandsdygtige over for IR end deres forældre KY170 og TE13 celler, med den estimerede dosis for reduktion af overlevelse med 90% for KY170 vs. KY170R som 5,5 Gy vs. 7,8 Gy (Fig. 1C ).

(A) genom-bred profilering af genekspression i radioresistente KY170R og TE13R

versus

radiosensitive KY170 og TE13 henholdsvis 0, 8 timer og 24 timer efter bestråling. (B) Validering af den forhøjede ekspression af AKR1C3 på mRNA-niveauet i KY170R vs. KY170 og TE13R vs. TE13 celler før og 8 og 24 timer efter bestråling som bestemt ved RT-PCR. (C) Validering af forhøjet udtryk for AKR1C3 i radioresistente KY170R bestemt af Western blot og følsomheden af ​​KY170 og KY170R celler til bestråling som bestemt ved en koloni-formation assay.

Effekten af ​​AKR1C3 på respons af tumorceller til bestråling

i betragtning af den betydelige forskel i ekspression af AKR1C3 mellem resistente og ikke-resistente kræft i spiserøret celler, vi spørgsmålstegn ved, om det kunne være en primær årsag eller blot en nedstrøms konsekvens af radioresistance. For at undersøge dette spørgsmål, ekspressionsniveauerne af AKR1C3 i KY170R og TE13R blev nedreguleret ved shRNAs leveret af lentivector pSD31 og virkningerne af AKR1C3 knockdown på radioresistance blev karakteriseret. For at udelukke off-target spørgsmål blev tre shRNAs udnyttes parallelt at belyse effekten af ​​RNAi på KY170R celler med en kapløbet shRNA som en negativ kontrol. Western blotting-analyse viste, at alle tre shRNAs anvendt i denne undersøgelse udøvede stærk potens i transducerede KY170R celler med 80% AKR1C3 bliver nedreguleret i forhold til scramble-shRNA (figur 2A.). Karakterisering af AKR1C3 knockdown på celleproliferation viste, at KY170R-shRNA1, KY170R-shRNA2 og KY170R-shRNA3 (tre stabile cellelinjer genereret af pSD31-medieret transduktion) tilvækst på næsten samme hastighed som KY170R-scramble celle, som selv havde en sats næsten identisk med den, der ses i KY170R og KY170 celler (fig. S1A i File S1). Dette antyder, at AKR1C3 er ikke en påkrævet gen til proliferation af disse cancerceller. Derimod bestråling beskrevet den biologiske effekt af AKR1C3 om fremme celleoverlevelse. Colony-formation analyser viste, at de transducerede KY170R-shRNA1, -shRNA2 eller -shRNA3 celler blev væsentligt mere følsomme over for stråling med færre kloner dannet end KY170R-kapløbet celler (fig. 2B-C og fig. S1B i File S1), som havde en estimeret dosis på 6,5 Gy til reduktion af overlevelse med 90%, langt højere end KY170R-shRNA1 celler (~4.5 Gy).

(A) Repræsentative observationer af stabil knockdown af AKR1C3 i KY170R celler ved tre uafhængige shRNAs og overekspression af AKR1C3 i KY170 celler. (B) Virkningerne af AKR1C3 knockdown i KY170R celler og AKR1C3 overekspression i KY170 om resultatet af bestråling, doseret fra 0 til 8 Gy, bestemt ved koloni-dannelse assay. En scramble shRNA (scr.), Og den tomme pcDNA3.1 vektor fungerede som en negativ kontrol, hhv. (C) Overlevelseskurverne for sammenligninger af effekten af ​​AKR1C3 af følsomheden af ​​KY170R celler (knockdown) og (D) KY170 celler (overekspression) til bestråling, som bestemt ved koloni-dannelse analyser.

bekræftelse af AKR1C3 virkning på respons af tumorceller for bestråling

for at bekræfte den beskyttende virkning af AKR1C3 beskrevet af RNAi, den radioresistente KY170R og dets parentale KY170 celler blev dyrket i nærvær af 200 uM methyljasmonat (MJ) og derefter bestrålet. MJ er en veletableret lille molekyle med sin struktur ligner til prostaglandiner, substratet af aldo-keto-reduktaser, og virker således som en kompetitiv inhibitor af AKR1C3. MEJ viser stor styrke i det cellulære system på grund af den øgede cellulær optagelse med sin IC

50 for AKR1C3 på -150 uM [22]. Det blev fundet, at behandling med MEJ også væsentligt forbedret respons KY170R celler for bestråling og sådan MJ-medieret forøgelse blev ikke observeret i KY170 celler (Fig. S1c i File S1). Det fremgik, at undertrykkelse af AKR1C3 aktivitet via dets kemiske inhibitor kunne også bevidstgøre KY170R celler til IR. Endvidere har vi undersøgt, om forhøjet ekspression af AKR1C3 alene kan forårsage KY170 celler at være resistente for bestråling. En AKR1C3 ekspressionskonstruktion, pcDNA3.1-AKR1C3, blev indført i parentale KY170 celler til generering AKR1C3-overekspression transfektanter (fig. 2A). Det blev konstateret, at overekspression af AKR1C3 i KY170 celler, om en 5-fold forøgelse, tillod flere kolonier for at overleve end i tilfældet med pcDNA3.1-transficerede celler på den samme dosis af bestråling (fig. 2B og 2D). Det er klart, det er den forhøjede udtryk for AKR1C3 der gør både KY170R og TE13R celler væsentligt resistente over for stråling.

Virkningen af ​​AKR1C3 på væksten af ​​bestrålede xenotransplantattumorer

Vi derefter udforskes, om AKR1C3- medieret cellulær radioresistance var også operativt i xenotransplantattumorer. To xenograftmodeller blev oprettet ved subkutant implantere KY170R-shRNA1 og KY170R-kapløbet celler, hver for sig, i nøgne mus. Vi fandt, at begge xenotransplantation tumorer voksede hurtigt med den tidligere voksende bare lidt langsommere end den sidstnævnte (fig. 3A og B), støtter det cellebaserede iagttagelse, at AKR1C3 har langt mindre virkning på tumorvækst. Når tumorerne havde nået et gennemsnitligt volumen på ca. 100 mm

3 (fig. 3A), 20 xenograft mus fra hver type blev valgt, halvdelen af ​​dem blev underkastet lokal stråling ved en enkelt dosis på 15 Gy og halvdelen forblev ubehandlet . Vi fandt alle xenotransplanterede tumorer i 10 bestrålede KY170R-shRNA1 mus følsomme for IR behandling med 8 mus bliver næsten tumor-fri 5 uger efter bestråling (fig. 3A-B, og fig. S2 i File S1). Farvning med hematoxylin og eosin (HE) afslørede fravær af neoplasma, men kun en lille indskrumpet rest i de bestrålede xenotransplantater (fig. 3A). Derimod er de ikke-bestrålede xenotransplantattumorer i KY170R-shRNA1 og KY170R-kapløbet mus voksede til en gennemsnitlig volumen på 1000 mm

3 med fuld prolifererende celler (Fig. 3A-B, og fig. S2 i File S1). I tilfælde af musene med KY170R-scramble xenotransplantater, bestråling førte til et dårligt resultat: tumorvækst blev oprindeligt undertrykt ved bestråling men genoptages inden for to uger (Fig 3B.); omfattende neoplasme og stærk AKR1C3 ekspression blev påvist i tumorvæv (fig. 3A). Disse resultater er beskrevet virkningen af ​​AKR1C3 elevation i at beskytte xenotransplantattumorer fra bestråling, hvilket bekræfter hypotesen afledt af cellebaserede forsøg.

(A) Repræsentative observationer af væksten af ​​xenograft KY170R-scramble og KY170R-shRNA1 tumorer , og svarene fra disse tumorer til en enkelt dosis (15 Gy) bestråling i form af tumor volumen, HE farvning og immunkemisk farvning af AKR1C3. (B) Tidsforløbet for væksten af ​​KY170R-scramble og KY170R-shRNA1 xenotransplantattumorer med eller uden en lokal IR behandling.

Mekanismestudier belysning af AKR1C3-medieret radioresistance

At udforske den mekanisme, hvormed AKR1C3 udøver sin virkning på resultatet af IR, vi sammenlignet niveauerne af cellulære ROS og DNA-skader, de kritiske mæglere og den umiddelbare konsekvens af IR-induceret celledød [23], i KY170R-shRNA1 versus KY170R-scramble celler. Det konstateredes, at før bestråling ca. 2 gange mindre ROS var i KY170R-scramble end i KY170R-shRNA1 celler (Fig. 4A-B). Ved bestråling, niveauet af ROS forblev lav i KY170R-kapløbet celler, men bemærkelsesværdigt forøget i KY170R-shRNA1 celler med den forskel, næsten 3 folder (fig. 4B). Sammenfaldende med samtidig AKR1C3 knockdown og ROS stigning i bestrålede KY170R-shRNA celler, antallet af foci af phospho-γ-histon (fig. 4C-D), en biomarkør for DNA-skader [24], ledsaget af mange flere kromosomale brud og brutto nukleare abnormiteter (fig. S3A-B i File S1), var meget højere end i bestrålede KY170R-kapløbet celler 48 timer efter bestråling. En parallel forsøg udført i nærvær af N-acetylcystein (NAC), et kemisk middel af ROS [25], viste, at IR-induceret DNA-skader i KY170R-shRNA1 celler og de afledte morfologiske træk blev forhindret (fig. 4E) . Vi konkluderede, at AKR1C3 har samme evne som NAC at afhjælpe oxidativt stress og dermed mindske stråling-induceret DNA-skader, der giver radioresistance.

(A) Repræsentant mikroskopisk billede af ophobning af ROS i KY170R-scramble

v.

KY170R-shRNA1 celler farvet af DHE. (B) kvantificering af ROS-niveauer i KY170R-scramble

v.

KY170R-shRNA1 celler før og 24 timer efter IR ved en dosis på 4 Gy. (C) Repræsentant mikroskopisk billede af phospho-γ-histon foci i KY170R-scramble

v.

KY170R-shRNA1 celler. (D) karakterisering af phospho-γ-histon i testede celler ved Western blotting. (E) N-acetylcystein (NAC) -medieret scavenging af ROS ved en IR dosis på 4 Gy. Hver kvantitativ måling blev udført i tre eksemplarer og gentages mindst to gange med en fejl bar mindre end 25%.

Retrospektive studier af radioresistance og AKR1C3 udtryk i esophageal karcinomer

Vi udførte retrospektive undersøgelser for at vurdere den potentielle relevans af AKR1C3-relaterede radioresistance i esophageal karcinomer. Esophageal tumor prøver, et lille stykke af tumor prøver taget for patologisk diagnose, blev indsamlet fra 28 patienter, der var ude af stand til eller uvillige til at acceptere kirurgi (tabel S1 i File S1). Disse tumorprøver blev derefter screenet via immunohistokemi til bestemmelse af ekspressionsniveauerne af AKR1C3. Alle patienter accepterede esophageal seng område konform strålebehandling med dosis stråling ved 58-64 Gy. De helbredende virkninger blev vurderet ved at gennemgå brystet CT én måned efter strålebehandling. Af disse patienter var 20 medfødt resistente med tumorvolumener krympede mindre end 50% ved IR; 8 var radiosensitive og blev næsten tumor-fri på IR behandling.

immunhistokemisk farvning analyser viste, at 7 (35%) af de radioresistente tumor prøver viste høje niveauer (+++,

dvs.

75% tumorceller er AKR1C3 positive), og 8 (40%), der vises mellemliggende niveauer af AKR1C3 udtryk (++,

dvs.

75% ~ 50% tumorceller indeholder AKR1C3 protein) (fig 5A-B. og fig. S4 i File S1). De resterende 5 (25%) havde en lav eller ikke-detekterbare niveauer af AKR1C3 udtryk (+/-,

dvs..

0-50% tumorceller var AKR1C3 positiv). Derimod blev ingen af ​​de 8 radiosensitive tumorprøver fundet at udtrykke et højt niveau (+++) i AKR1C3. Kun 3 (37%) af de radiosensitive tumorprøver havde intermediære niveauer af AKR1C3 men 5 (63%) udviste en lav eller udetekterbar niveau (+/-) af AKR1C3 ekspression (fig. 5A-B, og fig. S4 i File S1) . Det er klart, en stærk korrelation (p 0,017) eksisterer mellem forhøjet udtryk for AKR1C3 og radioresistance af esophageal carcinoma, hvilket indebærer, at AKR1C3 kunne være en prognostisk markør for cancer strålebehandling

(A) Subjektive niveauer af ekspression af AKR1C3. , nemlig høj (+++), mellemprodukt (++), lav eller ingen (+/-), i esophageal carcinomer. (B) Niveauer af ekspressionen af ​​AKR1C3 i esophageal carcinoma fra 28 patienter, der var medfødt følsom eller resistent over for IR.

Diskussion

ROS er de vigtigste formidlere af cellulær oxidativ stress, som bestemmer det cellulære redox miljøet [26]. Høje niveauer af ROS er kritiske i IR-induceret celledød. Bestrålede celler, især dem med vekslende eksponering, der genererer overdreven ROS, vil eksistere i en tilstand af oxidativ belejring, hvor overlevelse kræver celler til at give deres forsvarssystemer til at undslippe oxidative skader. Det er blevet påvist, at superoxiddismutase udgør den første linje af antioxidant forsvarssystemer – katalyserer nedbrydningen af ​​superoxid i brint peroxider, som derefter fjernes ved katalase [23]. Forhøjede udtryk for superoxiddismutase 1 (SOD1) er blevet rapporteret i humane gliomer og dermed tillægges radioresistance [15], [16]. Glutathionperoxidase og methionin reduktase er også antioxidant enzymer, der metaboliserer ROS [23].

I denne undersøgelse rapporterede vi sammenfald af differentiering af AKR1C3 ekspression, cellulær ROS niveau og DNA-skader i radioresistente KY170R kontra ikke-resistent KY170 celler. Vi foreslår, at AKR1C3 er en cellulær komponent, der deltager i processen med scavenging af cellulær ROS, deler de samme egenskaber som antioxidant enzymer, i det mindste i

in vivo

at undslippe oxidativ skade (fig. 6). Fjernelse af ROS, enten ved antioxidant enzymer, AKR1C3 eller andre uidentificerede cellulære faktorer, kunne være en fælles mekanisme konto for radioresistance. I modsætning glutathionperoxidase (GPX), peroxiredoxin (TPX) og superoxiddismutase (SOD), som findes i det væsentlige alle levende organismer, er AKR1C3 udtrykkes på et relativt lavt niveau i de fleste normale væv undtagen prostata og brystkirtel [27], [28 ]. Således kan ekspressionsniveauet af AKR1C3 i tumorceller være nyttig som en biomarkør til forudsigelse af cellulær radioresistance.

AKR1C3 har modtaget omfattende opmærksomhed på grund af sin stærke reduktiv aktivitet overfor en række forskellige substrater. Det katalyserer NADPH-afhængig reduktion af endogene aldehyder og ketoner til de tilsvarende alkoholer [28], [29]. Det katalyserer også omdannelsen af ​​prostaglandin D

2 (PGD2) til 11β-PGF2, PGH2 til PGF2a og quinon at catechol [30].