PLoS ONE: Parasporin-2 fra en ny Bacillus thuringiensis 4R2 Strain inducerer Caspaser Aktivering og apoptose i humane cancerceller

Abstrakt

I tidligere undersøgelser, parasporin-2Aa1, oprindeligt isoleret fra

Bacillus thuringiensis

stamme A1547, viste sig at være cytotoksisk mod specifikke humane cancerceller, men de virkningsmekanismer blev ikke undersøgt . I nærværende undersøgelse fandt vi, at proteinase K aktiveret parasporin-2Aa1 protein isoleret fra en roman

B

.

thuringiensis

stamme, 4R2, var specifikt cytotoksisk over for endometrisk, colon, lever, cervix, bryst- og prostatakræft. Den viste ingen toksicitet mod normale celler. Ved behandling med proteinase K-aktiveret parasporin-2Aa1 blev morfologiske ændringer observeret og western blot-analyse afslørede spaltningen af ​​poly (ADP-ribose) polymerase, caspase-3 og caspase-9 i cancercellelinier udelukkende, indikerer programmeret celledød, apoptose. Flowcytometri analyser, under anvendelse af propidiumiodid og annexin V, samt en caspase 3/7 assay bekræftede apoptose induktion. Yderligere analyser blev udført for at studere overlevelse veje, herunder AKT, XIAP, ERK1 /2 og PAR-4, en kendt inducer af apoptose. Disse resultater indikerer, at parasporin-2Aa1 er en selektiv cytotoksisk protein, som inducerer apoptose i forskellige humane cancercellelinier fra forskellige væv

Henvisning:. Brasseur K, Auger P, Asselin E, Parent S, Côté JC, Sirois M (2015) Parasporin-2 fra en ny

Bacillus thuringiensis

4R2 Strain inducerer Caspaser Aktivering og apoptose i humane cancerceller. PLoS ONE 10 (8): e0135106. doi: 10,1371 /journal.pone.0135106

Redaktør: Ferenc Gallyas, Jr., University of Pecs Medical School, UNGARN

Modtaget: April 9, 2015; Accepteret: 16. juli 2015; Udgivet: 11 August, 2015

Copyright: © 2015 Brasseur et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Denne undersøgelse blev finansieret af den interne UQTR forskergruppen. Kevin Brasseur var indehaver af en ph.d.-stipendium fra den canadiske Institutes of Health Research (CIHR). Eric Asselin er indehaver af Canadas forskning stol i molekylær gyneco-onkologi. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Bacillus thuringiensis

er en Gram-positive bakterie, der producerer krystallinske parasporale inklusioner under sporedannelse. Disse inklusioner er lavet af proteiner, de A-endotoksiner. De er klassificeret i to familier, krystal (Cry) og cytolytiske (CYT) proteiner kodet af

cry

sidde

gener henholdsvis [1,2]. Råbet proteiner er blevet grundigt undersøgt siden 1970 på grund af deres specifikke insekticide aktiviteter mod lepidoptera, dipteran og Coleoptera [3]. Ved indtagelse af en modtagelig insekt er de parasporale inklusioner solubiliseres i det alkaliske insekt midttarm, de Cry protoxiner frigives og behandles derefter af midttarmen proteaser til opnåelse aktiverede toksinproteiner. Disse binder til specifikke receptorer placeret på membranen af ​​epiteliale tarmceller, hvilket fører til poredannelse og i sidste ende til insekt død [1,4].

Den vellykkede udvikling og anvendelse af

B

.

thuringiensis

-baserede formuleringer til bekæmpelse af skadelige insekter har ført til isoleringen af ​​tusindvis af nye stammer og hundredvis af Cry-proteiner er nu blevet karakteriseret i forskellig udstrækning [5]. Flere undersøgelser har vist, at ikke insekticide Cry-proteiner er mere udbredt end de insekticide Cry-proteiner [6]. Dette førte til forskning af potentielt nye biologiske aktiviteter fra ikke-insekticide Cry-proteiner. Efter en stor screening viste nogle ikke-insekticide og ikke-hæmolytiske Cry-proteiner cytotoksisk aktivitet mod humane cancerceller, og disse nye

B

.

thuringiensis

toksiner blev kaldt parasporins [7,8]. Hidtil seks familier af parasporins, PS1 -PS6, er blevet identificeret [9]. Hver parasporin familie udviser specifik spektrum og virkningsmekanisme mod humane cancerceller.

Parasporin-2Aa1 (PS2Aa1, også klassificeret Cry46Aa1) produceret af

B

.

thuringiensis

serovar

dakota

stamme A1547 er blevet intensivt undersøgt for sin toksiske virkning i kræftceller [9-11]. Når det aktiveres af proteinase K, PS2Aa1 er mindst 400- fold mere toksisk for den humane cancercellelinie HepG2 (human hepatocyt cancer) end for det normale humane cellelinie HC (humant normalt hepatocyt) og human cancercellelinie HeLa (human uterus cervix kræft) [12]. I HepG2-celler, vises den monomere toksin til at binde til et ukendt receptorprotein placeret i lipidklump [13]. Når bundet til receptoren, PS2Aa1 oligomeriserer at permeabilisere membranen fører til poredannelse [11,12]. A glycosylphosphatidylinositol (GPI) -forankret protein synes at være involveret til effektiv cytocidale virkning af PS2Aa1 [13]. Poredannelse resulterer i ændringer af de cytoskeletale strukturer, fragmentering af organeller, ændringer af cellemorfologi, såsom celle hævelse og endelig cellelyse [11]. Måden til celledød forekommer at være ikke-apoptotiske men denne hypotese blev ikke bekræftet [11-13]. Således yderligere karakterisering af de intracellulære begivenheder involveret i induceret- PS2Aa1 celledød var obligatorisk at bekræfte, om eller ikke apoptose var involveret.

I nærværende undersøgelse, en ekstra

B

.

thuringiensis

stammen kaldes

Bt

4R2 som indeholder det gen, der koder for Cry46Aa1 protein (PS2Aa1) er blevet undersøgt for at identificere de mekanismer, der er involveret i celledræbende-afhængig celledød induktion. Vi fandt, at PS2Aa1 var meget cytotoksisk for mange kræftceller

in vitro

. For yderligere at undersøge mekanismen ved brug af udvalgte cancerceller fra forskellige væv (HepG2-hepatocyt cancer, PC-3-prostatacancer og MCF-7-brystcancer) vi fandt, at apoptose celledød forekom via caspaser og poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) spaltning. Vi fandt også, at PS2Aa1 viser meget lav toksicitet over for normale cellelinier (IOSE-144, HIESC, HIEEC og MCF-10A).

Vi støtter yderligere hypotesen om apoptose induktion med identifikation af forskellige overlevelse pathway hæmning herunder AKT , XIAP, ERK1 /2 og induktion af tumor suppressor PAR-4 efter behandling med PS2Aa1. Vi fandt også, at inhibering af PI3K /AKT pathway i kombination med toksin forøges, i en synergistisk måde, effektiviteten af ​​PS2Aa1 at inducere apoptose i cancerceller. Synes således PS2Aa1 at være en celledræbende diskriminerer toksin regulerer apoptose i forskellige humane kræftceller.

Materialer og metoder

Bakteriel stamme og dyrkningsmedier

B

.

thuringiensis

serovar

dakota

stamme 4R2 blev anvendt i denne undersøgelse. Den blev opnået fra

Bacillus

Genetic Stock Center (Ohio State University, Columbus, OH, USA). Bakterieceller blev dyrket ved 30 ° C på næringsagar fra Sigma-Aldrich (St.-Louis, MO, USA) ved pH 7,1.

Celler og dyrkningsbetingelser Salg

Menneskelig hepatocyt cancer HepG2 (HB-8065), human prostatacancer-cellelinie PC-3 (CRL-1435), human epithelial colorektal adenocarcinom-cellelinie Caco-2 (HTB-37), human epithelial cervix adenocarcinom cellelinie HeLa (CCL-2), human uterus endometrium adenocarcinomacellelinie Hec-1A (HTB-112), human uterus endometrium adenocarcinomacellelinie KLE (CRL-1622), human adenocarcinom-cellelinie bryst MDA-MB231 (HTB-26), human brystcancer-cellelinie MCF-7 (HTB -22), humane ikke-tumorigene epitelceller MCF-10A (CRL-10317), human epithelial ovarie adenocarcinom cellelinie OVCAR-3 (HTB-161) og humant epitel ovarie adenocarcinom cellelinie SKOV-3 (HTB-77) blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC). Human udødelige nontumorigene ovarie overflade epitelcellelinie IOSE-144 blev venligst leveret af Dr. David Hunstman (British Columbia Cancer Research Center, Vancouver, BC, Canada). Humane udødelige endometrie stromaceller HIESC og Human udødelige endometrie epitelceller HIEEC var en slags gave og produceret af Dr. Michel Fortier (Centre Hospitalier de l’Université Laval, Quebec City, QC, Canada) [14]. Humane ovariekarcinom celler A2780 blev venligst stillet til rådighed af Dr. G. Peter Raaphorst (Ottawa Regional Cancer Center, Ottawa, ON, Canada). Menneskelig endometrial adenocarcinom cellelinje Ishikawa blev venligst stillet til rådighed af Dr. Samuel Chogran (Université de Montréal, Montreal, QC, Canada). HepG2, PC-3, blev HIEEC og HIESC cellelinier opretholdt i RPMI 1640 medium indeholdende 10% føtalt bovint serum og 50 pg /ml gentamycin. MCF-7 og OVCAR-3 cellelinier blev opretholdt i RPMI 1640 medium indeholdende 10% bovint vækst serum og 50 pg /ml gentamycin. MDA-MB-231-cellelinien blev opretholdt i RPMI 1640 medium indeholdende 5% bovint vækst serum og 50 pg /ml gentamycin. HEC-1A-cellelinien blev opretholdt i McCoys medium indeholdende 5% bovint vækst serum og 50 pg /ml gentamycin. SKOV-3 cellelinien blev opretholdt i McCoys medium indeholdende 10% bovint vækst serum og 50 pg /ml gentamycin. HeLa, Ishikawa og A2780 cellelinjer blev opretholdt i DMEM-F12-medium indeholdende 2% bovint vækst serum og 50 pg /ml gentamycin. MCF-10A-cellelinien blev opretholdt i DMEM-F12-medium indeholdende 5% føtalt vækst serum, 20 ng /ml EGF, 0,5 mg /ml hydrocortison, 100 ng /ml koleratoksin, 10 ug /ml insulin og 1X penicillin-streptomycin. KLE cellelinien blev opretholdt i DMEM-F12-medium uden HEPES indeholdende 10% bovint vækst serum og 50 pg /ml gentamycin. Caco-2-cellelinien blev opretholdt i DMEM-F12-medium indeholdende 10% føtalt bovint serum og 50 pg /ml gentamycin. IOSE-144-cellelinien blev opretholdt i MCDB105-medium indeholdende 10% føtalt bovint serum og 50 pg /ml gentamycin. Alle celler blev holdt ved 37 ° C med 5% CO

2.

Total DNA isolation

Samlet DNA fra

B

.

thuringiensis

4R2 blev isoleret fra en 5 ml overnatskultur hjælp Qiamp DNA blod mini (Qiagen, Toronto, ON, Canada), i henhold til producentens anvisninger for bakteriel DNA-ekstraktion.

PCR-amplifikation

de anvendte primere i denne undersøgelse blev designet i vores laboratorium fra

græde

46Aa1 gen nukleotidsekvens. Primere til PCR-amplifikation var som følger:

Bt

4R2-2F: 5’TAACCGGAGGGCTTCAAG -3 ‘(sense) og

Bt

4R2-1R: 5’TAATTCCCCCATTTTGGG -3′ (antisense ). PCR blev udført i en Applied Biosystems 2720 termisk cycler (Life Technologies, Ottawa, ON, Canada). PCR reaktioner blev udført i et 50 pi volumen indeholdende 200 uM hver af deoxynucleosidtriphosphater (dNTP’er), 1x PCR buffer, 0,5μM af hver primer, 100 ng DNA og 1,25 enheder Taq-DNA-polymerase. Alle PCR-reagenser var fra New England Biolabs (Ottawa, ON, Canada). PCR blev udført ved en initial denatureringstrin ved 94 ° C i 5 minutter, efterfulgt af 30 cykler ved 94 ° C i 45 s, 50 ° C i 30 s, 72 ° C i 2 minutter og en endelig forlængelse ved 72 ° C i 7 min. PCR-produkter blev størrelsesfraktioneret separeret på en 1% agarosegel og visualiseret ved hjælp af SYBR-Safe (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) farvning ved UV-gennemlysning. Salg

DNA sekventering

Amplikoner blev oprenset ved anvendelse af Mini Elute PCR Purification Kit fra Qiagen. De rensede PCR reaktioner blev løst på en 3130XL Genetics Analyser (Applied Biosystems) på IBIS Plate-forme d’Analyser Génomiques (PAG) de l’Université Laval (Quebec City, QC, Canada). Begge strenge af DNA-sekvensen blev sekventeret: Den 940pb sekvens blev sammenlignet ved anvendelse af Blast-N værktøj (National Center for Biotechnology Information, www.ncbi.nim.nih.gov)

Fremstilling af aktiverede parasporale proteiner

Bacillus thuringiensis

stamme 4R2 blev dyrket på næringsagarplader, inkuberet i 4 dage ved 30 ° C indtil cellelyse. Cellerne blev høstet fra pladerne og vasket to gange med sterilt destilleret vand. Pelleten indeholdende sporer-krystal proteins- blev solubiliseret i 500 pi af solubilisering buffer indeholdende 56 mM Na

2 CO

3 (pH: 11,4) og 11 mm dithiothreitol (DTT) i 1 time ved 37 ° C. Uopløseligt materiale blev pelleteret ved centrifugering ved 13 200 rpm i 2 minutter, og supernatanten blev passeret gennem en 0, 22μm membranfilter. 250 pi af filtratet blev overført til et sterilt 1,5mL centrifugerør, og pH justeret til 8 med 1 M Tris-HCI (pH 4,98).

solubiliserede proteiner blev fordøjet med enten proteinase K (slutkoncentration ved 185μg /ml) eller trypsin (slutkoncentration på 300 ug /ml) i 1 time ved 37 ° C. Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) blev tilsat (slutkoncentration 1 mM) for at stoppe proteolytisk forarbejdning. For at bekræfte tilstedeværelsen af ​​de parasporale proteiner, blev udført SDS-PAGE-analyse som beskrevet andetsteds [15] under anvendelse af 4% stacking gel og 12% separationsgel. Efter elektroforese blev gelen farvet med 0, 1% Coomassie blue R-250 (Sigma-Aldrich). Proteinkoncentrationen blev bestemt med Bio-Rad DC Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, Mississauga, ON, Canada).

Analyse af cytotoksicitet

antiproliferative aktivitet af

B

.

thuringiensis

4R2 toksin proteiner blev vurderet ved hjælp af MTT-analysen [16,17]. Kort fortalt blev plader podes med 180μL af normale og kræftceller i suspension (for HIESC, 14 000; IOSE-144, 12 000, HIEEC, 15 000, Ishikawa, 16 000, HeLa, 16 000 KLE, 14 000; ny fabrik 1A, 12 000, Caco-2, 20 000, PC-3, 16 000, HepG2, 20 000, A2780, 16 000; OVCAR-3, 20 000, SKOV-3, 14 000; MCF-7, 16 000; MDA-MB231, 12 000 og MCF-10A, 8000) i mediet ved anvendelse af plader med 96 brønde. Plader blev inkuberet ved 37 ° C, 5% CO

2 i 24 timer. Frisk opløst og aktiverede

B

.

thuringiensis

4R2 toksinproteiner (med proteinase K eller trypsin) i solubilisering puffer blev fortyndet i frisk medium, og 100 pi alikvoter indeholdende stigende koncentrationer af toksinet proteiner (0μg /ml til 20 ug /ml) blev tilsat, og pladerne blev inkuberet i andre 24 h. Den endelige koncentration af solubilisering buffer (56 mM Na2CO3, 11mm DTT, 100 ug /ml proteinase K (eller 30 mg /ml trypsin) og 1 mM PMSF) i dyrkningsmedierne var 8% og blev holdt konstant i alle forsøg. Efter 24, 10 pi 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) (5 mg /ml i PBS) blev tilsat til brøndene. Fire timer senere 100 pi af solubilisering opløsning (10% natriumdodecylsulfat (SDS) i 0,01 M HCI) blev tilsat og pladerne blev inkuberet natten over (37 ° C, 5% CO

2). Den optiske densitet blev læst ved anvendelse af en Fluostar optima BMG (BMG Labtech Inc., Durham, NC, USA) ved 565 nm. Aflæsninger hidrørende fra behandlede celler blev sammenlignet med målinger fra kontrol celleplader fast på behandlingen dage; og procentdelen af ​​cellevækstinhibering blev beregnet for hver toksinprotein (proteinase K aktiveret eller trypsin aktiveret). Forsøgene blev udført in triplo. Analyserne blev anset gyldigt, når variationskoefficienten for et givet sæt betingelser og inden for samme eksperiment var 10%.

Light mikroskopi observation

For observation af morfologiske ændringer, normal (HIESC) og kræftceller (PC-3, MCF-7 og HepG2) blev observeret efter 24 behandling med proteinase K aktiveret toksinproteiner på 1 pg /ml (MCF-7) eller 2 ug /ml (HIESC, PC-3 og HepG2). 10X og 20X forstørrelser blev anvendt med et Olympus (model BX60) lysmikroskop (Carsen Group, Markham, ON, Canada).

Antistoffer og reagenser

Na

2CO

3, DTT, 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl- tetrazoliumbromid, HCI, SDS, PMSF, Tris-HCI og proteinase K blev alle opnået fra Sigma-Aldrich. Alle primære antistoffer blev opnået fra Cell Signaling Technology (Bervely, MA, USA) med undtagelse af β-actin (Sigma-Aldrich). Sekundært antistof, HRP-konjugeret gede-anti-kanin var køb fra Bio-Rad Laboratories. Annexin V /PI apoptose kit blev indkøbt fra Invitrogen. MEK ½ inhibitor, U0126, blev opnået fra Cell Signaling Technology og PI3K-inhibitor, Wortmannin, blev opnået fra Sigma-Aldrich.

Western blot-

PS2Aa1 behandlede celler blev vasket med PBS og underkastes lysis i kolde RIPA-buffer indeholdende proteaseinhibitorer (Complete fra Roche Applied Science, Laval, QC, Canada) og phosphatase inhibitor (PhosSTOP fra Roche Applied Science), efterfulgt af tre fryse-tø cykler. Lige mængder cellelysater, bestemt under anvendelse af Bio-Rad DC-protein assay blev separeret på polyacrylamidgeler (10-14%) og overført på nitrocellulosemembraner (Bio-Rad). Membraner blev blokeret i 5% mælk, PBS 1X, 0,06% Tween 20 i 1 time ved stuetemperatur, probet med primært antistof, vasket i PBS 1X, 0,06% Tween 20 og inkuberet med peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof (Bio-Rad ). Detektion blev udført ved hjælp SuperSignal West Femto substrat (Thermo Fisher Scientific, Nepean, ON, Canada), som beskrevet af producenten hjælp UVP Bioimaging systemer.

Måling af Annexin V /PI celler

FITC annexin V /Dead Cell Apoptose Kit (Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon, USA) blev anvendt ifølge producentens anvisninger. Kort fortalt blev de behandlede celler opsamlet, vasket med PBS og fortyndet i 1X annexinbinding buffer (100 pi). For hver prøve blev der udtaget 5 pi Annexin V og 2 pi propidiumiodid (PI) tilsat til cellesuspensionen og inkuberet i 15 min ved stuetemperatur. Yderligere 100 pi volumen af ​​Annexin bindingsbuffer blev tilsat til hver prøve for i alt 200 ul. Prøverne blev analyseret (10 000 hændelser) ved hjælp af en Beckman Coulter flowcytometer Cytomics FC500. Analyser blev udført ved hjælp af CXP Analysis software (Beckman Coulter, Mississauga, ON, Canada).

Caspase 3-7 assay

For at måle den specifikke aktivitet af caspase 3 og 7, en selvlysende assay kit opkaldt Caspase-Glo 3/7 assay (Promega, Madison, WI, USA)) blev anvendt. Dette assay tilvejebringer en proluminescent caspase-3/7 substrat indeholdende en sekvens (DEVD) specifikke for caspase 3 og 7. Hvis caspaser 3 og /eller 7 er aktive, er substratet spaltes og aminoluciferin vil blive udsendt. Kort fortalt blev plader podes med 180μL af normale og kræftceller i suspension (for HIESC, 14 000, PC-3, 16 000, HepG2, 20 000 og MCF-7, 16 000) i medium. Plader blev inkuberet ved 37 ° C, 5% CO

2 i 24 timer. Frisk opløst og aktiverede

B

.

thuringiensis

4R2 toksin proteiner (med proteinase K) i opløselighed buffer blev fortyndet i frisk medium. Derefter, 100 pi alikvoter indeholdende toksinet, med eller uden inhibitorer, blev tilsat, og pladerne blev inkuberet i yderligere 24 timer. Den endelige koncentration af solubilisering buffer (56 mM Na2CO3, 11mm DTT, 100 ug /ml proteinase K og 1 mM PMSF) i dyrkningsmedierne var 8% og blev holdt konstant i alle forsøg. Efter 24, blev 100 pi af caspase-Glo 3/7 reagens tilsat til brøndene. En time senere blev den optiske densitet læses ved anvendelse af et Fluostar optima BMG (BMG Labtech Inc., Durham, NC, USA). Aflæsninger hidrørende fra behandlede celler blev sammenlignet med målinger fra kontrol celler under anvendelse gange stigninger. . Hver forsøg blev udført dobbelt

Statistiske analyser

Dataene blev underkastet enten envejs variansanalyse eller t-test (PRISM softwareversion 5.00, GraphPad, San Diego, CA ). Forskelle mellem forsøgsgrupper, ved brug envejs variansanalyse, blev bestemt ved Tukey test. Statistisk signifikans blev accepteret når p 0,05.

Resultater Salg

Karakterisering af B. thuringiensis 4R2 cytotoksisk krystal protein

SDS-PAGE-analyse af de solubiliserede krystalproteiner afslørede et hovedbånd anslået til 37 kDa, svarende til den native form af Cry46Aa1 protein (figur 1). I PCR-forsøg med Cry46Aa1 specifikke primere blev et 940bp amplifikationsprodukt opnået. Analyser af nukleotidsekvensen under anvendelse af BLAST værktøjer afslørede, at nucleotidsekvensen var 100% homologe med proteinase K aktiverede Cry46Aa1 nukleotidsekvens (NCBI accession nummer AB099515.1). På grund af denne nukleotidsekvens identitet, de 37 kDa krystal proteiner fra

B

.

thuringiensis

4R2 blev opkaldt PS2Aa1

(A) Bane 1:. Molekylvægtmarkør; bane 2: solubiliseret pro-PS2Aa1. (B) Nukleotider sekvens af

græde

46Aa1 gen fragment opnået efter forstærkning med Bt4R2-2F og Bt4R2-1R primerparret.

cytotoksicitet PS2Aa1 i kræft og normale celler

trypsin (anvendt som kontrol behandling) og proteinase K aktiveret krystal proteiner fra

B

.

thuringiensis

4R2 (PS2Aa1) blev undersøgt for cytotoksicitet mod normale og cancer humane celler ved anvendelse af MTT-assay for en 24 h behandling (figur 2). Ingen celledræbende aktivitet blev observeret efter trypsinbehandling af solubiliserede krystalproteiner for nogen af ​​de cellelinjer. Blandt de testede celler, proteinase K aktiveret krystal-proteiner var meget cytotoksisk til HepG2, MCF-7, KLE HEC-1A, MDA-MB231 og PC-3-celler og samtidig være moderat cytotoksisk til Caco-2-celler. Ingen signifikant cytotoksisk aktivitet blev observeret i A2780, OVCAR-3, SKOV-3 og HeLa cancercellelinjer. Ingen af ​​de normale cellelinjer (IOSE-144, HIEEC, HIESC og MCF-10A) viste cytotoksiske virkninger. Cytotoksiciteten af ​​krystal-proteinerne var dosisafhængig og blev undersøgt under anvendelse serielle proteiner fortyndinger. Baseret på deres høje følsomhed over for PS2Aa1, HepG2, blev PC-3 og MCF-7 cancercellelinier udvalgt til yderligere eksperimenter. HIESC celler blev anvendt som en normal cellelinje model for yderligere at udforske virkningerne af PS2Aa1 på ikke-cancerceller.

Normale dyrkede humane celler (A) og cancer dyrkede humane celler (B) (2 X 10

4 celler) blev præinkuberet ved 37 ° C i 20 timer; toksinet behandlet med trypsin (○) eller proteinase K (●) blev tilsat (slutkoncentrationer, 0.3μg /ml til 20 ug /ml) yderligere inkuberet i 24 timer. Celleproliferation blev analyseret ved hjælp MTT.

Morfologiske forandringer i kræftceller induceret af PS2Aa1

For yderligere at undersøge effekten af ​​PS2Aa1, koncentrationer fra 1 pg /ml til 2 ug /ml blev anvendt baseret på den foregående cellelevedygtigheden eksperiment. Efter behandling af PS2Aa1 proteinase K aktiverede proteiner i HepG2 (2 pg /ml), PC-3 (2 pg /ml) og MCF-7 (1 ug /ml) celler, morfologiske forhold på de behandlede celler blev observeret under lysmikroskopi (fig 3) . Celle krympning, karakteristisk for apoptotisk celledød [18], blev kun observeret i HepG2, MCF-7 og PC-3 cancerceller. Der blev dog ikke observeret nogen morfologiske ændringer på HIESC; bekræfter ikke-cytotoksicitet PS2Aa1 på normale celler som tidligere observeret med MTT forsøget. Ingen nekrose morfologiske ændringer som celle hævelse eller blæredannelse blev iagttaget [18].

PC-3 (A), blev MCF-7 (B), HepG2 (C) og HIESC (D) celler behandlet med 1 pg /ml eller 2 ug /ml

B

.

thuringiensis

4R2 toksin proteiner til 24 timer. Efter 24, blev cellerne observeret ved lysmikroskopi ved en forstørrelse på 10X og 20X. De viste resultater er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

PS2Aa1 inducerer celledød ved apoptotiske mekanismer

For at bekræfte vores tidligere bemærkninger om de morfologiske ændringer i forbindelse med apoptose forekommer i cancerceller, vi udførte annexin V /propidiumiodid (PI) farvning analyse på de behandlede celler. Annexin V har evnen til at farve phosphatidylserin på den ydre blad af plasmamembranen og dens tilstedeværelse på den ydre folder i stedet for den indre blad er en unik egenskab ved apoptose [19]. Resultaterne viste, at 6 timer og 24 timer efter behandling, PS2Aa1 fremkaldte høje niveau af apoptose i alle tre cancercellelinier (Fig 4A-4C) og meget lidt i den normale endometriecancer cellelinje HIESC (Fig 4D) Dette er i direkte korrelation med MTT analyseresultaterne (fig 2). Fleste cancerceller viste højt apoptose efter 6h behandling indikerer den høje effektivitet af PS2Aa1 i induktion af apoptose.

PC-3 (A), MCF-7 (B), HepG2 (C) og HIESC (D ) celler blev behandlet med

B

.

thuringiensis

4R2 toksinproteiner (1 pg /ml (B) eller 2 ug /ml (A, C, D)) i 24 timer. Annexin V og PI farvning blev detekteret ved FACS-analyse. Resultaterne er gennemsnit ± S.E.M. af tre uafhængige forsøg. * P. 0,05 sammenlignet med tilsvarende mock-behandlede celler

Fordi PS2Aa1 inducerer høj toksicitet og mange celler er PI positive først efter 24 timer, besluttede vi at udføre en caspase-3/7-assay til at kontrollere hvis PS2Aa1 specifikt aktiverer caspaser -3 og -7 at inducere apoptose (figur 5). Efter 24 timer behandling, PS2Aa1 markant øget aktivitet både caspaser -3 og -7 i PC-3 og HEPG2 kræft cellelinjer (Fig 5A og 5C). MCF-7 cancer cellelinie er caspase-3 mangelfuld og overvejer denne mangel, kan kun caspase-7 måles ved dette assay i denne cellelinie [20]. En betydelig stigning i caspaseaktivitet kan observeres i MCF-7 cancer cellelinie, som angiver, at apoptose induceret kompenseres ved caspase-7, impliceret i virkningsmekanismen for PS2Aa1 (Fig 5B). Lavt niveau af celledød er tidligere observeret ved normal cellelinje HIESC ved Annexin V /PI flowcytometri og følgelig ingen signifikant stigning af caspase-3/7-aktivitet kunne måles af caspase-assayet i HIESC (Fig 5D).

PC-3 (A), MCF-7 (B), HepG2 (C) og HIESC (D) celler blev behandlet med

B

.

thuringiensis

4R2 toksin proteiner (2 pg /ml) i 24 timer. Niveauet af caspase-3/7 blev målt ved anvendelse af Caspase-Glo 3/7 assay. MCF-7 (B) celler er Caspase-3 mangelfulde og kun Caspase-7 kan måles. * P 0,05 og ** P. 0,01 sammenlignet med tilsvarende mock-behandlede celler

For yderligere at undersøge apoptose induktion, vi også målt forskellige apoptose markører ved Western blot analyse såsom kløvet caspase-3, 8, -9 og spaltes PARP. Vores resultater viste, at så tidligt som 6 timer af behandlingen med PS2Aa1 blev caspase-3-spaltning /aktivering observeret i både PC-3 og HepG2 cancerceller (fig 6A og 6C, MCF-7 er caspase-3 negativ). Når den er aktiveret, caspase-3 er et effektor caspase og kan gøre proteolytisk spaltning af forskellige proteiner, såsom reparation protein PARP, derefter fører til apoptotisk celledød. Men caspase-3 kræver, initiator-caspaser fra enten den indre eller ydre vej, der skal spaltes /aktiveres [21,22]. Ved western blot-analyse, målt vi spaltet caspase-8 (ydre vej) og spaltes caspase-9 (indre vej) og fundet ud af, at kun caspase-9-spaltning /aktivering var til stede i alle tre cancercellelinier (Fig 6A-6C), mens caspase-8 spaltning /aktivering blev der ikke observeret (data ikke vist). I sammenhæng med caspaser kavalergang, PS2Aa1 også inducerede PARP spaltning /nedbrydning i alle tre cancer cellelinjer (Fig 6A-6C). Spaltede PARP og spaltede caspase-3-protein er lavt efter 24 h behandling af toksinet i HepG2 cancer cellelinje (figur 6C). Dette er sandsynligvis fordi de fleste af cellerne var døde efter 6h ( 75%). Efter 24 timers behandling, næsten alle HepG2-celler var flydende og døde ( 92%). Proteiner blev sandsynligvis alle nedbrudt på grund af proteaser indsats sent apoptose fører til massive protein og cellulær destruktion [23]. Dette understøttes yderligere ved MTT data (Fig 2B) og Annexin V /PI flowcytometri (fig 4C og 4H) som viser, at næsten 100% af cellerne er døde ved denne koncentration efter 24 timers behandling forklare situationen observeret. Det er også bemærkelsesværdigt, at ingen af ​​disse markører for apoptose blev observeret i den normale cellelinie HIESC (Fig 6D), som indikerer, at der ikke apoptose forekom med maksimum dosis PS2Aa1 (2 ug /ml), som tidligere anvendt på cancercellelinjer. Western blot bands synlige i den normale cellelinie HIESC er det basale niveau af de forskellige markører, observerbare først efter høj redegørelse for at afsløre de passende proteinbånd (Fig 6D). Dette er i overensstemmelse med de i fravær af apoptose og caspase-3/7-aktivitet observeret i tidligere forsøg med normale cellelinie HIESC (fig 4 og 5).

PC-3 (A), MCF-7 ( B), blev HepG2 (C) og HIESC (D) celler behandlet med

B

.

thuringiensis

4R2 toksinproteiner (1-2μg /ml) i 6 h og 24 h. Niveauerne af apoptose-specifikke spaltede proteiner caspase-3, caspase-9 og PARP blev bestemt i behandlede celler under anvendelse western blot analyse. MCF-7 (B) celler er Caspase-3 mangelfuld. p-actin blev anvendt som en loading kontrol. De viste resultater er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

Regulering af forskellige overlevelse og død veje som reaktion på PS2Aa1

Alle de tidligere eksperimenter viser, at PS2Aa1 toksin kan inducere celledød i kræftceller gennem apoptose induktion. For at undersøge den mulige inddragelse af andre overlevelse /død veje, vi udførte yderligere eksperimenter på PC3 prostatacancerceller hjælp western blot analyse. Vi først undersøgt AKT overlevelse vej kendt for at være en vigtig overlevelse mekanisme til kræftceller. Proteiner fra AKT pathway ofte ændres i cancer og høj overlevelsesprocent signal fra disse mutationer er ofte ansvarlige for resistensen af ​​cancerceller til Therapeutics behandlinger og umuligheden for at inducere apoptose [24-28]. Vores resultater viste en høj reduktion af phosphoryleret (den aktive form) AKT i serin 473. Total AKT niveau blev også faldet tyder på, at det også er delvis ansvarlig for nedgangen af ​​p-AKT niveau. XIAP, en inhibitor af caspase og et ubiquitin ligase for PTEN (en negativ regulator af AKT-phosphorylering) blev også reduceret (Fig 7A) [29]. ERK1 /2, proteiner af MAPK-vejen, kræver aktivering /phosphorylering at inducere apoptose i cancerceller efter behandling med cisplatin eller andre apoptose stimuli [30-32]. Som observeret i cisplatin behandlinger, PS2Aa1 inducerede en stigning på ERK1 /2 fosforylering på 24 efter behandling, mens total ERK niveau boede stabilt (figur 7B). Dette antyder, at ERK-aktivering er påkrævet for induktionen af ​​apoptose. Endelig har vi for nylig opdaget en ny mekanisme relateret til tumor-suppressor PAR-4, som spaltes af caspase-3 ved apoptose stimuli og er i stand til at inducere apoptose, når spaltet [33,34]. På grund af PS2Aa1 kapacitet til at aktivere apoptose mekanismer, vi spørgsmålstegn ved, om PAR-4 spaltning kan inddrages i apoptose induktion ved behandling med toksin. Interessant, et spaltet fragment på ca. 25 kDa syntes så snart 6h efter behandling med PS2Aa1 i fuld korrelation med vores hypotese (Fig 7C). Tilstedeværelsen af ​​det spaltede PAR-4-fragment, der normalt kun til stede i kræftceller undergår apoptose, styrker den idé, at PS2Aa1 er en inducer af apoptose i kræftceller.

PC-3 cancerceller blev behandlet med Bt 4R2 toksin proteiner (2 pg /ml) i 6 timer og 24 timer. (A) PI3K /AKT pathway proteiner (B) ERK og (C) PAR-4 proteinniveauer blev bestemt i behandlede celler under anvendelse western blot analyse. β-actin blev anvendt som en loading kontrol. β-actin blev anvendt som en loading kontrol. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet.