PLoS ONE: Ny blokerende antistoffer hindre vedhæftning, migration og overlevelse af kræft i æggestokkene Cells, Fremhævning MFGE8 som en potentiel terapeutisk mål for Human Ovarian Carcinoma

Abstrakt

Milk Fat Globule – EGF – faktor VIII (MFGE8), også kaldet lactadherin, er et udskilt protein, som binder ekstracellulært til phosphatidylserin og avp3 og αvβ5 integriner. På mennesker og mus celler, der udtrykker disse integriner, såsom endotelceller, fagocytter og nogle svulster, har MFGE8 /lactadherin vist sig at fremme overlevelse, epitelial til mesenkymale overgang og fagocytose. En protumoral funktion MFGE8 er derfor blevet dokumenteret i et par typer af humane kræftformer, herunder melanom, en undertype af brystkræft, og blære karcinom. Inhibering funktioner MFGE8 kunne således repræsentere en ny type terapi for humane cancere. Her viser vi ved immunhistokemi på en samling af humane ovariecancere som MFGE8 overudtrykkes i 45% af disse tumorer, og vi bekræfter, at den er specifikt overudtrykt i triple-negative undertype af humane brystcancere. Vi har etableret nye

in vitro

analyser til at måle effekten af ​​MFGE8 på overlevelse, vedhæftning og migration af menneskelig ovarie og tredobbelt-negative brystkræft cellelinier. Under anvendelse af disse assays kunne vi identificere nye MFGE8-specifikke monoklonale antistoffer, som effektivt blokerede disse tre tumorfremmende effekter af MFGE8. Vores resultater tyder på fremtidige brug af MFGE8-blokerende antistoffer som nye kræftlægemidler i undergrupper af ovariecancer og triple-negative bryst carcinom patienter

Henvisning:. Tibaldi L, Leyman S, Nicolas A, Notebaert S, Dewulf M, Ngo TH, et al. (2013) Nyt blokerende antistoffer hindre vedhæftning, migration og overlevelse af kræft i æggestokkene Cells, Fremhævning MFGE8 som en potentiel terapeutisk mål for Human æggestokkene karcinom. PLoS ONE 8 (8): e72708. doi: 10,1371 /journal.pone.0072708

Redaktør: Jung Weon Lee, Seoul National University, Republikken Korea

Modtaget: Januar 18, 2013; Accepteret: 15 juli 2013; Udgivet: 16 august, 2013 |

Copyright: © 2013 Tibaldi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Institut Curie, INSERM, Association pour La Recherche contre le Cancer, en præmie fra Fondation de France, og en to-års samarbejde kontrakt mellem Institut Curie, INSERM, og ThromboGenics NV, Leuven, Belgien (www.thrombogenics.com) . ThromboGenics NV skitserede strategien for antistof generation, udført musene immunisering, tjekket specificiteten af ​​de nye anti-humane MFGE8 antistoffer, sekventeret deres variable regioner, og deltaget i udformningen af ​​test for udvælgelse af de ledende kandidat antistoffer.

Konkurrerende interesser: forfatterne har læst tidsskriftets politik og har følgende konflikter: en del af dette arbejde blev støttet af finansiering til Clotilde Thery team herunder Lorenzo Tibaldi løn, som et samarbejde kontrakt mellem Institut Curie, INSERM, og ThromboGenics NV, Belgien. Shirley Leyman, Sofie Notebaert, Tors Hoa Ngo og Claudia Zuany-Amorim er ansat af ThromboGenics NV. En international PCT-ansøgning, der dækker de beskrevne antistoffer, medejer af ThromboGenics NV, Institut Curie og INSERM, er blevet arkiveret under nummer PCT /EP2013 /056.057. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer med akademiske laboratorier.

Introduktion

For at udvikle sig som en regulær tumor, skal en celle ikke kun erhverve celle-autonome egenskaber spredning og modstandsdygtighed over for programmeret død, men også etablere interaktioner med sin mikromiljø tillader dets vedvarende spredning, og undgå dens elimination [1]. Fibroblaster, endotelceller danner blodkar og immunceller alle veksel- signaler med de transformerede celler gennem direkte ligand-receptor-interaktioner, samt ved hjælp af opløselige faktorer og ekstracellulære membranvesikler, der virker i en afstand fra tumorcellerne. Tumorer kan således udskille vækstfaktorer handler i en autokrin måde til at opretholde deres overlevelse, men også i en parakrin måde på de andre celler i deres mikromiljø

Milk Fat Globule -. EGF – faktor VIII (MFGE8), også kaldet lactadherin, er et af disse udskilte faktorer med pleiotrope potentielle funktioner. Oprindeligt klonet som et vigtigt protein mælk fedtkugler [2,3], kvæg, human (MFGE8) og mus (Mfge8) proteiner er blevet vist at indeholde to forskellige funktionelle domæner: EGF-lignende domæner, herunder en RGD-indeholdende sekvens binding at avp3 og αvβ5 integriner, og faktor VIII-lignende (eller discoidin) domæner binding til phospholipider (phosphatidylserin og phosphatidylethanolamin). MFGE8 /Lactadherin er således bundet ikke-kovalent til lipider på ekstracellulære vesikler, og interagerer med target-celler, der udtrykker avp3 /5 integriner. MFGE8 binding til endotelceller er blevet vist at fremme VEGF-afhængig overlevelse og angiogenese [4] samt fagocytose af apoptotiske celler [5]. Hos mus, Mfge8 fremmer fagocytose af apoptotiske celler af makrofager [6], og forvrænger dem til at udskille tolerogeniske cytokiner [7]. På nogle tumorcellerne selv, blev MFGE8 vist at inducere epitelial til mesenkymale overgang [8,9], og /eller at øge modstanden til lægemiddel-induceret apoptose [10,11].

Alle disse resultater fremhæver MFEG8 som et lovende mål for inhibitorer, der kunne udvikles til at begrænse tumor progression. I nogle typer af humane cancere, har en pro-tumoral rolle MFGE8 blevet påvist, baseret på en høj overekspression under tumorprogression, og /eller ved analyse af musemodeller: disse cancere indbefatter blærecarcinom (vores eget arbejde [12]), melanom [8], og triple-negative undertype af brystkræft [13]. Men i nogle andre kræftformer, såsom hormonreceptor (HR) og /eller HER2-udtrykkende humane brystcancere [13], MFGE8 ikke overudtrykkes, og det synes i stedet at forhindre tumorudvikling. Således genererer nye værktøjer til at hæmme de pleiotrope funktioner MFGE8, samt identificere de rette menneskelige kræft mål for sådanne værktøjer, skal udføres samtidig, hvis vi håber at opnå effektive nye behandlinger.

Her ved at analysere MFGE8 ekspression i store arrays af humane tumor biopsier, og ved at etablere nye funktionelle assays til måling af virkningerne af MFGE8 og nye MFGE8-blokerende antistoffer på fysiologien af ​​tumorceller, identificerede vi ovariecarcinom, og bekræftet triple-negative brystcarcinoma som lovende mål som kunne drage fordel af MFGE8-hæmmende behandlinger.

Resultater

MFGE8 overekspression i ovariecancer

i et tidligere arbejde, brug af offentligt tilgængelige mRNA udtryk data indsamlet i oncomine hjemmeside (

www.oncomine.org

), observerede vi en signifikant opregulering af

MFGE8

gen på transkriptom niveau i en delmængde af humane kræftformer, herunder æggestokkene serøse adenokarcinomer [12]. I betragtning af behovet for nye behandlinger for denne kræftform, som ofte præsenterer på fremskredent stadium, besluttede vi at yderligere at udforske roller MFGE8 i ovariecancer. For at bekræfte observationen af ​​

MFGE8

mRNA overekspression på proteinniveauet, vi brugte to tumor mikroarrays genereret internt, som indeholder 50 biopsier fra æggestokkene patienter i alle kvaliteter og typer (Tabel S1) kræft. Immunhistokemi til påvisning MFGE8 i disse tumorer blev udført under anvendelse af vores tidligere beskrevne kanin polyklonalt anti-MFGE8 antistof [4], og analyse af de farvninger blev udført af en patolog. Som tidligere rapporteret [4,12] blev MFGE8 påvist i blodkarrene til stede i tumorer (pil i figur 1a). Desuden blev MFGE8-positive tumorceller selv observeret i flere biopsier. Som vist i figur 1a, det samlede ekspressionsniveau af proteinet var variabel mellem individuelle tumorer, der spænder fra fraværende (0), til meget stærk i hele tumoren (3). Ranking tumorer i henhold til niveauet af MFGE8 protein (figur 1b) viste, at 45% (22/48) stærkt udtrykt MFGE8 (niveau 2-3). MFGE8-overudtrykker tumorerne var af alle grader (1 til 3, Figur 1b), af alle typer, og af forskellige metastatisk status (tabel S1), således MFGE8 overekspression kunne ikke anvendes som enten en prognostisk eller diagnostisk markør for ovariecancer. Den høje andel af tumorer overekspression MFGE8 dog fået os til yderligere at udforske sin værdi som et terapeutisk mål for ovariecancer

(a) Eksempler på menneskelige MFGE8 immunhistokemi på ovariecancer sektioner viser:. Ingen farvning af tumorceller (score 0), men MFGE8-positive endotelceller (sort pil) i venstre panel. Områder med svag udtryk (w) og af middel udtryk (m), i MFGE8 i samme afdeling, således rangeret som score to i midten panel. Stærk MFGE8 udtryk (r) i hele tumoren, rangeret som score 3 (højre panel). (B) Scoring af MFGE8 ekspression (y-akse) i 48 ovariale tumorbiopsier fra Institut Curie-patienter, som en funktion af tumor bedømmelse (x-aksen). Ingen statistisk signifikant forskel blev observeret i fordelingen af ​​tumorer overekspression MFGE8 (score 2-3) eller ej (score 0-1) i grad 2 versus grad 3 tumorer.

Udvikling af in vitro assays til kvantificering virkningerne af MFGE8 på æggestokkene kræftceller

Siden MFGE8 er blevet vist i forskellige celletyper, herunder nogle tumorceller, for at fremme vedhæftning, overlevelse og /eller epitelial-til-mesenkymale overgang muligvis kan føre til migration, vi nedsat nye

in vitro

analyser til at måle disse fysiologiske resultater i forbindelse med ovariecancer. I de fleste undersøgelser blev disse virkninger af MFGE8 tilskrives dens bindende for avp3 og /eller αvβ5 integriner på målceller. For at vælge cellelinjer for at vurdere virkningen af ​​anti-MFGE8 terapier, vi først analyseret mRNA ekspressionsniveauet af

MFGE8

og dets receptorer i en samling af humane ovarie cancer cellelinjer. Offentlige resultater fra de overordnede-Novartis Cancer cellelinje Encyclopedia blev anvendt til dette formål (https://www.broadinstitute.org/ccle/home). Ud af de 38 tumor cellelinier (figur 2a), har kun fem ikke udtrykke

MFGE8

over konfidensniveau ((MAS5 “Fraværende” flag svarende til en Affymetrix U133plus2.0 udtryk signal (Log

2 .) lavere end 6,1 for denne probeset) vi bekræftede MFGE8 proteinsekretion af ELISA-analyse af det konditionerede medium af to af de mRNA-udtrykkende cellelinier: SKOV-3 og IGROV-1, og vi identificeret en anden ovariecarcinom cellelinie SHIN- 3 [14], som ikke secernerer detekterbare niveauer af MFGE8

in vitro

(figur 2b). de 38 tumorcellelinjer udtrykte generne kodende av (

ITGAV

, ekspression signal over 10 i de fleste tilfælde, data ikke vist), og β5 integrin kæder (

ITGB5

, figur 2c). derimod Affymetrix signal for β3 integrinkæde (

ITGB3

) var kun nær tillid niveau (ekspressionssignal = 4,8 for denne probeset) for de fleste cellelinier (23/38 = 60,5%), herunder SKOV-3 og IGROV-1, hvilket antyder svag eller ingen ekspression af dette integrin. ved flowcytometri imidlertid både SKOV-3 og IGROV-1 vises avp3 foruden αvβ5 på deres overflade, mens SHIN-1 vises kun αvβ5 (figur 2d). Vi valgte derfor at SKOV-3 cellelinie som et repræsentativt eksempel på en stor del af de æggestokkene kræft cellelinier (medium-til-høj

MFGE8

, påviselig

ITGB3

ITGB5

), og en modtagelig til at reagere på MFGE8 da det udtrykte de kendte receptorer for MFGE8, at udvikle de funktionelle

in vitro

analyser.

(a) Analyse af mRNA ekspression niveauer ( Log

2 (Affymetrix U133plus2.0 signal)) af

MFGE8

på offentlige resultater af microarray data i de overordnede-Novartis Cancer cellelinje Encyclopedia. tærsklen Ekspressionsniveauet bag hvilket kunne anses som støj (MAS5 “Fravær” flag status, gen ikke udtrykkes) er 6,1 for denne probeset. Sorte pile angiver SKOV-3 og IGROV-1 cellelinier. (B) Kvantificering af MFGE8 ved ELISA i SKOV-3, IGROV-1 og SHIN-3 konditioneret medium (24 h). Secerneret MFGE8 udtrykkes i ng /ml per 10

6 dyrkede celler. Gennemsnit af to eksperimenter + SD. (C) Analyse af mRNA-ekspressionsniveauer (Log

2 (Affymetrix U133plus2.0 signal)) af

ITGB3

(rød) og

ITGB5

(grøn) på offentlige resultater af microarray data af de overordnede-Novartis Cancer cellelinje Encyclopedia. tærsklen Ekspressionsniveauet bag hvilket kunne anses som støj (MAS5 “Fravær” flag status, gen ikke udtrykkes) er 4,8 til

ITGB3

probeset. (D) FACS-analyse af avp3 (øverste felt) og αvβ5 (nederste panel) integriner ekspression ved overfladen af ​​SKOV-3, IGROV-1 og SHIN-3-celler. Specifikt antistof (blå linie). Isotypekontrol (rød linje).

Vi udviklede 3 typer assays til at undersøge virkningerne af MFGE8 på adhæsion, migrering og overlevelse af tumorcellerne. Det xCELLigence systemet (ACEA Biosciences), en anordning, der sikrer tidstro måling af cellebinding til et substrat, blev anvendt til at kvantificere kortsigtede adhæsion til humant rekombinant MFGE8 (Figur 3a-e), og langvarig transwell overgangen til MFGE8 i tilstedeværelsen af ​​føtalt kalveserum (FCS 0,1%) (figur 3F-H). Klassisk fluorescens-baserede kvantificering af celleantal blev anvendt til at vurdere overlevelse i sult betingelser (figur 3i, j) på lang sigt.

(a-e) Assay for adhæsion af SKOV-3 til MFGE8 hjælp af xCELLigence systemet . (A) Eksempel på celle (Cl) som en funktion af tid, på PBS eller humant MFGE8 (huMFGE8), i nærvær af anti-huMFGE8 eller kontrol IgG. Blå og røde lodrette linjer angiver de tidspunkter, der anvendes til beregning af hældning værdier. (B) Adhæsion af SKOV-3 til MFGE8, sammenlignet med PBS (Ctrl), kvantificeret ved hældning værdi mellem 0 og 2 timer. (C) Hæmning af adhæsion til 5 ug /ml MFGE8 med 10 ug /ml anti-huMFGE8 (hMc3) eller en negativ kontrol (Rituximab, Ritux). (D) Virkning på adhæsion til 5 ug /ml MFGE8 (Ctrl) af polyklonalt anti-huMFGE8 sera (1/100) specifikt for RGD-domæne (anti RGD), C1-domænet (anti C1) eller RGD domæne af muse Mfge8 (anti mus RGD). (E) Inhibering af adhæsion til 5 ug /ml MFGE8 (Ctrl) af anti-avp3 og /eller -αvβ5 integrin antistoffer (5 ug /ml hver). (F-g) Indhold for migration af SKOV-3 ved hjælp xCELLigence. Celler blev udsået i det øvre kammer, og MFGE8 og antistoffer i det nederste kammer af CIM-plader. (F) Eksempel på celle indeks (y-akse) som funktion af tid (x-akse), under lignende betingelser som (a). Blå og røde lodrette linjer angiver de tidspunkter, der anvendes til beregning af hældning værdier. (G) Dosisafhængig virkning MFGE8 på SKOV-3 migration, sammenlignet med PBS (Ctrl), kvantificeret ved hældning værdi mellem 0 og 18 timer. (H) Inhibering af migration til 5 ug /mL huMFGE8 ved 10 ug /ml anti-huMFGE8 hMc3, sammenlignet med negativ kontrol (Ritux). (I-j) Overlevelse assay af SKOV-3 dyrket i 96 timer i nærværelse af 0,1% serum. Celle nummer kvantificeres som fluorescensenheder arbitrære enheder (A.U.) sammenlignet med kontrolgruppen tilstand svarer til 100%. (I) Dosisafhængig virkning MFGE8 på SKOV-3 overlevelse. 100% = basalt A.U. i fravær af eksogent MFGE8 (Ctrl). (J) Inhibering af overlevelse i nærvær af 10 pg /mL huMFGE8, ved 10 pg /mL hMc3 eller det negative antistof. 100% = basalt A.U. i overværelse af MFGE8. Data er repræsenteret som Box-og-whiskers grafer, der viser den mindste (nederste fejl bar), 25

percentil-median-75

percentil og maksimum (øverste fejl bar) værdier. N = 4 (undtagen 3j: N = 5). *** = P 0,001; ** = P 0,01; * = P 0,05 sammenlignet med Ctrl = PBS i 3b, g; til 0,312 ug /m MFGE8 i 3i; eller Ctrl = MFGE8 i 3c, d, e, h, j ..

xCELLigence enhed måler løbende ændringer i impedans induceret af celler, når de støder på elektroder, der dækker bunden af ​​en kultur mikrobrønd (ePlate ). Niveauet af impedans-signalet er proportional med antallet af celler og intensiteten af ​​deres interaktion med substratet, og dette signal kan således omdannes til en vilkårlig celle indeksværdi (figur 3a, f). Effektivitet celle binding beregnes som hældningen af ​​impedansen observeret i de første to timer efter cellepodning (Figur 3a-e). For at måle vedhæftningen af ​​SKOV-3 til MFGE8 blev rekombinant human MFGE8 coated på xCELLigence mikrobrønde, under forhold svarende til dem, vi tidligere havde brugt til at analysere binding af humane endotelceller til MFGE8 [4]. Figur 3b viser, at MFGE8 tillod binding af cellerne til substratet på en dosis-afhængig måde. Vi testede virkningerne af tidligere beskrevne antistoffer specifikke for human MFGE8 i dette assay: kaninsera genereret i vores laboratorium, anerkender henholdsvis enten RGD-integrin-bindende domæne [4] eller discoidin C1-domænet af human MFGE8 (C. Thery, upublicerede data) og en humaniseret version af MC3 monoklonale antistof beskrevet af Ceriani et al [15], (hMc3) [16] også anerkender integrin-bindende domæne af MFGE8. Både hMC3 antistof (figur 3c) og kanin-anti-RGD domæne (figur 3d) inhiberede stærkt celleadhæsion, mens hverken en kontrol humaniseret antistof (Ritux, figur 3c), eller kanin-anti-C1 domæne serum eller en kanin serum til RGD-domæne af muse Mfge8 (anti C1 eller antimuse RGD, figur 3d) inhiberede det. Endelig blokerende antistoffer mod avp3 eller αvβ5 hæmmede bindende, og deres virkninger var additiv (figur 3e). Således er adhæsion af SKOV-3 til MFGE8 medieret ved interaktion af de avp3 /5-udtrykkende celler med RGD-holdige domæne af MFGE8.

xCELLigence anordning blev dernæst anvendt med elektrodestrukturer-coatede Boydenkammer mikrobrønde ( CIM plader), som muliggør måling af impedansen fremstillet efter migrering af cellerne til den nedre side af en 8 um pore-filter adskiller den øvre fra det nedre kammer (fig 3f). Cellers evne til at migrere mod MFGE8-holdige nedre kammer, i nærvær af en identisk lille mængde FCS i begge rum (0,1%), blev beregnet som hældningen af ​​cellen på mellem 0 og 18 timer efter cellepodning i øvre kammer (figur 3F-H). Figur 3g og 3h viser, at MFGE8 inducerede SKOV-3 migration på en dosisafhængig måde, og at der som for adhæsionsassayet, hMC3 inhiberede specifikt denne effekt.

Det tredje assay målte virkningen af ​​MFGE8 på overlevelse SKOV-3 celler dyrket i sult betingelser (0,1% FCS). Tilstedeværelsen af ​​MFGE8 inducerede en dosisafhængig forøgelse af SKOV-3 overlevelse, påviselige fire dage efter podning (figur 3i), som ganske vist ikke meget stærk, var reproducerbar. Denne effekt blev også specifikt blokeret af MFGE8-specifikke hMC3 antistof (figur 3j).

Generering af nye anti-MFGE8 monoklonale antistoffer med anti-tumor egenskaber

For at validere vores nye robust og reproducerbar

in vitro

analyser som redskaber til at identificere nye MFGE8 blokerende midler, vi brugte dem til at screene et stort sæt af nye anti-MFGE8 antistoffer genereret ved at immunisere vores Mfge8-defekte mus [4,17] med rekombinant MFGE8. I alle assays blev forsøgsbetingelser sammenlignet med celler dyrket i nærværelse af MFGE8, betragtet som 100% signal. De monoklonale antistoffer Viser specifik binding til humant MFGE8

in vitro

, og ingen binding til andre proteiner med fælles strukturelle domæner (dvs. vitronectin og faktor VIII) blev testet i SKOV-3 adhæsion assay. De forskellige antistoffer viste forskellige inhibitoriske aktiviteter i dette assay. Figur 4a viser eksempler på resultaterne af den indledende skærm (udføres en gang) i 10 kandidater. Vi valgte fem antistoffer, som viste aktiviteter i lighed med reference antistof hMc3 når de anvendes ved 50 eller 10 ug /ml.

(a) Effekt af 10 nye anti-MFGE8 antistoffer (10 eller 50 mg /ml) på vedhæftning til MFGE8 (adhæsion assay), sammenlignet med hMC3. 100% vedhæftning svarer til 5 mg /ml MFGE8 coating uden antistoffer (CTRL). Eksempel på screening eksperimenter udført en gang med hver af de 40 nye antistoffer. Sorte pile angiver udvalgt til yderligere karakterisering antistoffer. (B) Dosis-respons virkning af de 5 udvalgte antistoffer, sammenlignet med hMC3 i adhæsionsassayet. (C) Dosis-respons virkning af de 5 udvalgte antistoffer, sammenlignet med hMC3 i migration assay. 100% migration svarer til 5 ug /ml MFGE8 uden antistoffer. (D) Dosis-respons virkning af de 5 udvalgte antistoffer, sammenlignet med hMC3 i overlevelse assay. 100% overlevelse svarer til 10 ug /ml rekombinant MFGE8 uden antistoffer. Box-og-whiskers grafer som i figur 3. N = 4 (undtagen i (c) for 215A9 -10 mikrogram /ml og 311A7 -0,625 mikrogram /ml: N = 3 og for hMc3: N = 2; i (b) for 215A9 -5μg /mL: N = 2). *** = P 0,001; ** = P 0,01; * = P. 0,05 sammenlignet med den laveste antistofkoncentration (0,5 eller 0,625 ug /m) for hver enkelt antistof i 4b, c, d

For at fastlægge effekten af ​​disse 5 kandidater, faldende mængder af antistof fra 50 til 0,5 pg /ml blev anvendt i adhæsionsassayet (figur 4b). I nærvær af 10 ug /ml hMc3 eller alle kloner, undtagen 346B6, iagttoges mindre end 20% af celleadhæsion. I tilfælde af 346B6 ved 10 ug /ml, blev 40% af celleadhæsion påvist (median på 4 målinger). I nærvær af 0,5 ug /ml tre kloner (416H9, 399A12 og 311A7), 60% celleadhæsion blev observeret, mens 90% adhæsion blev opnået med hMc3 ved denne koncentration.

Ved test i en dosis- respons indstilling i migration assay (figur 4c), alle antistoffer faldt migration, når de anvendes ved den højeste koncentration (20 ug /ml). To kloner (416H9, 399A12) signifikant nedsat migration, når de anvendes ved 2,5 ug /mL.

Endelig antistofferne blev testet i overlevelse assayet i nærvær af 10 pg /mL MFGE8 (= 100% overlevelse i figur 4d). 346B6, den mindst effektive klon i de to andre assays, ikke faldt overlevelse ved enhver koncentration, to andre induceret højst 30% inhibering (= 70% celleoverlevelse signal forblev) anvendes ved den højeste koncentration (2154A9 og 311A7), hvorimod de sidste to (416H9 og 399A12) var så effektiv som hMc3 og nedsat celleantal til mindre end 50% af de MFGE8-alone behandlede celler (= 50% overlevelse).

den kombinerede anvendelse af tre komplementære assays giver således den klare udvalg af 2 antistoffer, ud af 40, som potentielt de mest effektive redskaber til at samtidig hæmmer vedhæftning, migration og overlevelse MFGE8- og avp3 /5-udtrykkende ovariecancer.

Effekt af MFGE8 og MFGE8 blokerende antistoffer på andre ovariecancer celler

for at afgøre, om de opnåede med SKOV-3 resultater var repræsentative for andre æggestokkene karcinom cellelinjer, vi udførte de samme tre assays ved anvendelse IGROV-1 og SHIN-3, som, som vist i figur 2, hverken udtrykt MFGE8 og avp3 /5 integriner på niveauer svarende til SKOV-3 (IGROV-1), eller ikke udtrykke MFGE8 eller avp3 integrin (SHIN-3). Tre antistoffer er repræsentative for de tre typer effektivitetsgevinster observeret i SKOV-3 blev anvendt her: 399A12, 311A7 og 346B6, henholdsvis høj, middel og lav blokering effektivitet. I xCELLigence-baserede adhæsion assay (figur 5a, b), SHIN-3 gav en 20-gange lavere impedans signal end SKOV-3 eller IGROV-1 (sammenlign hældning værdier i figur 5b og 5a), men som i SKOV-3 adhæsion blev øget for begge cellelinier i nærvær af 5 ug /mL MFGE8, og inhiberet på en dosis-afhængig måde af de 3 antistoffer. I migration assay (figur 5c, d), hvor SHIN-3 vises en Migrationshastigheden ligner SKOV-3 og IGROV-1, de tre antistoffer inhiberede også MFGE8-afhængig migration af IGROV-1 og SHIN-3 i en dosis -afhængig måde, og med samme høj-, mellem- og lav effektivitet som i SKOV-3. Derimod overlevelse assayet (figur 5e, f) viste en anden virkning af MFGE8 på de tre cellelinier: SHIN-3 udviste ikke nogen øget overlevelse i nærvær af MFGE8, eller nogen virkning af MFGE8-blokerende antistoffer i dette assay, hvorimod IGROV-1 opførte sig som SKOV-3.

(a-b) Adhæsion af IGROV-1 (a) og SHIN-3 (b) til 5 ug /ml MFGE8, sammenlignet med PBS, kvantificeret ved hældning værdi mellem 0 og 2 timer. Virkningen af ​​tre udvalgte antistoffer leveret ved to doser (2,5 og 10 ug /ml) på MFGE8-coatede brønde er også vist. (C-d) IGROV-1 (c) og SHIN-3 (d) migration assay til 5 pg /mL MFGE8 som i figur 3-4, og inhibering med antistoffer som i panel a og b for adhæsion. Slopes værdier beregnet mellem 0 og 18 timer. (D-e) IGROV-1 (d) og SHIN-3 (e) overlevelse assay i nærvær af 10 pg /ml MFGE8, som i figur 3-4, og inhibering med 2,5 eller 10 pg /ml antistoffer. 100% overlevelse svarer til 10 pg /mL MFGE8 uden antistoffer. Box-and-whiskers grafer som i figur 3. N = 4 (undtagen i (B): 399A12 -2.5 pg /ml, 346B6 -10 ug /ml, 311A7 -10 ug /ml: N = 3; i (e, f) PBS og MFGE8: N = 5; i (f) MFGE8 + 311A7: N = 3). *** = P 0,001; ** = P 0,01; * = P. 0,05, sammenlignet med Ctrl = MFGE8

MFGE8 overekspression i triple negativ brystkræft

Endelig, for at afgøre, om nye MFGE8-blokerende midler, såsom antistofferne identificeret ovenfor, kan anvendes til behandling af andre tumorer, analyserede vi MFGE8 ekspression ved immunhistokemi i vores samling af brysttumor biopsier genereret fra patienter behandlet på Institut Curie (tabel S2). MFGE8 blev stærkere udtrykt i patienter med fremskredne kvaliteter af brystkræft (figur 6a), og mere specifikt i triple-negative HR- /HER2- undertype af disse kræftformer (som i størstedelen af ​​grad 3): 13/20 = 65 % af triple-negative biopsier viste MFGE8 niveauer rangeret som 2 eller 3, hvorimod kun 5/36 = 13,8% af hormonet receptor (HR) og /eller HER2-positive tumorer viste niveauer 2 eller 3 i MFGE8 ekspression (figur 6b). Disse observationer bekræfter således resultaterne for nylig offentliggjort af Yang og kolleger [13].

(a-b) Scoring af MFGE8 udtryk analyseret ved immunhistokemi som i figur 1, i 59 bryst tumor biopsier fra Institut Curie patienter, som en funktion af tumor bedømmelse (a) eller fænotype med hensyn til Hormon Receptor (HR) eller HER2-ekspression (b). ***: P = 0,0001 for distribution af tumorer overekspression (score 2-3) eller ej (score 0-1) MFGE8 mellem grad 2 versus klasse 3 tumorer (a), eller mellem HR + /HER2- versus triple-negative tumorer ( b). (C) Analyse af mRNA-ekspressionsniveauer (Log

2 (Affymetrix U133plus2.0 signal)) af

MFGE8

i offentlige resultater af Affymetrix microarray data i de overordnede-Novartis Cancer cellelinje Encyclopedia som i figur 2 . Sort pil angiver MDA-MB-231-cellelinie (HR- /HER2- triple negativ fænotype) valgt til efterfølgende eksperimenter. (D) Kvantificering af MFGE8 ved ELISA i MDA-MB-231-konditioneret medium (24 h). Secerneret MFGE8 udtrykkes i ng /ml per 10

6 dyrkede celler. Gennemsnit af to eksperimenter + SD. (E) FACS-analyse af avp3 (venstre panel) og αvβ5 (højre panel) integrin ekspression ved overfladen af ​​MDA-MB-231-celler. Specifikt antistof (blå linie). Isotypekontrol (rød linje). (F) MDA-MB-231 adhæsion assay på 5 ug /ml MFGE8, som i Figur 3-5, og inhibering ved 10 pg /mL hMC3, repræsenteret hældning værdier mellem 0 og 1 time. (G) MDA-MB-231 migration assay til 5 ug /ml MFGE8 som i figur 3-5, og inhibering ved 10 pg /mL 215A9 antistof. Data, repræsenteret som hældning værdi opgjort mellem 0 og 18 timer. (H) MDA-MB-231 overlevelse assay i nærvær af 10 pg /mL MFGE8, som i Figur 3-5, og inhibering med 10 ug /ml 399A12. 100% overlevelse svarer til 5 ug /ml MFGE8 uden antistoffer. Box-og-whiskers grafer som i figur 3. N = 4 (undtagen i (g): PBS N = 6, MFGE8 + 215A9 N = 5, og i (h): ctrl N = 6, MFGE8: N = 5) . ***: P 0,001, **:. P 0,01, sammenlignet med Ctrl = MFGE8

Konsekvent viste analyse af de overordnede-Novartis Cancer cellelinje Encyclopedia udtryk data for brystkræft cellelinier udtryk for

MFGE8

over den tillid niveau (Log

2 Affymetrix U133plus2.0 signal om MAS5 “fravær” flag = 6,1 for

MFGE8

) i størstedelen af ​​triple-negative bryst celler (24/29 = 82%), mens kun 2/23 = 9% af HR og /eller HER2 + celler udtrykte genet (figur 6c). Endelig testede vi virkningerne af MFGE8 og de blokerende antistoffer på adhæsion, migrering og overlevelse af den triple-negative MDA-MB-231-cellelinie, som udskiller MFGE8 og udtrykker avp3 og αvβ5 integriner som SKOV-3 og IGROV-1 (figur 6d, e). Som vist i figur 6f-h, MDA-MB-231 vises MFGE8-induceret adhæsion (figur 6f), migration (figur 6 g), og overlevelse (figur 6H). Desuden anti-MFGE8 antistoffer viste lignende virkninger på MDA-MB-231, som de gjorde på SKOV-3 celler.

Vores resultater bekræfter således MFGE8 som et lovende mål for et antistof-baseret strategi sigter mod at blokere tumor vækst af triple-negative brystkræft

diskussion

resultaterne præsenteres her fremhæve en ny form for kræft som et potentielt mål for MFGE8-blokerende behandlinger:. ovariecancer. Desuden beskriver vi nye analyser tilpasses til storstilet screening, og til kræft cellelinjer af forskellige væv oprindelse, som vil give identificere de mest nyttige MFGE8-blokerende midler skal næste bruges i præklinisk

in vivo

tumor vækst assays.

den kombinerede analyse af 3 fysiologiske virkninger af MFGE8 /lactadherin på tumorceller, dvs. adhæsion, migration og overlevelse, tilladt os at rangere 5 forskellige MFGE8-specifikke antistoffer, og at sammenligne dem med referencen antistof hMc3. MC3 blev beskrevet for 30 år siden for sin evne til at binde til cirkulerende brystepitelceller-antigener hos cancerpatienter [18]. Det blev snart efter vist at inhibere væksten af ​​humane brysttumorer i nøgne mus enten alene [15], eller mere effektivt, som et konjugat med

131I [19]. Den antigen genkendes af MC3 blev klonet som MFGE8 (dengang kaldet BA46) et par år senere [3], og epitop kortlægning identificeret RGD-holdige domæne EGF som mål for MC3, mens et andet antistof, MC8, erkendte en epitop i C2 domænet og ikke vise antitumoraktivitet

in vivo

[20]. I vores tre assays, MC3 effektivt inhiberede virkningerne af rekombinant MFGE8, hvilket antyder, at RGD domænet og dets samspil med avp3 /5 integriner er nødvendige for adhæsion, migrering gennem transwell, og celleoverlevelse. Da vi observerede, at blandt vores to anti-MFGE8 kaninantisera, kun den ene anerkender RGD domæneblokkene adhæsion, kan vi udelukke en rolle, andre domæner af MFGE8 i denne type funktion. Men vi kan ikke udelukke, at migration og overlevelse også kunne være medieret af andre typer af interaktioner af MFGE8 med målcellen, eventuelt via en anden receptor, som foreslået for sædcellerne binding til æg medieret af SED1 (et andet navn MFGE8) [21].