PLoS ONE: SOX2 Expression reguleres af BRAF og bidrager til dårlig Patient Prognose i kolorektal Cancer

Abstrakt

Sporadisk kolorektal cancer (CRC) er en fælles malignitet og også en af ​​de vigtigste årsager til kræftdødsfald i hele verden. Afvigende ekspression af transskription faktor SOX2 er for nylig blevet observeret i flere kræfttyper, men dens rolle i CRC er ikke fuldt belyst. Her studerede vi udtryk for SOX2 i 441 CRC patienter ved immunhistokemi og relateret udtrykket til klinisk-patologiske og molekylære variable og patient prognose. SOX2 blev udtrykt i 11% af tumorerne og var signifikant associeret til

BRAF

V600E

mutation, men ikke til

KRAS

mutationer (codon 12 og 13). SOX2 positivitet var korreleret til dårlig patient overlevelse, især i

BRAF

V600E

muterede sager.

In vitro

undersøgelser viste, at celler, der udtrykker den konstitutivt aktive

BRAF

V600E

var steget SOX2 udtryk, en konstatering ikke fundet i celler, der udtrykker

KRAS

G12V

. Endvidere blokering nedstrøms BRAF signalering under anvendelse af en MEK-inhibitor resulterede i en reduceret ekspression af SOX2. Da SOX2 overekspression er blevet korreleret til øget migration og invasion, undersøgte vi den SOX2 ekspression i human CRC levermetastaser og fandt, at en SOX2 positiv primær CRC havde også SOX2 ekspression i tilsvarende levermetastaser. Endelig fandt vi, at celler, der overudtrykker SOX2

in vitro

viste forøget udtryk for FGFR1, som er blevet rapporteret at korrelere med levermetastaser i CRC. Vores nye fund tyder på, at SOX2 udtryk dels reguleres af BRAF signalering, og en øget SOX2 udtryk kan fremme CRC metastaser og mægle en dårlig patient prognose

Henvisning:. Lundberg IV, Löfgren Burström A, Edin S, Eklöf V , Oberg Å, Stenling R, et al. (2014) SOX2 Expression reguleres af BRAF og bidrager til dårlig Patient Prognose i kolorektal cancer. PLoS ONE 9 (7): e101957. doi: 10,1371 /journal.pone.0101957

Redaktør: Andreas-Claudius Hoffmann, vesttyske Cancer Center, Tyskland

Modtaget: 31 Jan 2014; Accepteret: 12 jun 2014; Udgivet: 10. juli 2014

Copyright: © 2014 Lundberg et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Den Cancer Research Foundation i Nordsverige, OE og Edla Johanssons fundament, Petrus og Augusta Hedlunds Foundation, Magn Bergvall Foundation, Den svenske Cancer Society, Forskningsrådet svensk og Umeå Universitet. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Sporadisk kolorektal cancer (CRC) er en almindelig malignitet i den vestlige verden, og en af ​​de vigtigste årsager til kræftdødsfald. Den høje dødelighed på grund af okkult eller klinisk identificeret dissemineret sygdom allerede på diagnosetidspunktet, understreger betydningen af ​​en større forståelse af de biologiske begivenheder, der førte til en invasiv cancer. Denne viden er vigtig at forudsige patientens prognose og skabe nye, kraftfulde behandlingsformer. Adenom til carcinom sekvens depicture de genetiske hændelser, der er nødvendige for en normal colon epitel at blive omdannet til en malign fænotype i de fleste af de sporadiske CRC sager [1]. Da den metastatiske proces i CRC ikke er så fuldt forstået, er det svært at belyse, hvorfor nogle tumorer blive mere aggressive og metastaserer lettere end andre. Identifikation af molekylære markører udtrykt i invasive tumorer, der kan forudsige dårlig patient prognose er derfor en vigtig forskning emne.

SRY (sex bestemme region Y) -boks 2 (SOX2) er et medlem af den store

SOX

gen familie, bestående af transkriptionsfaktorer vides at være vigtige i reguleringen af ​​udviklingsprocesser og celletype specifikation [2]. Nøglen medlem SOX2 spiller væsentlige roller i opretholdelsen af ​​cellens pluripotens og selv-fornyelse i både embryonale stamceller [3], og i inducerede pluripotente stamceller [4]. For nylig er det også blevet rapporteret, at selv-fornyelse af cancer stamceller vedligeholdes af SOX2 [5], hvilket tyder på en ongogenic rolle SOX2. Overekspression af SOX2 kan ses i CRC [6] – [8] samt i flere andre maligniteter såsom bryst-, pancreas og gastrisk kræft [9] – [11], viser sit engagement i carcinogenese. Desuden har SOX2 blevet foreslået at være involveret i CRC cellemigrering, invasion og metastase, hvor matrixmetalloproteinase 2 (MMP2) er blevet foreslået som en mulig mediator for SOX2 virkning [6], men de nøjagtige mekanismer skal stadig blive opdaget .

i den foreliggende undersøgelse vurderede vi SOX2 ekspression i primære CRC, samt i prøver af tilsvarende levermetastaser, og korreleret vores resultater til patient prognose og molekylære tumor egenskaber. Vores resultater antyder, at SOX2 udtryk er, i det mindste delvist, reguleret af BRAF, og at ekspression af BRAF

V600E i en fase afhængig måde korrelerer med en dårlig patient prognose.

Materialer og Metoder

Etik Statement

i den foreliggende undersøgelse, håndtering af vævsprøver og patientdata blev godkendt af forskning etiske komité ved Umeå Universitetshospital (Regional etisk Review Board i Umeå, Sverige). Dette omfatter den procedure, hvorved patienterne verbalt gav deres informerede samtykke, som blev dokumenteret i hver patient record og anses af den etiske komité at være tilstrækkelig. Hver vævsprøve blev registreret som et sagsnummer og år i databasen bruges til analyserne, og navne eller personlig identifikation blev ikke angivet.

Kliniske prøver

CRC vævsprøver inkluderet i undersøgelsen var fra kolorektal cancer i Umeå Study (crums), som består af patienter, der er blevet kirurgisk resektion for primær CRC mellem 1995 og 2003 ved Umeå Universitetshospital, Sverige. Histopatologiske klassificeringer af alle tilfælde blev udført af en patolog ved at gennemgå rutinemæssigt farvede tumor sektioner. Kliniske data blev opnået ved at gennemgå patientjournaler, og overlevelsesdata blev indsamlet i løbet af efteråret 2012.

13 patienter med arkivering væv fra både en primær kolorektal adenocarcinom og tilsvarende fjernt levermetastaser, der blev diagnosticeret i samme tidsinterval som crums blev inkluderet i den foreliggende undersøgelse. Disse blev identificeret ved hjælp af den elektroniske patientjournal-database ved Institut for Klinisk Patologi, Umeå Universitetshospital, Sverige. De tumorer blev gradueret og diagnosticeret af patologer på tidspunktet for kirurgi eller biopsi.

Immunhistokemi

CRC prøver blev formalin-fikseret og paraffin indlejret i henhold til rutinemæssige protokoller ved Institut for Klinisk Patologi, Umeå Universitetshospital, Sverige. De blev skåret ved 4-um og derefter tørret, deparaffineret og rehydreret. Anti-SOX2 polyklonalt antistof [12] – [14] (Abcam, Cambridge, UK) blev anvendt ved en koncentration på 1:500 i et halvautomatisk farvning maskine (Bench Mark Ultra, Ventana Inc) og visualiseret ved iView DAB Detection kit (Ventana Inc)). Objektglassene blev modfarvet med hematoxylin.

I crums, blev 449 tilfælde immunhistokemisk farvede, men på grund af manglende tumor materiale (n = 7) eller gentagne tab væv under antigen-genvinding trin (n = 1), otte af dem kunne ikke analyseres for SOX2 farvning. Alle de 13 patienter med tilsvarende metastase lykkedes farves, og alle kunne analyseres for Sox2-positive celler. Prøverne blev revideret under lysmikroskopi, og hver prøve blev evalueret to gange af samme observatør, og i tilfælde med afvigende scoring, blev en tredje endelig evaluering foretaget. Nuklear farvning blev bedømt som negative eller positive. Lejlighedsvis cytoplasmatisk eller stromal farvning blev ikke analyseret.

statistiske analyser

Foreninger mellem SOX2 udtryk og forskellige klinisk-patologiske variabler blev analyseret ved hjælp af Pearsons χ

2 tests. For at estimere cancer-specifik overlevelse, blev anvendt Kaplan-Meier overlevelsesanalyse, og sammenligninger mellem grupper blev foretaget under anvendelse af log-rank test. Patienterne i crums kohorten, der døde inden for en måned fra kirurgi på grund af postoperative komplikationer (n = 37) blev udelukket fra overlevelse analyser. Cox proportional hazard modeller blev anvendt til multivariate analyser. Kræft-specifikke hændelser blev defineret som død med kendt dissemineret eller tilbagevendende sygdom, og sager blev censureret i slutningen af ​​opfølgningen eller på tidspunktet for døden ved andre årsager. SPSS /PASW statistisk software-version 20 (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA) blev anvendt til de statistiske analyser. Genekspressionsniveauer blev sammenlignet ved anvendelse tosidet Students

t

test. Hver søjle repræsenterer gennemsnittet af tre uafhængige forsøg, og fejlsøjlerne viser standardafvigelsen.

s

. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant for alle analyser

cellelinjer og cellekultur

I den foreliggende undersøgelse, at coloncancercellelinie Caco2 (American Type Culture indsamling, blev Manassas, VA, USA) dyrkes i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) med glutamax suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Gibco, Life Technologies, Stockholm, Sverige) og holdt ved 37 ° C og 5% CO

2. Generation af de stabile transfektanter udtrykker SOX2 (Caco2-SOX2), mutant BRAF (Caco2-BRAF

V600E) eller mutant KRAS (Caco2-KRAS

G12V) blev udført ved transfektion Caco2-celler med pcDNA3.3-SOX2 ( Derrick Rossi, Childrens Hospital Boston, USA, via Addgene), pMCEF-BRAFV

600E (venligst stillet til rådighed af professor R. Marais) eller pcDNA3-KRAS

G12V (slags gave fra Dr. N. Ignatenko) ved hjælp af Caco-2 transfektionsreagens (Altogen Biosystems, Las Vegas, NV, USA) ifølge producentens anvisninger. Mellem 48 og 72 timer efter eksponering for DNA, blev transficerede celler udvælges med 800 ug /ml G418 (Gibco, Life Technologies, Stockholm, Sverige). Medium indeholdende G418 blev ændret to gange om ugen.

For at blokere BRAF signalering i Caco2 og Caco2-BRAF

V600E celler, 20 uM MEK-inhibitor PD98059 (Santa Cruz Bioteknologi, Santa Cruz, CA, USA), eller DMSO som kontrol blev tilsat til cellerne efter inkubation i 24 eller 48 timer.

RT-PCR

Totalt RNA blev isoleret fra celler ved anvendelse af NucleoSpin RNA II kit (Macherey-Nagel, Duren , Tyskland), og cDNA blev syntetiseret med Superscript II revers transkriptase (Invitrogen, Life Technologies, Stockholm, Sverige) ifølge producentens protokoller. Primere anvendt i undersøgelsen var fra DNA Technology A /S (Århus, Danmark) og deres sekvenser var som følger: GAPDH fremad: 5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3 ‘, revers: 5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3’. SOX2 frem: 5′-AACCCCAAGATGCACAACTC-3 ‘, omvendt: 5′-CGGGGCCGGTATTTATAATC-3’. FGFR1 frem: 5′-AGGCTACAAGGTCCGTTATGC-3 ‘, omvendt: 5’TGCCGTACTCATTCTCCACAA-3’. FGFR2 frem: 5′-TTAAGCAGGAGCATCGCATTG-3 ‘, omvendt: 5’GGGACCACACTTTCCATAATGAG-3’. FGFR3 frem: 5′-CCTCGGGAGATGACGAAGAC-3 ‘, omvendt: 5′-CGGGCCGTGTCCAGTAAGG-3’. FGFR4 frem: 5′-TGCAGAATCTCACCTTGATTACA-3 ‘, omvendt: 5′-GGGGTAACTGTGCCTATTCG-3’. Hver PCR-reaktion indeholdt 25 ng cDNA og hver prøve blev kørt in duplo. Forsøgene blev gentaget tre gange. Standardafvigelser blev beregnet af gennemsnittet af tredobbelte reaktioner. RT-PCR-reaktioner blev udført på Taqman 7900HT (Applied Biosystems, Life Technologies, Stockholm, Sverige) og følgende cyklusparametre anvendtes: 50 ° C i 2 minutter og derefter en indledende denaturering ved 95 ° C i 10 minutter, efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 60 s. Gene udtryk blev normaliseret til GAPDH.

Western blot

For at analysere SOX2 udtryk i stalden Caco2-SOX2 transfektant, cellerne blev lyseret i lysisbuffer (100 mM NaCl, 50 mM Tris, pH 7,5, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA, pH 8,0, 15 mM MgCl

2, proteininhibitorer) før proteiner blev separeret ved SDS PAGE og overført til en PVDF-membran (GE Healthcare, Uppsala, Sverige). Blottet blev inkuberet med primært SOX2 antistof (1:1000, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) og sekundært antistof konjugeret til peberrodsperoxidase (GE Healthcare, Uppsala, Sverige) ifølge producentens anvisninger. Blottet blev fremkaldt med ECL Select Western Blotting Detection Reagent (GE Healthcare, Uppsala, Sverige).

Digital droplet PCR

Genomisk DNA blev isoleret fra celler ved anvendelse af Nucleospin Tissue kit (Macherey- Nagel, Düren, Tyskland) i overensstemmelse med producentens anvisninger.

Digital dråbe PCR (ddPCR, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) blev anvendt til at verificere Caco2 transfektanter, der udtrykker mutant

BRAF

V600E

(Caco2-BRAF

V600E) og

KRAS

G12V

(Caco2-KRAS

G12V). Den ddPCR-metode er blevet præsenteret grundigt andre steder [15], [16]. Kort fortalt ddPCR tillader påvisning og kvantificering af både mutation og vildtype i samme reaktion under anvendelse af fluorophorer FAM og HEX konjugeret til sekventering specifikke prober. I ddPCR-metoden, er en PCR prøve på 20 pi opdelt i 20 000 nanoliter dråber giver omkring 20 000 læser.

For at verificere en vellykket transfektion af Caco2-BRAF

V600E, primerne og proberne var som følger: fremad: 5′-GCACAGGGCATGGATTACTTACA-3 ‘, omvendt: 5′-ATCCAGACAACTGTTCAAACTGATG-3′, vildtype sonde: 5′-56-FAM /TTGGTCTAGCTACAGTGAAAT /3BHQ_1-3 «, mutation sonde: 5’-5HEX /TTGGTCTAGCTACAGAGAAAT /3BHQ_1-3 ‘(DNA Technology A /S, DNA Technology A /S) [17], [18]. PCR blev udført i en T100 Thermal Cycler (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) under anvendelse af programmet: 95 ° C i 10 min; 40x cykler ved 95 ° C i 15 s og 56 ° C i 1 min (stigningsgrad 2 ° C /sek); og 98 ° C i 10 minutter. 900 nM af primerne, og 250 nM respektive sonde blev brugt

Til påvisning af vellykket transfektion af Caco2-KRAS

G12V blev assays for ddPCR brugt (PrimePCR ddPCR Mutation Assay:. KRAS p.G12V assay, human, PrimePCR ddPCR Mutation assay: KRAS wild type for p.G12V assay, Menneske, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) med PCR-betingelser i henhold til vejledningen, som virksomheden: 95 ° C i 10 min; 40x cyklusser af 94 ° C i 30 s og 55 ° C i 1 min (stigningsgrad 2 ° C /sek); og 98 ° C i 10 minutter.

Hver PCR-reaktion indeholdt 50 ng DNA og dråberne blev fremstillet på mX100 dråbe generator (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Det endelige PCR-produkt blev detekteret i en QX200 dråbe læser (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) og den analyserede med QuantaSoft software resultat, Version 1.4 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).

CpG ø methylator fænotype (CIMP) status

Tumor CIMP status blev bestemt af MethyLight metoden med primer og probe sekvenser, der er beskrevet tidligere [19], [20]. For de otte gener i CIMP panelet (

CDKN2A

,

MLH1

,

CACNA1G

,

NEUROG1

,

RUNX3

,

SOCS1

,

IGF2

CRABP1

) [20] procent af methylerede reference (PMR) blev beregnet, hvor PMR 10 blev betragtet som positiv [19]. Tumorer blev klassificeret som CIMP negativ (ingen promotor hypermethylering), CIMP lav (et til fem gener methylerede) eller CIMP høj (seks til otte gener methylerede) [20].

mikrosatelitter ustabilitet (MSI) screening status

mismatch repair proteiner blev analyseret ved immunohistokemi som tidligere beskrevet [20]. Kort beskrevet formalin-fikseret og paraffinindlejret CRC væv blev undersøgt for ekspression af fire fejlparringsreparationsgener proteiner (MLH1, MSH2, MSH6 og PMS2). En prøve anses at have en positiv MSI screening status manglede nukleær farvning i tumorceller i mindst et af proteinerne og omtales som MSI. En negativ MSI screening status havde udtryk for alle fire gener og blev omtalt som mikrosatellit stabil (MSS).

BRAF

V600E mutationsstatus

Taqman diskrimination allel assay, beskrevet i detaljer andetsteds [17], blev anvendt til påvisning af

BRAF

V600E

mutation (reagenser fra Applied Biosystems, Life Technologies, Stockholm, Sverige).

KRAS sekventering

Mutationsanalyse af

KRAS

er blevet forklaret andetsteds [21]. . Sekventeringen blev udført under anvendelse af Big Dye v 3.1 (Applied Biosystems, Life Technologies, Stockholm, Sverige) og anvendte primere var: forward: 5′-TGTAAAACGACGGCCAGTGAGTTTGTATTAAAAGGTACTGG-3 ‘og revers: 5′-CAGGAAACAGCTATGACCTCTGTATCAAAGAATGGTCCT-3’.

Resultater

SOX2 udtryk i CRC korrelerer med tumor kvalitet, TNM stadie og

BRAF

mutation

nuklear SOX2 udtryk i tumorceller blev evalueret i 441 CRC patientprøver ved immunhistokemi, hvor ekspression blev vurderet som enten positive eller negative (figur 1). I de positive tilfælde blev SOX2 udtryk aldrig set i hele tumor, men positive kerner blev fundet i begrænsede dele. Lejlighedsvis stromale eller cytoplasmatisk farvning blev ikke evalueret. 47 (10,7%) af CRC prøver viste tumorceller, der udtrykker SOX2 og ekspressionen i forhold til forskellige klinisk-patologiske karakteristika er vist i tabel 1. I vores patient kohorte, SOX2 ekspression viste sig at være signifikant associeret med en høj tumor bedømmelse (

s

= 0,004) og TNM stadie (

s

= 0,034). SOX2 udtryk blev også stærkt korreleret til

BRAF

mutation (

s

0,001), men overraskende ingen korrelation til

KRAS

mutationer kunne ses (

p

= 0,928).

(a) Negativ nukleare SOX2 farvning i et moderat differentieret CRC. (B) Positive nukleare SOX2 farvning i en dårligt differentieret CRC.

SOX2 udtryk er korreleret til en dårlig patient overlevelse

Kræft-specifik overlevelse analyser viste, at patienter med SOX2 positive tumorer havde en dårligere prognose end patienter med Sox2 negative tumorer (figur 2a). Denne forening var endnu stærkere, når kun det

BRAF

muterede tumorer blev analyseret (figur 2b), mens der ikke forskel på SOX2 udtryk på overlevelse blev set i

BRAF

vildtype tumorer (figur 3c). SOX2 udtryk havde ikke nogen indvirkning på patientens prognose i

KRAS

muterede tumorer (

s

= 0,676). I en multivariat Cox proportional hazard model herunder alder, køn,

BRAF

mutation, og SOX2 udtryk, den dårlig prognose for patienter med SOX2 udtryk versus ingen SOX2 udtryk bevaret statistisk signifikans (hazard ratio (HR) = 1,64, 95 % CI 1,04-2,58,

s

= 0,032). Når yderligere justering for fase i den multivariate analyse, blev den prognostiske betydning af SOX2 udtryk tabt (HR = 1,04, 95% CI 0,65-1,67,

s

= 0,878), understreger etape afhængighed.

Vist er Kaplan-Meier-kurver over kræft-specifik overlevelse i (A) alle CRC patienter, (B)

BRAF

V600E

muterede CRC patienter eller (C)

BRAF

vildtype CRC patienter.

(A) Caco2 celler, Caco2 celler stabilt udtrykker

BRAF

mutation (Caco2-BRAF

V600E) og Caco2 celler stabilt udtrykker

KRAS

mutation (Caco2-KRAS

G12V). SOX2 ekspression i Caco2 blev fastsat som 1. (B) Caco2 efter dyrkning med MEK-inhibitor, 24 eller 48 timer, eller DMSO i 48 timer som kontrol. SOX2 udtryk i Caco2 behandlet med DMSO blev sat som 1. (C) Caco2-BRAF

V600E efter dyrkning med MEK-inhibitor, 24 eller 48 timer, eller DMSO i 48 h som kontrol. SOX2 udtryk i Caco2-BRAF

V600E behandlet med DMSO blev sat som 1. PD: PD98059 (MEK-inhibitor), *

s

0,05, **

s

0,01, ***

s

0,001, ns: ikke væsentlig

s

-værdi

SOX2 udtryk er reguleret af BRAF

i. vitro

Som SOX2 udtryk korreleret med muteret

BRAF

i vores patient kohorte, vi fortsatte med at analysere deres molekylære forhold

in vitro

. CRC cellelinie Caco2, med endogent BRAF og KRAS vildtype, blev transficeret med enten BRAF

V600E eller KRAS

G12V for at etablere cellelinjer, der stabilt udtrykker mutant

BRAF

(Caco2-BRAF

V600E, figur S1a) eller mutant

KRAS

(Caco2-KRAS

G12V, figur S1b). Ved RT-PCR-analyser fandt vi, at Caco2-BRAF

V600E udtrykt omkring dobbelt så høje Sox2-niveauer i forhold til Caco2 (

s

= 0,013), en stigning, som ikke blev set i Caco2-KRAS

G12V (figur 3a). Disse resultater, i konkordans med vore data fra patienten kohorte (tabel 1), antyder, at ekspressionen af ​​SOX2 reguleres af muteret BRAF.

BRAF

V600E

mutation gør BRAF i et konstitutivt aktiv tilstand, stimulere MEK /ERK signalering kaskade i mangel af ekstracellulære stimuli [22]. Faktisk blokerer BRAF nedstrøms signalering i Caco2-BRAF

V600E celler ved hjælp af MEK-inhibitor PD98059, resulterede i et fald udtryk for SOX2 (figur 3c), hvilket tyder på, at det primært er de godt karakteriserede MEK aktiverende aktivitet af BRAF der regulerer SOX2 . Desuden blev de lave endogene niveauer af SOX2 i Caco2-celler faldt også med MEK-inhibitor (figur 3b), hvilket indebærer, at BRAF reagere på endogene aktiveringssignaler også regulerer SOX2 ekspression. Sammen disse resultater understøtter rolle BRAF som en opstrøms regulator af SOX2 udtryk.

Primær SOX2 positiv CRC har SOX2 positive tilsvarende levermetastaser

I betragtning af at, at SOX2 udtryk er korreleret til en dårligere patient prognose, vi ønskede at studere SOX2 udtryk i primære tumorer samt tilsvarende fjernmetastaser. Til dette blev 13 patienter med arkivering væv fra både en primær colorektal adenocarcinom og fjernt levermetastaser inkluderet i undersøgelsen og nuklear SOX2 ekspression blev vurderet i epitelceller. To af de 13 primære tumorer var SOX2 positive, mens de øvrige elleve tumorer var SOX2 negative. Interessant Sox2 positive primære tumorer blev også SOX2 positive i tilsvarende levermetastaser, mens Sox2 negative tumorer havde SOX2 negativ levermetastaser (tabel 2). Bemærkelsesværdige disse SOX2 positive metastaser var morfologisk mere ens tumor rummene har Sox2 positive kerner end resten af ​​den primære tumor (data ikke vist).

SOX2 øge ekspressionen af ​​FGFR1

deregulering af fibroblast vækstfaktorreceptorer (FGFR’er) ses i CRC samt i andre cancere [23], [24]. Da det er blevet foreslået, at SOX2 regulere ekspressionen af ​​FGFR3 [7], ønskede vi at undersøge om SOX2 ændret ekspression af FGFR’er i vores

in vitro

system.

En cellelinie overudtrykker SOX2 blev etableret ved transfektion af CRC-cellelinien Caco2 med SOX2 (Caco2-SOX2, fig S2). Ekspressionen af ​​FGFR1-4 blev analyseret ved RT-PCR i Caco2-celler og Caco2-Sox2 celler. FGFR1 udtryk viste sig at være dobbelt så høj i Caco2-SOX2 som i Caco2 (

s

= 0,036), mens ingen signifikante forskelle blev set med hensyn FGFR2, FGFR3 eller FGFR4 (figur 4).

Ekspression af FGFR1, FGFR2, FGFR3 og FGFR4 ved RT-PCR-analyse i Caco2-celler og Caco2 celler, der stabilt overudtrykker SOX2 (Caco2-SOX2). Udtrykket i Caco2 blev fastsat som 1. *

s

0,05, ns:. Ikke-signifikant

s

-værdi

Diskussion

i dette studie undersøgte vi SOX2 udtryk i CRC i korrelation til flere klinisk-patologiske og molekylære variabler og dens effekt på patientens prognose. 11% af tumorerne var SOX2 positiv, og udtrykket korreleret til tumorklassificering, TNM stadie og

BRAF

mutation. Derudover fandt vi, at SOX2 udtryk forudsagt en dårligere patient prognose i en fase afhængig måde, navnlig i

BRAF

muterede sager. Endelig introducerer vi SOX2 som muligt regulator af FGFR1 udtryk.

På grund af den hævdede inddragelse af SOX2 i CRC tumorigenese [25] vi ønskede at undersøge ekspressionen af ​​SOX2 i vores patient kohorte crums. Vi fandt, at 11% af tumorerne udtrykte SOX2 og ved at sammenligne udtryk for forskellige klinisk-patologiske karakteristika kunne vi se, at SOX2 udtryk var korreleret til dårligt differentierede tumorer (høj kvalitet). Dette passer med den viden, SOX2 er et kendt stamcelle markering, og er blevet foreslået at blive udtrykt i cancer stamceller [5], [26]. Som SOX2 ofte blev udtrykt i en begrænset del af tumoren, vi spekulere, at disse celler kan repræsentere kræft stamceller niche i disse særlige tumorer. Vi fandt endvidere, at SOX2 udtryk var korreleret til dårlig patient prognose i en fase afhængig måde, hvilket er i overensstemmelse med nogle tidligere undersøgelser [6], [27], [28].

SOX2 er blevet beskrevet af andre til forbedre den vandrende og invasive effekt af CRC celler [6], [7], som brønde som andre kræft celletyper [29] – [31], hvilket indebærer, at Sox2 udtrykker celler kan huse et højere metastatisk kapacitet. I CRC er det også blevet foreslået, at ekspressionen af ​​SOX2 kan forudsige tumormetastase [6]. Der findes dog ingen undersøgelser i dag af SOX2 udtryk i tumor metastaser. Her har vi vist, at tilsvarende levermetastaser til SOX2 positive primære tumorer også harbor Sox2 positive tumorceller. Selv om disse patientgrupper vævsprøver var meget få, er det stadig indikerer, at Sox2 positive celler er mere tilbøjelige til at migrere. Det ville naturligvis være både interessant og nødvendigt at studere dette i en større patientmateriale til verifikation. Den omstændighed, at Sox2 positive celler kun består en lille del af hele tumoren, antyder, at disse celler kan vise en mere invasiv fænotype end de omgivende tumorceller. En anden dokumentation for en mere invasive opførsel af Sox2 positive tumorceller er, at metastaser var morfologisk mere lig de dele af tumoren med Sox2 positive kerner. Selvom den morfologiske sammenligning mellem primære tumorer og metastaser kun kunne undersøgt i to tilfælde finder vi det sandsynligt, at det kan afspejle specifikke celler, der faktisk er årsag til fjerne metastaser.

SOX2 ekspression blev korreleret til

BRAF

mutation i vores væv kohorte, men ingen sammenhæng kunne ses mellem SOX2 udtryk og

KRAS

mutationer. Vores

in vitro

finde, at en øget SOX2 udtryk sås i celler, der udtrykker BRAF

V600E mutation, men ikke KRAS

G12V mutation, bekræfter denne sammenhæng. RAS /RAF /MAP kinase kaskade er en vej, der er impliceret i mange vigtige cellulære funktioner såsom cellevækst, deling og differentiering [32], og de omfattede proteiner ofte muteret i CRC. Af alle CRC’er, er 30-40% muteret i

KRAS

gen og 5-15% i

BRAF

gen [21], [33]. Disse to mutationer menes at være gensidigt udelukkende i CRC [21], [34], og de er begge forbundet med dårlig patient prognose [21], [35] – [37]. Selv om de er involveret i samme vej, kan vi se, at

KRAS

BRAF

muterede CRC’er har forskellige morfologiske udseende. Det er interessant at spekulere i, at sammenslutningen af ​​

BRAF

mutation med SOX2 udtryk kan forklare en del af denne morfologiske forskel. Vi fortsatte med at analysere sammenhængen af ​​BRAF og SOX2 udtryk i vores

in vitro

cellekultur system. Faktisk var SOX2 ekspression fundet at være opreguleret i celler, der udtrykker konstitutivt aktive BRAF

V600E. Endvidere ved at blokere BRAF nedstrøms signalering, endogen SOX2 samt SOX2 ekspression induceret af BRAF

V600E blev nedsat, hvilket viser, at SOX2 ekspression i det mindste delvist reguleret af velkarakteriserede BRAF /MEK pathway. Så vidt vi ved, er dette den første undersøgelse, der viser, at SOX2 ekspression reguleres af BRAF signalering. Et andet interessant resultat var, at den negative prognostiske effekt af SOX2 udtryk var begrænset til

BRAF

muterede patienter, hvilket indikerer, at det er SOX2 udtryk i kombination med

BRAF

mutation, der hovedsagelig bidrager til dårlig prognose .

Det er velkendt, at afvigende ekspression af fibroblast vækstfaktorreceptorer (FGFR’er) kan køre tumorprogression [23], [24]. FGFR-familien består af fire gener, og det har vist sig, at mindst

FGFR3

gen reguleres af SOX2 i CRC [7]. Vores cellelinie overudtrykker SOX2, Caco2-SOX2, havde dobbelt så høje FGFR1 ekspression som Caco2-celler, hvilket indebærer, at FGFR1 ekspression kan reguleres ved SOX2. Andre har vist, at overekspression af FGFR1 findes i CRC [38], og at det er korreleret til levermetastaser [39]. En nylig undersøgelse har også foreslået, at forhøjet ekspression af både SOX2 og FGFR1 er korreleret til dårlig prognose i småcellet lungecancer [40]. Sammen disse resultater tyder på, at SOX2 dels gennem opregulering af FGFR1 kan forbedre fjernt spredning af tumorceller til leveren, hvorved en dårligere patient overlevelse. Der er dog yderligere undersøgelser er nødvendige for at afsløre den rolle og mekanismen for SOX2 og FGFR1 i CRC.

Som konklusion, denne undersøgelse viser, at SOX2 udtryk er korreleret til en dårlig prognose i CRC patienter, og det identificerer for første gang at SOX2 udtryk dels er reguleret af BRAF. Disse resultater i kombination med den observerede korrelation mellem SOX2 positivitet i både primær tumor og tilsvarende metastase, tyder på, at Sox2 positive tumorceller har en større evne til at metastaserer.

Støtte oplysninger

figur S1. .

Vellykket transfektion af pMCEF-BRAF

V600E eller pcDNA3-KRAS

G12V ind Caco2 coloncancercellelinie

doi: 10,1371 /journal.pone.0101957.s001

(PDF)

Figur S2.

Caco2-Sox2 celler har en øget SOX2 udtryk på både mRNA og protein niveau

doi:. 10,1371 /journal.pone.0101957.s002

(PDF)

Tak

forfatterne takker fru Kerstin Näslund, Institut for Medicinsk Biosciences, Patologi, Umeå Universitet, for hendes dygtige teknisk bistand og Anna Dahlin til udførelse af CIMP status analyser.