PLoS ONE: Distinct Roles for Aryl Kulbrinte Receptor Nuclear translokatoren og Ah receptor i østrogen-medieret signalering i Human Cancer Cell Lines

Abstrakt

Den aktiverede AHR /Arnt kompleks (AHRC) regulerer ekspressionen af ​​målgener på udsættelse for miljøforurenende stoffer såsom 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-

s

-dioxin (TCDD). Vigtigere er det, har beviser vist, at TCDD undertrykker østrogen receptor (ER) target genaktivering gennem AHRC. Vores data viser, at AHR og Arnt handle uafhængigt af hinanden på ikke-dioxinlignende respons element sites. Derfor søgte vi at bestemme de specifikke funktioner i AHR og Arnt i østrogen-afhængige signalering i human MCF7 brystkræft og human ECC-1 endometrie karcinom celler. Knockdown af AHR med siRNA ophæver dioxin-inducerbare undertrykkelse af østrogen-afhængige gentranskription. Interessant nok betyder knockdown af Arnt ikke påvirke TCDD-medieret repression af østrogen-regulerede transskription, hvilket antyder, at AHR undertrykker ER fungerer uafhængigt af Arnt. Denne teori understøttes af evnen hos den selektive AHR modulator 3 ‘, 4’-dimethoxy-α-naphthoflavon (DiMNF) undertrykke østrogen-inducerbar transkription. Endvidere basal og østrogen-aktiveret transkription af gener, der koder

cathepsin-D

pS2

er nedreguleret i MCF7-celler, men opregulerede i ECC-1-celler som respons på tab af Arnt. Disse reaktioner er spejlet på proteinniveauet med cathepsin-D. Desuden knock-down af Arnt førte til modsatte, men tilsvarende ændringer i østrogen-stimuleret proliferation i både MCF7 og ECC-1 celler. Vi har fået eksperimentel dokumentation en dioxin-afhængig repressor funktion for AHR og en dioxin-uafhængig co-aktivator /co-repressor funktion for Arnt i østrogen signalering. Disse resultater giver os yderligere indsigt i mekanismerne i transskription faktor krydstale og formodede terapeutiske mål i østrogen-positive kræftformer

Henvisning:. Labrecque MP, Takhar MK, Hollingshead BD, Prefontaine GG, PERDEW GH, Beischlag TV ( 2012) Særskilte Roles for Aryl Kulbrinte Receptor Nuclear translokatoren og Ah receptor i østrogen-medieret signalering i menneskelige kræftceller. PLoS ONE 7 (1): e29545. doi: 10,1371 /journal.pone.0029545

Redaktør: Bernhard Ryffel, franske Nationale Center for Videnskabelig Forskning, Frankrig

Modtaget: 24 oktober, 2011; Accepteret: November 30, 2011; Udgivet: januar 3, 2012 |

Copyright: © 2012 Labrecque et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af den canadiske Breast Cancer Foundation – BC /Yukon, naturvidenskab og Engineering Research Council til Dr. Beischlag, og et National Institutes of Health give ES04869 til Dr. PERDEW. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

belyse de mekanismer der ligger til grund transkription er afgørende for vores forståelse af, hvordan celler og organismer reagerer på fysiologiske signaler og miljømæssige stimuli. Aryl hydrocarbon receptor (AHR), og aryl hydrocarbon receptor nuklear translokatoren (Arnt) er medlemmer af den grundlæggende helix-loop-helix /PER-ARNT-SIM (bHLH-PAS) familien af ​​proteiner og danne en heterodimer transkriptionsfaktor ved binding en række miljøbelastende stoffer, herunder 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-

s

-dioxin (TCDD) [1]. Den aktiverede AHR /Arnt kompleks (AHRC) spiller centrale roller i carcinogenese og regulerer ekspressionen af ​​

cytochrom P4501A1 Hotel (

CYP1A1

) og andre miljøfremmede målgener at bekæmpe virkningerne af miljøbelastende stoffer [1 ]. Desuden har AHR vist sig at være vigtig for normal udvikling og fysiologisk homeostase [2], [3], [4] og er afgørende for visse funktioner i immunresponset, såsom regulering af interleukin-17 producerende T-hjælper celler [5] og induktion af cytokinet interleukin-6 i MCF7 brystkræftceller [6].

ligandholdigt AHR eksisterer i cytoplasmaet som del af et multimert kompleks indeholdende to molekyler af HSP90, hsp90 co-chaperone p23 og hepatitis B-virus X-associeret protein 2 (XAP2) [7], [8], [9], [10]. Ved ligandbinding, AHR translokeres til kernen, hvor det associerer med ARNT til dannelse af en funktionel transskriptionsfaktor komplekset, AHRC. Som en aktiveret kompleks, AHRC er i stand til at rekruttere regulatoriske proteiner, såsom steroid receptor coaktivator-1 (SRC-1), CREB protein (CBP /p300), NCoA2 /GRIP1 [11], [12], receptor-interagerende Protein 140 (RIP140) [13], kakao [14], GAC63 [15], NcoA4 [16] og TRIP230 [17], som spiller en væsentlig rolle i bestemmelse af aktiviteten af ​​TCDD-induceret gentranskription. Disse co-aktivatorer og co-repressorer indarbejde sig i multimere komplekser, der modificerer kromatin struktur, stabilisere kernen transkriptionel maskiner, og mægle RNA kæde forlængelse [18]. Ud over disse klassiske transkriptionelle co-aktivatorer og co-repressorer, er AHR rekrutteret af andre transkriptionsfaktorer under transkription, herunder østrogenreceptor-α (ERa) [11], [19], [20] og NF-KB [21] at ændre deres iboende aktiviteter.

ERa /β er ligand transkriptionsfaktorer, der hører til superfamilien af ​​nukleare hormonreceptorer (NR) [22] og binder 17β-estradiol (E2) for at regulere gener involveret i reproduktion og cellulær vækst og proliferation [23]. Ved ligandbinding, ER danner en funktionel homodimer og binder dets beslægtede responselementer. Interessant nok er en ligand-afhængig gensidige forstyrrelser mellem ER og AHR signalering. For eksempel, aktiveret ERa inhiberer AHRC aktivitet ved

CYP1A1

gennem direkte protein-protein interaktioner, betegnes

transrepression

[11]. Omvendt er TCDD anti-østrogene egenskaber veldokumenteret som det undertrykker de E2-inducerbare gener

pS2

og

cathepsin-D (CAT-D)

[24], [25], [26 ]. Men mekanismerne i undertrykkelse forekommer ved E2-responsive gener er uklare. Foreslåede teorier for denne undertrykkelse omfatter: (i) konkurrence om en fælles pulje af co-aktivatorer [27]; (Ii) en direkte nedregulering af

CAT-D

transskription gennem opstrøms hæmmende dioxin respons elementer [28]; (Iii) aktivering af en TCDD-inducerbar inhibitorisk faktor [28]; (Iv) et AHR-afhængige E3-ligase, der nedbryder proteiner er afgørende for ER-signalering [29], eller; (V) en direkte transrepression interaktion mellem AHR og ER [11], [19].

I denne undersøgelse undersøgte vi rolle AHR og Arnt på ERa-afhængig målgen transkription i den humane MCF7 brystcancer og de menneskelige ECC-1 endometrie-livmoderhalskræft cellelinjer. Vore data antyder, at AHR og Arnt handle uafhængigt af hinanden ved off-målsteder og vi viste, at ARNT ikke er essentiel for TCDD-afhængig repression af ER-signalering. Derudover har vi vist, at ARNT fungerer som en cellespecifik coaktivator i MCF7-celler, og som en co-repressorkomplekset i ECC-1-celler. Endelig viser vi, at Arnt knockdown ikke kun påvirker ophobning af mRNA og protein af ERa-målgener, men også har fænotypiske konsekvenser ved at påvirke ERa-medieret celleproliferation.

Resultater

AHR-afhængige undertrykkelse af østrogen signalering i ECC-1 celler

tilstedeværelsen af ​​AHR, Arnt og ERa på dioxin-inducerbare

CYP1A1

forstærker og E2-inducerbare

pS2

promotor har allerede blevet dokumenteret i MCF7-celler og andre brystkræft cellelinier [11], [19], [20], [30]. Selv om indledende studier har identificeret ECC-1 humane endometriale celler som et ideelt system til at studere dioxin afbrydelse af østrogen signalering [31], [32] Der vides meget lidt om roller AHR, Arnt og ER og deres respektive interaktioner i denne cellelinie . Vi beskæftigede chip-analysen at fastslå status for disse proteiner på

pS2

promotor og

CYP1A1

forstærker i både nærvær og fravær af E2 og TCDD. ECC-1-celler blev behandlet med DMSO, 10 nM E2, 2 nM TCDD eller en kombination af E2 og TCDD i 45 min. Efter kemisk tværbinding protein til DNA med formaldehyd, blev celler høstet og sonikeret. Sheared DNA-protein-komplekser blev udfældet med antistoffer specifikke for AHR, Arnt eller ERa og derefter isoleret komplekser blev revers-tværbundet og DNA blev underkastet PCR-amplifikation. I overensstemmelse med andre efterforskere bemærkninger i brystkræftceller, vi observerede rekruttering af AHR og Arnt på den menneskelige

CYP1A1

forstærker i en TCDD-afhængig mode og ERa var stærkt beriget efter behandling med en kombination af to nM TCDD og 10 nM E2 (figur 1A). Desuden rekruttering af ERa til

pS2

promotor forekommer i en E2-afhængig måde, mens AHR og Arnt er til stede efter behandling med enten ligand men er beriget ved samtidig behandling (figur 1B).

Chromatin immunopræcipitationsanalyser af

CYP1A1

enhancer (A) og

pS2

promotoren (b) regioner i ECC-1-celler under anvendelse af antistoffer rettet mod AHR, Arnt eller ERa. Cellerne blev behandlet i 45 minutter med enten DMSO, E2 (10 nM), TCDD (2 nM) eller en kombination af E2 og TCDD. (C og D) Den funktionelle rolle AHR i TCDD-medieret transkription. ECC-1-celler blev transficeret med siRNA’er til enten GFP (siGFP) som en negativ kontrol eller AHR (siAHR # 3 eller siAHR # 4) 24 timer forud for ligandbehandling, så celler blev behandlet med DMSO, E2 (10 nM), TCDD (2 nM) eller en kombination af E2 og TCDD. MRNA niveauer for

pS2

(C) og

CYP1A1

(D) blev bestemt ved real-time RT-PCR og normaliseret til konstitutivt aktiv GAPDH udtryk. (E) ECC-1 celler blev transficeret med siRNA-s til AHR og høstet for helcellelysater til Western blot analyse af AHR, ERa- og XAP2 protein niveauer.

Vi har tidligere vist, at ERa- forbinder med AHRC at mægle estradiol-afhængig transrepression af dioxin-inducerbare gentranskription [11]. Derfor satte vi os for at bestemme den funktionelle betydning af AHR i østrogen-inducerbare gentranskription. Vi transficerede ECC-1-celler med lille inhibitorisk RNA rettet mod enten AHR (siAHR) eller en GFP negativ kontrol (siGFP). Efter transfektion blev celler serumudsultet i 24 timer, efterfulgt af 24 timer ligand behandling og derefter høstet for total mRNA, blev kvantificeret ved kvantitativ PCR. Som forventet, ablation af AHR og co-behandling med 2 nM TCDD og 10 nM E2 resulterer i tab af TCDD-induceret undertrykkelse af

pS2

transskription (figur 1C). Men tabet af AHR havde nogen målelig virkning på basal eller østrogen udløst

pS2

mRNA akkumulering. Som en kontrol for siRNA specificitet, Western blots af AHR protein viser en stærkt reduceret ekspression af AHR protein efter transfektion og uændret proteinniveauer af ERa og XAP2 der tjente som en loading kontrol (figur 1E). Disse demonstrerer specificiteten af ​​siRNA er til AHR, og at tab af AHR påvirker ikke akkumulation eller omsætning af basale ERa- protein niveauer. Endvidere induktionen af ​​

CYP1A1

transkription med TCDD efter AHR knockdown dæmpes i sammenligning med siGFP negative kontrol (figur 1D). Således AHR er et krav for TCDD-induceret repression af E2-responsive gentranskription og den øgede transkriptionel respons med kombinatorisk behandling udelukkende skyldes tabet af AHR og andre formodede transkriptionelle modifikatorer i forbindelse med sin tilstedeværelse. Endelig har vi opnået væsentlige identiske resultater i både MCF7 og ECC-1 cellelinjer under serum-udsultet eller kul-strippet serum betingelser tyder på, at forskelle i cellelinierne evne til at gå gennem cellecyklus påvirker ikke dette fænomen. Tilsammen udgør disse resultater støtter konceptet, at ECC-1 cellelinie er et glimrende alternativ celle model til at studere dioxin-induceret afbrydelse af østrogen receptor signalering.

Arnt har celle specifik co-aktivator /co-repressor funktioner

identifikationen af ​​Arnt som en co-aktivator i østrogen signalering [27], [30], sammenstillet med de kendte transrepressor virkninger af TCDD, førte os til at undersøge den rolle, som Arnt spillet i TCDD-medieret transrepression af ER funktion i forskellige humane cancercellelinier, nemlig MCF7 og ECC-1-celler. Gennem siRNA rettet mod Arnt og en kodet negativ kontrol (siSCX), og efterfølgende qPCR analyse af endogen

pS2

og

CAT-D

gentranskription, vi gjort flere interessante iagttagelser. Først Arnt viser co-repressor ejendomme i ECC-1 celler. Ophobning af

pS2

(figur 2A) og

CAT-D

(figur 2B) mRNA-niveauer forværres under E2 behandlinger efter tab af Arnt tyder en celle bestemt funktion i Arnt uafhængig af AHR. Endvidere observerede vi dette fænomen med tre separate siRNA’er rettet mod ARNT (siRNA s 1 og 3 er vist i figur 2A, B og C). Vi brugte mindst to siRNA er for alle andre eksperimentelle parametre med væsentlige identiske resultater, men for kortfattethed, herefter vi kun præsentere data skildrer brugen af ​​en siRNA. For det andet, i overensstemmelse med resultaterne af en række andre forskere, Arnt viste co-aktivator ejendomme i MCF7-celler [27], [30]. Faktisk knockdown af Arnt protein dæmper E2-induceret transskription af

pS2

(Figur 2C) og

CAT-D

(figur 2D). Endelig i en dosis respons eksperiment, observerede vi en ledsagende fald af CAT-D-proteinniveauer med stigende koncentrationer af TCDD i både ECC-1 og MCF7-celler (figur 2E). Disse data indikerer, at ARNT funktion som den vedrører ER signalering sandsynligvis dikteres af andre faktorer specifikke for den cellulære miljø.

ECC-1-celler (A og B) og MCF7-celler (C og D) blev transficeret med enten scrambled siRNA (siSCX) eller siRNA rettet til Arnt (siARNT # 1 eller siARNT # 3). Fireogtyve timer efter transfektion blev celler behandlet med vehikel (DMSO), E2 (10 nM), TCDD (2 nM) eller en kombination af E2 og TCDD. Genekspression blev bestemt ved real-time RT-PCR efter isolering og revers transkription af totalt RNA.

CAT-D

pS2

udtryk blev normaliseret til konstitutivt aktiv 36B4 genekspression. (E) Western blot-analyse af CAT-D-protein-niveauer i MCF7 og ECC-1-celler. Celler blev behandlet med DMSO eller E2 (10 nM) og forskellige koncentrationer af TCDD (10 pM, 50 pM, 100 pM, 500 pM, 1 nM eller 5 nM). Efter 24 timers behandling blev helcellelysater høstet, og Western blot assays blev udført under anvendelse af antistoffer rettet mod CAT-D og α-tubulin. Fejl søjler repræsenterer ± standardafvigelse * P. 0,05

For at bestemme om modulation af transkriptionsaktivitet oversat til lignende protein udtryk profiler, vi brugte Western blot-analyse for at visualisere niveauet for CAT-D-protein efter ARNT knockdown. Celler blev transficeret og ligand behandlet under identiske vilkår som qPCR parametre. I forhold til den krypterede negative kontrol, er CAT-D-protein-ekspression efter E2 behandling forværres i ECC-1-celler med ARNT knockdown (figur 3A). Omvendt MCF7-celler transficeret med Arnt siRNA resulterede i en svækket ekspression af CAT-D-protein under E2 behandling (figur 3C). Endvidere ERa- niveauer forblev konstante, uanset ARNT status (figur 3A og C). Vigtigst var dioxin-induceret undertrykkelse af ER-signalering holdes på proteinniveauet efter ARNT knockdown (figur 3A og C). De repræsentative blots blev normaliseret til a-tubulin og luminescens blev målt ved anvendelse GeneTools 4.01.2 software (Syngene). Disse normaliserede værdier viste en dobbelt induktion af CAT-D i ECC-1 celler med Arnt knockdown efter E2 behandling (figur 3B, kolonne 2 og 6), mens der i MCF7-celler, knock-down af Arnt resulterede i et fald på 40% i E2-afhængig CAT-D-ekspression (figur 3D, colunms 2 og 6). Disse resultater giver konkret bevis for, at niveauet af protein-ekspression afspejler den transkriptionelle respons i begge cellelinier, og at fysiologiske konsekvenser bør foregå med tab af Arnt.

ECC-1 (A og B) og MCF7 (C og D ) -celler blev transficeret med enten siSCX eller siARNT og ligand behandlet som beskrevet i figur 2. (A og C) Repræsentative Western blots af Arnt, KAT-D, ERa og a-tubulin proteinniveauer. Søjlediagrammer af CAT-D-protein-niveauer i ECC-1 (B) og MCF7 (D) celler efter normalisering luminescens værdier til a-tubulin. Åbne søjler repræsenterer ligand behandlinger efter siRNA til scrambled negativ kontrol (siSCX) og lukket (sort) søjler repræsenterer ligand behandlinger efter siRNA til Arnt (siARNT). Eksperimenter blev udført tre gange med i det væsentlige identiske resultater.

Disse overraskende resultater blev koblet med den observation, at TCDD-induceret undertrykkelse af ER-signalering holdes i begge cellelinier efter ARNT knockdown (figur 2 og 3 ) hvilket giver bevis for, at Arnt ikke er nødvendig for TCDD /AHR-afhængige undertrykkelse af ERa signalering. Denne hypotese understøttes af evnen af ​​en selektiv aryl hydrocarbon receptor modulator (SAHRM) at undertrykke østrogen signalering. Vi undersøgte evnen hos den kendte SAHRM, DiMNF [33], [34] at undertrykke E2-medieret transkription ved RT-PCR i MCF7 og ECC-1-celler (figur 4). DiMNF var så effektiv til at undertrykke CAT-D mRNA akkumulering som TCDD. DiMNF er en potent antagonist af AHR og effektivt fortrænger TCDD fra receptoren ved 1 uM [34]. Desuden DiMNF undlader at inducere AHR-ARNT-dioxin responselement dannelse i en elektroforetisk mobility shift-assay, hvilket antyder, at AHR-ARNT dimerisering ikke kan forekomme [34], således, forekommer det sandsynligt, at AHR s transrepression funktion er helt ARNT-uafhængig.

effekten af ​​en uM DiMNF på E2-inducerbare CAT-D-ekspression i MCF7 og ECC-1 celler. Celler blev behandlet med de angivne ligander i 24 timer før RNA-isolering. Genekspression blev bestemt som beskrevet ovenfor. Fejl søjler repræsenterer ± standardafvigelse * P. 0,05

Arnt knockdown medfører øget proliferation i ECC-1 celler og nedsat proliferation i MCF7-celler

Følsomhed over for østrogen har været knyttet til spredning og celletransformation i ER- positive carcinomaceller [35]. At fastslå, om ARNT kan påvirke E2-afhængig cellulær proliferation, udførte vi proliferationsassays på ECC-1 og MCF7-celler efter Arnt siRNA behandling. I overensstemmelse med vores kvantitativ PCR og Western blot data, ECC1 og MCF7-celler viste ændrede satser af proliferation efter ARNT knockdown sammenlignet med celler transficeret med scrambled negativ kontrol siRNA (figur 5A og B). Knockdown af Arnt blev overvåget i 72 timer og den betydelige knock-down observeret var i det væsentlige uændret ved hvert tidspunkt (figur 5C). Hverken cellelinje viste ændrede vækstmønstre indtil 48 timer tidspunkt. Efter 48 timer, ECC-1-celler i både siSCX og siARNT betingelser udviste beskeden proliferation som respons på E2 behandlinger. Ved 96 timers tidspunktet, var der en meget signifikant stigning i E2-inducerbar proliferation af ECC-1-celler behandlet med siARNT, sammenlignet med scrambled kontrol behandlede celler. Interessant, Arnt knockdown øget basale vækstrater og forårsagede en forværret respons på E2 med celletallet næsten en fordobling i siARNT E2 behandlinger i forhold til de siSCX E2 behandlinger. Omvendt viste MCF7-celler en nedsat proliferation sats efter ARNT knockdown (figur 5B). Vækstraterne var ikke signifikant forskellig indtil 48 h tidspunkt, hvor E2-inducerbare proliferativ respons i det uforståelige negative kontrol var tilsyneladende. De siARNT transficerede celler havde en sløvet vækstrespons under både kontrol og E2 betingelser. På 96 timer, begyndte cellerne at miste følsomhed over for E2 og indgået en aldrende tilstand. Hvorvidt dette skyldtes vækstbetingelserne er uklar. Men disse data understøtter endvidere den hypotese, at Arnt har co-repressor ejendomme i ECC-1 celler og co-aktivator ejendomme i MCF7-celler. Endvidere følsomheden over for E2 og de gensidige vækstrespons udvises af de to cellelinier er bona fide fænotypiske konsekvenser af Arnt ablation.

ECC-1 (A) og MCF7 (B) celler blev transficeret med enten siSCX eller siARNT i 6 timer, derefter trypsiniseret og podet ved 10.000 celler /brønd i 12-brønds skåle. Fireogtyve timer efter podning blev celler behandlet med enten DMSO eller E2 (10 nM) og celletal blev udført ved 0, 48 og 96 timer efter behandling med et Fuchs-Rosenthal-tællekammer. Ved 48 h tidspunkt blev celler behandlet en anden gang med 10 nM E2. Eksperimenter blev udført tre gange og hvert forsøg blev talt tre gange. (C) Western blot-analyse af Arnt efter siRNA knock-down afslører, at betydelige afledte ned blev opnået og vedvarer over en 72 timers periode. Fejl søjler repræsenterer ± standardafvigelse * P. 0,05

Diskussion

Mange miljøbelastende stoffer, der tjener som aktivatorer af aryl hydrocarbon receptor er kendt som formodede hormonforstyrrende stoffer. Udsættelse for mange af disse forbindelser opstår på daglig basis og repræsenterer betydelige risici for menneskers sundhed. Især har de repressive virkninger fremkaldt af ligander af AHR på ER-signalering er veldokumenteret [11], [19], [36], [37], [38]. Andre rapporter har beskrevet co-aktivator potentiale ARNT for ER-medieret transkription [27]. På trods af den voksende mængde af beviser til støtte roller for AHR og Arnt i ER-funktion, er lidt om den normale fysiologiske rolle af disse proteiner, som de vedrører østrogen signalering eller de molekylære determinanter for giftstof-induceret transrepression af ER funktion ved AHR. Endelig er denne undersøgelse viste, at Arnt er ikke afgørende for AHR-medieret off-target transrepression. For at afgrænse de molekylære mekanismer, der ligger AHR-medieret transrepression søgte vi at koble AHR og Arnt funktion i ER-positive humane kræftceller. Dermed opdagede vi, at ARNT svækker aktiveret ER-målgen transkription i ECC-1-celler, i direkte modsætning til dens beskrevet i MCF7-celler co-aktivator funktion [27].

ARNT blev oprindeligt identificeret som et bona fide transskription faktor [39] og dimerisering partner i AHR [40]. Ud over sin kanoniske transskription faktor funktion, kan Arnt interagere med flere andre transkriptionsfaktorer, herunder ERa [11] og dets co-aktivator-funktion for ER-signalering er blevet godt beskrevet [27], [30]. Derfor vi forventes at knockdown af Arnt i ECC-1 endometrie-cervikal cancerceller ville resultere i en formindskelse af ER målgenekspression. Den deraf følgende stigning i mRNA akkumulering, protein-ekspression og E2-inducerbare spredning tyder stærkt på, at Arnt virker som en transkriptionel co-repressor i denne cellelinie. Den molekylære mekanisme (r) bag de observerede i MCF7 og ECC-1 celler forskelle sandsynligvis er relateret til forskelle i arten og sammensætningen af ​​den accessoriske transkriptionelle maskiner rekrutteret af Arnt i hver celle linie. Arnt præsenterer flere forskellige protein-protein interaktion domæner for rekruttering af co-aktivator proteiner, herunder et carboxyterminalt transaktiveringsdomæne [18], dens PAS-B region [41] og dens grundlæggende-helix-loop-helix domænet [12] . Derudover en associering mellem Arnt og den transkriptionelle co-repressorproteinet, SMRT er blevet påvist [42]. Men vi mener, at dette er den første påvisning af, at ARNT har dobbelt co-aktivator /co-repressor funktioner i en celle-specifik måde (figur 6). Desuden kan virkningerne af disse transkriptionelle effekter iagttages ved translationelle og fænotypiske niveau.

Tilstedeværelsen af ​​E2 letter samlingen af ​​transkriptionelle modifikatorer, der inducerer transkription af E2-responsive gener. Ligand aktiveret AHR undertrykker ER-signalering uafhængig af Arnt. Tabet af Arnt i ECC-1-celler, hvor det virker som en co-repressor, fører til forøget følsomhed for E2 og øget transkriptionel aktivitet ved ER regulerede gener. Tabet af Arnt i MCF7-celler, hvor det virker som en co-aktivator, fører til nedsat følsomhed for E2 og formindsker transkriptionel aktivitet ved ER regulerede gener.

Adskillige modeller er blevet fremsat den hypotese for at forklare den molekylære mekanismer underliggende transkriptionsfaktor medieret krydstale, navnlig evne én transkriptionsfaktor at undertrykke en anden funktion [18]. Reugg og kolleger, blandt andre, har foreslået, at transkriptionsfaktoren-medieret transrepression kan være resultatet af konkurrencen for en begrænset pulje af co-aktivatorproteiner [27]. Men identifikationen af ​​Arnt som en co-repressor i ECC-1 celler afslører en mere kompleks mekanisme af transrepression på E2-inducerbare gener derefter co-aktivator konkurrence model antyder. Selv om disse data ikke endeligt modbevise denne model, mener vi, at vores data tyder på, at det er usandsynligt, fordi co-aktivator konkurrence ikke kan redegøre for TCDD-inducerbare undertrykkelse i ECC-1 celler som aktiveret AHR bør squelch Arnt co-repressor funktion. Desuden Arnt, et protein, der har vist evne til at rekruttere mange co-aktivatorer [12], [15], [17], [41], [43], [44], bør ulovlig en effekt svarende til ligand-aktiverede AHR hvis co-aktivator puljer var i en sådan begrænset udbud, at konkurrencen ville hindre individuel transskription faktor funktion. Dette er klart ikke tilfældet i ECC-1 cellelinje.

Den eksperimentelle beviser præsenteret ovenfor viser, at AHR ikke kræver Arnt at mægle sin off-target transrepressor effekter. Tab af Arnt i både MCF7 og ECC-1-celler mislykkedes at ophæve de undertrykkende effekter af TCDD på E2-inducerbar transkription og proteinekspression (figur 2 og 3). Virkningerne DiMNF-bundne AHR er uafhængige af dioxin responselement binding som kerneekstrakt fra celler behandlet med DiMNF ikke retardere bevægelsen af ​​et mærket dioxin responselement sonde i gel shift-assays [34]. Endvidere AHR-ARNT dimerisering er et krav for DNA-binding, hvilket antyder, at dette ikke kan forekomme i nærvær af DiMNF. Dette repræsenterer et paradigmeskift i vores forståelse af AHR funktion og har konsekvenser for brugen og effektiviteten af ​​selektive AHR modulatorer. Faktisk har en hidtil ukendt AHR antagonist vist sig at være en potent stimulator af AHR-afhængige stamcelle ekspansion [45]. Således kan antagonister, der ikke fremkalder AHR-ARNT dimerisering være mere effektive repressorer af ER funktion end rene agonister som AHR ikke ville blive squelched af Arnt binding. Den sarhm DiMNF er en potent AHR-afhængige repressor af cytokin signalering [33], [34]. Endvidere DiMNF var effektiv til at undertrykke ER-reguleret målgenekspression (figur 4). Molekylære modellering undersøgelser viser, at DiMNF danner en ekstra hydrogenbinding med AHR på Thr289 [34], en karakteristisk ikke deles med den partielle agonist α-naphthoflavon tyder på, at DiMNF-AHR vedtager en unik bekræftelse. Således flavonoider udgør en klasse af forbindelser, der kan være attraktive mål for yderligere test og udvikling for at bestemme deres virkninger på ER target genekspression.

Vores eksperimentelle beviser demonstrerer en TCDD-afhængig repressor funktion for AHR og en TCDD /AHR-uafhængige co-aktivator /co-repressor funktion for Arnt i østrogen signalering. Disse resultater giver os yderligere indsigt i mekanismerne i transskription faktor krydstale og formodede terapeutiske mål i østrogen-positive kræftformer. Tilsammen vore data indikerer en mere komplekst system til Arnt funktion og AHR-medieret transrepression af ER-signalering end tidligere foreslået. Den kliniske anvendelighed af disse fund er stadig at blive testet, og vil blive genstand for fremtidige undersøgelser.

Materialer og metoder

Materialer og Celledyrkning

3 ‘, 4’ dimethoxy-α-naphthoflavon (DiMNF) blev opnået kommercielt (Indofine Chemical Co., Hillsborough, NJ). ECC-1 og MCF7-celler (ATCC) blev opretholdt i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM; BioWhittaker, Lonza,) med 10% føtalt bovint serum (FBS; HyClone, Perbio, Thermo Fisher Scientific Inc.) og suppleret med 100 enheder /ml kalium penicillin-100 pg /ml streptomycin-sulfat (BioWhittaker, Lonza) ved 37 ° C, 20% O

2, og 5% CO

2. Fireogtyve timer før nogen eksperimentel forstyrrelse blev cellerne vasket 2 × med PBS, og vedligeholdes i Fenol-Rød-frie medier uden FBS [46].

Chromatin immunopræcipitationsanalyser.

chromatin immunpræcipitation (chip) blev udført som beskrevet af tidligere [17]. Kort beskrevet blev celler udpladet i 150 cm

2 retter og serumudsultede 24 timer før behandling. Behandling af celler blev udført i serumfrit medium suppleret med 3 mg /ml bovint serumalbumin i 45 minutter. Chromatin komplekser var kemisk tværbundet ved anvendelse af en 1% formaldehyd /0,7 mol /l HEPES-opløsning (slutkoncentration), pH 7,8, og komplekser blev sonikeret for at give DNA-fragmenter på 200 til 900 bp størrelsen. Komplekser blev præ-klaret med protein A agarose resin (Calbiochem) og inkuberet natten over med specifikke antistoffer [ERa kanin polyklonale eller ARNT ged polyklonale (Santa Cruz) eller AHR kanin polyklonale tidligere [47 beskrevne]. Immunoadsorbed komplekser blev indfanget på protein A agarose resin og vasket to gange med 0,5 x RIPA, efterfulgt af tre vaske med 10 mmol /l Tris-HCI (pH 8,0) og 1 mmol /l EDTA. Prøver blev elueret ud af harpiksen under anvendelse af 100 mmol /l NaHCO3 og 1% SDS, og tværbindinger blev tilbageført ved 65 ° C natten over. Prøver blev phenol-chloroform-ekstraheret og udfældet med 70% EtOH og Pellet Paint (Novagen). Immuno-adsorberet DNA blev analyseret ved PCR. Primere til

CYP1A1

forstærker og PS2 promotor er blevet beskrevet tidligere [20], [48].

transiente transfektioner

MCF7 og ECC-1-celler blev dyrket i betingelser beskrevet ovenfor, indtil ca. 70% sammenflydende før siRNA transfektion. Celler blev transficeret med enten grønt fluorescerende protein (GFP) siRNA (Dharmacon), krypteret (SCX) siRNA (DS Scrambled negativ kontrol siRNA, Integrated DNA Technologies Inc.), AHR siRNAs (Dharmacon) eller Arnt siRNA’er (Integrated DNA Technologies Inc., . Cat No. HSC.RNAI.N187426.11.1, HSC.RNAI.N178426.11.2, HSC.RNAI.N178426.11.3, siARNT 1, siARNT 2, og siARNT 3 henholdsvis). Celler blev transficeret med 10-15 nM siRNA hjælp 0,3% (v /v) Trifectin (Integrated DNA Technologies) ifølge producentens protokol. Cellerne fik lov til at inkubere i transfektionsblandingen i 6 timer ved 37 ° C, og 5% CO

2, hvorefter Transfektionsblandingen blev fjernet og erstattet med serumfrit medium.

Reverse transskription og Real- Time PCR

Revers transkription og real-time PCR blev udført som tidligere [11] beskrevne. Kort fortalt blev celler behandlet enten med DMSO (Me

2SO), TCDD (2 nM), E2 (10 nM), eller en kombination af TCDD og E2, i 24 timer.