PLoS ONE: Hypertonisk Stress Fremkalde VEGF Produktion i Human coloncancercellelinie Caco-2: Hæmmende rolle Autokrin PGE2

Abstrakte

Vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) er en vigtig regulator af angiogenese. VEGF udtryk er op reguleres som respons på mikro-miljø signaler relateret til dårlig blodforsyning såsom hypoxi. Imidlertid er reguleringen af ​​VEGF-ekspression i cancerceller ikke begrænset til stress-respons på grund af øget volumen af ​​tumormassen. Lipid mæglere især arachidonsyre-afledt prostaglandin (PG) E

2 er regulatorer af VEGF-ekspression og angiogenese i tyktarmskræft. Desuden øgede osmolaritet, der genereres under colon vandabsorption og afføring konsolidering synes at aktivere coloncancerceller og fremme PGE

2 generation. En sådan fysiologisk stimulation kan give signalering for kræft forfremmelse. Her undersøgte vi virkningen af ​​eksponering for et hypertonisk medium, at efterligne colon miljø, på VEGF-produktion af colon cancerceller. Den rolle, samtidig PGE

2 generation og MAPK aktivering blev behandlet af specifik farmakologisk hæmning. Human coloncancer cellelinie Caco-2 udsat for en hypertonisk miljø reagerede med markant VEGF og PGE

2-produktion. VEGF-produktion blev inhiberet af selektive inhibitorer af ERK 1/2 og p38 MAPK pathways. For at løse den regulerende rolle PGE

2 på VEGF-produktion, Caco-2-celler blev behandlet med CPLA

2 (ATK) og COX-2 (NS-398) inhibitorer, der fuldstændig blokerer PGE

2 generation . Caco-2-celler blev også behandlet med en ikke selektiv PGE

2-receptorantagonist. Hver behandling signifikant øget hypertoniske stress-induceret VEGF-produktion. Endvidere tilsætning af PGE

2 eller selektiv EP

2 receptoragonist til aktiverede Caco-2-celler inhiberede VEGF-produktion. Den autokrine hæmmende rolle for PGE

2 ser ud til at være selektiv for hypertonisk miljø, da VEGF produktion induceret af eksponering for CoCl

2 blev reduceret med hæmning af samtidig PGE

2 generation. Vores resultater viste, at hypertoni stimulerer VEGF produktion i tyktarmskræft cellelinjer. Også PGE

2 spiller en hæmmende effekt på VEGF produktion af Caco-2 celler udsat for hyperosmotisk stress gennem EP

2 aktivering

Henvisning:. Gentile LB, Piva B, Diaz BL (2011) Mave Stress Fremkalde VEGF Produktion i human coloncancercellelinie Caco-2: Hæmmende rolle Autokrin PGE

2. PLoS ONE 6 (9): e25193. doi: 10,1371 /journal.pone.0025193

Redaktør: Ben C. B. Ko, kinesiske University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: 17. december, 2010; Accepteret: August 30, 2011; Udgivet: 28 September, 2011

Copyright: © 2011 Gentile et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Brasilien) og Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo en Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ, Brasilien) (til BLD) og en Sundhedsministeriet (Brasilien) PhD fællesskab (til LBG). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Dannelse af nye blodkar fra allerede eksisterende kar er en central proces i udviklingen af ​​de fleste tumorer især solide dem. Denne proces kaldes angiogenese og reguleres af balancen af ​​negative og positive biokemiske signaler. De nydannede blodkar er ansvarlige for at levere ilt og næringsstoffer til den voksende tumor masse og en rute for formidling af metastatiske kræftceller. VEGF er den mest fremtrædende positiv regulator af angiogenese på grund af dens evne til at rekruttere endotelceller til hypoxiske steder og til at stimulere proliferation af denne cellulære type, fremme differentieringen af ​​karstrukturer [1]. VEGF-ekspression korrelerer positivt med negativt resultat i cancerpatienter. I tyktarmskræft, ekspression af VEGF korrelerer med forøget metastatisk potentiale [2], mens ekspression af dets receptor er en markør for kortere postoperativ overlevelse [3].

VEGF-ekspression er opreguleret som respons på mikro- miljømæssige påvirkninger i forbindelse med dårlig blodforsyning såsom hypoksi [4], acidose [5] og lave niveauer af næringsstoffer [6]. I tumorer, nedsat niveau af O

2 fører til HIF-1α stabilisering, en underenhed af den transkriptionelle faktor HIF-1, og efterfølgende transkriptionel aktivering af gener, der udgør en hypoxi-responsivt element (HRE) i deres promotorer, såsom VEGF . Imidlertid er VEGF-ekspression regulering i cancerceller ikke begrænset til stress-respons på grund af den øgede mængde af tumormassen. Flere andre faktorer har vist sig at inducere VEGF såsom reaktive ilt arter [7] – [9], vækstfaktorer [10], [11], cytokiner [12], og lipidmediatorer [13] – [16]. Arachidonsyre-afledt prostaglandin (PG) E

2 er en vigtig regulator af VEGF-ekspression og angiogenese i flere forskellige typer cancer og i coloncancer i særdeleshed. Eksogene PGE

2 inducerer HIF-1α stabilisering [13] og VEGF udtryk [17] i tyktarmskræft cellelinjer. VEGF og COX-2-ekspression og tumor angiogenese er positivt korreleret i colon cancer prøver [18] – [20]

Men hypoxi er ikke den eneste eksterne stress stimulus, der aktiverer cellulære responser i tyktarmskræft.. De kontinuerligt skiftende indhold tarmlumen eksponere normale og cancerøse epitelceller til et utal af stimuli. En sådan fysiologisk stimulation kan give signalering for kræft forfremmelse. Faktisk øget osmolaritet, der frembringes under processen med colon vandabsorption og afføring konsolidering [21] – [23] synes at aktivere coloncancerceller og fremme COX-2-ekspression og PGE

2 generation, men aktiverer ikke normal tarm celler [24]. Vores mål i denne undersøgelse var at bestemme virkningen af ​​hypertonisk stress på VEGF-produktion af Caco-2 coloncancer cellelinie. blev også analyseret potentielle rolle autokrine PGE

2 og MAPK signalveje i modulering af VEGF generation.

Metoder

Reagenser

Natriumchlorid (NaCl) blev opnået fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) og opløst i sterilt vand til en stamopløsning på 2 M koncentration. IPLA

2-hæmmer, Bromoenol lacton (BEL), Den CPLA

2 /IPLA

2-hæmmer, arachidonyl trifluormethylketon (ATK), og prostaglandin E

2 blev købt fra Cayman Chemical Co. ( Ann Arbor, MI) og fortyndet i ethanol i overensstemmelse hermed til producentens anvisninger. Inhibitorerne for COX-2, NS-398 (Cayman); p38, SB202190; JNK, SP600125; MEK1 /2, U0126 (alle fra BIOMOL, Plymouth Meeting, PA) blev fortyndet i DMSO (Sigma). Monoklonale antistoffer til immunoblot assays blev anti-COX-2 IgG mus (klon 33) fra BD Transduction Laboratories og anti-GAPDH (klon 6C5) IgG mus fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), fortyndet til 0,003 ug /ml. Ged HRP-bundet sekundært antistof-anti-muse IgG fra Santa Cruz Biotechnology blev anvendt ved 0,1 ug /ml.

Cellekultur og behandlinger

Caco-2 (ATCC HTB-37, gave Dr. José Morgado Díaz, Instituto Nacional de kræft, Brasilien) cellelinje blev opretholdt i Dulbecco Modified Eagle-medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 44 mM NaHCO

3, 1 mM NaH

2PO

4.H

2O, 1 mM natriumpyruvat, 10 mM HEPES, MEM-vitaminer opløsning, MEM væsentlige og ikke-essentielle aminosyrer opløsning, 2 mM L-glutamin, 55 uM β-mercaptoethanol, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (alle cellekulturreagenser fra Invitrogen). IEC-6 cellelinie (Rio de Janeiro Cell Bank, Brasilien) blev opretholdt i DMEM suppleret med 5% FBS og 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Celler blev holdt i dyrkningskolber (cellevækst overfladeareal 25, 75 og 150 cm

2). Cellerne blev opsamlet ved 0,25% trypsin og 0,38 g /l EDTA i HBSS uden Ca

++ og Mg

++ og 5 × 10

5 celler /brønd blev udpladet i 6-brønds fladbundede plader (areal på 9,03 cm

2 /brønd, Techno Plastic Products, Schweiz). 1,9 ml frisk DMEM dyrkningsmedium blev tilsat til dyrkningsbrønde med eller uden farmakologiske inhibitorer og celler blev inkuberet i 15 min (30 min for MAP-kinaser inhibitorer) ved 37 ° C. Alle celler modtog den samme mængde af vehikel derfor slutkoncentrationen var under 0,1% DMSO eller ethanol og ændrede ikke celleaktivering. Celler blev stimuleret ved tilsætning af 0-100 pi 2 M NaCl-opløsning. DMEM blev tilsat til brønden for at fuldføre slutvolumen på 2 ml. Endelige osmolaritet af mediet efter tilsætning af 100 mM NaCl var ca. 540 mOsm sammenlignet med 367 mOsm af isosmotisk medium. Medium osmolaritet blev bestemt empirisk ved frysning fremgangsmåde under anvendelse af et osmometer (Advanced Instruments Inc., Norwood, MA). For at minimere variationen i de kinetiske eksperimenter den samlede tid i kultur efter plating var den samme for hver tidspunkt analyseret.

Bestemmelse af PGE

2 og VEGF på supernatanter

PGE

2-produktion af Caco-2-cellelinje blev bestemt ved EIA i kultursupernatanten overensstemmelse med producentens instruktioner (Cayman) og som beskrevet før [25]. Kort fortalt blev dyrkningsmediet opsamlet 24 timer efter cellulær aktivering ved hypertonisk stress og centrifugeret ved 250 x g i 5 minutter til fjernelse flydende celler og nedfrosset ved -70 ° C. PGE

2 niveauer blev analyseret under anvendelse af et monoklonalt antistof PGE

2 EIA Kit. Efter udvikling Pladen blev aflæst ved 405 nm i en pladelæser (Spectra Max 190, Molecular Devices, Sunnyvale, CA). VEGF produktion ved Caco-2-cellelinje blev bestemt ved ELISA i kultursupernatanten overensstemmelse med producentens instruktioner (R NaCl 150 mM pH 7,4) i 12 timer for COX-2 mærkning eller til 2 h for alle andre antistoffer ved stuetemperatur. Efter vask blev membraner inkuberet med primære antistoffer fortyndet i TTBS (TBS med 0,2% Tween 20) og 0,05% natriumazid i 2 timer ved stuetemperatur for COX-2 eller 12 timer ved 4 ° C for andre antistoffer. Efter sekundær mærkning med HRP-koblede anti-IgG-antistoffer, blev proteiner analyseret under anvendelse af ECL Western Blotting Analysis System (Amersham Biosciences).

Statistisk analyse

Data er udtrykt som middelværdi ± standardfejl på mean (SEM) af forsøg udført i triplikater. Grafer og Western blots viste er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg. Multiple sammenligninger mellem grupper blev udført ved envejs ANOVA efterfulgt af Bonferronis eller Dunnetts test (Prism-version 4.03, Graphpad Software, Inc. La Jolla, CA). Symbolerne

+ og * repræsenterer

s

værdier. 0,05 i forhold til at styre ikke-stimulerede gruppe eller hypertonisk stress /CoCl

2-stimuleret gruppe henholdsvis

Resultater

Hypertonisk stress inducerer VEGF produktion ved Caco-2 og PGE

2 modulerer angiogen faktor produktion i denne miljøbelastning

Hypertonisk stress stimulerer VEGF-produktion af Caco-2 efter 24 timers aktivering ( Figur 1A) efter den samme dosis respons og tidsforløbet (data ikke vist) af PGE

2 generation under de samme stimulerende vej [24]. Som PGE

2 er blevet beskrevet at spille en rolle i angiogenese og VEGF-produktion bestemte vi, om PGE

2 blev regulering VEGF produktion ved Caco-2 under stimulering med hypertonisk medium. Hæmning af PGE

2-produktion ved behandling med CPLA

2 (ATK) (figur 1B) eller COX-2 (NS-398) (figur 1C) hæmmere forøget VEGF-produktion. Dette fænomen blev vendt ved tilsætning af PGE

2 til cellekulturmediet (figur 1D) indikerer en specifik rolle for PGE2.

(A) Caco-2-celler blev stimuleret

med 10 -100 mM NaCl i løbet af 24 timer før VEGF-produktion analyse. VEGF-produktion blev bestemt ved ELISA i supernatanter af Caco-2-celler stimuleret med hypertonisk stress (100 mM NaCl) i løbet af 24 timer efter forbehandling med inhibitorer af CPLA

2, ATK (B); COX-2, NS-398 (C) eller PGE

2 (D). HCT116-celler blev stimuleret med 100 mM NaCl i løbet af 24 timer efter forbehandlingen med inhibitorer af CPLA

2, ATK (E); COX-2, NS-398 (F). +, *

s 0,05

, til ikke-stimulerede celler eller stimulerede celler. **

s 0,05

, sammenlignet med NS-398-behandlede celler. Graph søjler viser middel ± SEM fra tredobbelte prøver.

For at kontrollere, om hæmning af VEGF produktion af Caco-2 stimuleret med hypertonisk stress var en konsekvens af PGE

2 handling og ikke en konsekvens af den nonespecific virkning af farmakologiske lægemidler, der anvendes i forsøgene, udførte vi det samme eksperiment i HCT116, en coloncancer cellelinie, der ikke udtrykker COX-2 og frembringer ingen detekterbare niveauer af PGE

2 under hypertonisk stress. Vi har ikke observere eventuelle ændringer i VEGF produktion, bortset fra muligheden for interferens af de farmakologiske hæmmere (figur 1 E og F). Disse resultater viste, at PGE

2 produceret af Caco-2 aktiveres af hypertonisk stress har en autokrin hæmmende virkning på VEGF produktion.

EP

2 receptor spiller en rolle i reguleringen af ​​VEGF produktion gennem PGE

2 i Caco-2 stimuleret med hypertonisk stress

for at afgøre, hvad der er virkningsmekanismen for PGE

2 i reguleringen af ​​VEGF produktion i hypertonisk stress, Caco-2 celler blev aktiveret med hypertonisk medium i 24 timer og behandlet med AH6809, en EP-receptorantagonist. Vi verificerede inhibering af EP-receptor signalering forårsagede en stigning af VEGF-produktion (figur 2A). Derefter, for at identificere hvilken specifik receptor er involveret i dette fænomen Caco-2 blev stimuleret med hypertonisk medium og behandlet med ATK og EP receptorer agonister. Den CPLA

2-hæmmer (ATK) fjernede indblanding af PGE

2 produceret af kolon kræftceller og EP-receptorer blev aktiveret kun ved eksogent tilføjede agonister. Følgelig figur 2B viser, at behandling med ATK øger VEGF-produktion, og når PGE

2 eller 16,16-dimetil PGE

2, en pan EP receptor agonist, blev tilsat til mediet denne virkning blev vendt, styrke, at EP receptoraktivering har en hæmmende virkning på VEGF-produktion. Stigning i VEGF-produktion ved inhibering af endogen PGE

2 blev også vendes ved butaprost, en specifik EP2-receptoragonist (figur 2B). Aktivering med EP1, 17-phenyl-Trino-PGE

2, eller EP3, sulproston, agonister havde ingen effekt på forøget VEGF-produktion. Da EP4 udtryk synes at være fraværende i Caco-2 celler [26], vores resultater viser, at endogene PGE

2 modulerer VEGF produktion fremkaldt af hypertonisk stress gennem aktivering af EP2.

(A) Caco-2 celler blev stimuleret af hypertonisk stress (100 mM NaCl) i løbet af 24 timer efter forbehandling med EP og DP-receptorer antagonist, AH 6809 (A); med inhibitor af CPLA

2, ATK (10 uM); PGE

2; EP-receptorer agonist, 16,16-dimethyl Prostaglandin E

2; EP1 og EP3 receptorerne agonist, 17-phenyl trinor Prostaglandin E

2; EP2-receptoragonist, butaprost og EP3-receptor-agonist, sulproston (B); eller med PKA-inhibitor, H-89. PGE

2 og dets analoger blev anvendt ved 0,1 uM. VEGF-produktion blev bestemt ved ELISA i supernatanter af Caco-2-celler. +, *

s 0,05

, når sammenlignet med ikke-stimulerede celler eller stimulerede celler. **

s 0,05

, sammenlignet med ATK-behandlede celler. Graph søjler viser middel ± SEM fra tredobbelte prøver.

EP2 er en rhodopsin typen receptor koblet til Gs og medierer stigninger i lejren [27]. testede vi Så hvis PKA spillet en rolle i PGE

2 effekter medieret gennem EP2 under hypertonisk stress. Inhibering af PKA ved H-89 øgede VEGF produktion ved Caco-2 celler udsat for hypertonisk medium (figur 2C). Styrkelse af potentielle hæmmende vej involverer PGE

2-EP2-cAMP-PKA.

Rolle endokrine PGE

2 på CoCl

2-induceret VEGF produktion

Vi har også konstateret, om PGE

2 havde en rolle i reguleringen af ​​VEGF produktion under en standard simulatory tilstand. For at aktivere Hypoxi-induceret faktor (HIF) vej og simulere hypoxi blev Caco-2 celler aktiveret med CoCl

2. Efter 24 timers stimulering med CoCl

2, Caco-2 præsenteret markant produktion af PGE

2 (figur 3A) og forøget ekspression af COX-2 (figur 3B). Yderligere forsøg blev udført efter tilsætning af 1 mM CoCl

2 til mediet efter 24 timers aktivering. Desuden CoCl

2-stimuleret PGE

2 generation er afhængig af COX-2 som det blev fuldstændigt inhiberet af NS-398 (figur 3C).

Caco-2-celler blev stimuleret med 0,1- 1 mM CoCl

2 under 24 timer før PGE

2 og VEGF-produktion (A og D) og COX-2-protein-ekspression (B) analyse. PGE

2 og VEGF produktion ved Caco-2-celler stimuleret med 1 mM CoCl

2 under den 24 timer efter forbehandlingen med inhibitor af COX-2, NS-398 (C og E, henholdsvis). VEGF-produktion af Caco-2-celler stimuleret med 0,1-1 mM CoCl

2 under 24 timer (D). PGE

2 og VEGF-produktion blev bestemt ved ELISA i supernatanter af Caco-2-celler. COX-2 og GAPDH-ekspression i cellepellets blev analyseret ved Western blotting. +, *

s 0,05

, når sammenlignet med ikke-stimulerede celler eller stimulerede celler. Graph søjler viser middel ± SEM fra tredobbelte prøver.

Ligesom hypertonisk stress stimulation, CoCl

2-aktiveret celle også produceret VEGF (figur 3D). Men autokrine PGE

2 synes at have en modsat effekt i denne tilstand, da NS-398 behandling hæmmede VEGF produktion (figur 3E). Disse resultater viser, at PGE

2 har en stimulerende autokrin rolle på VEGF produktion i CoCl

2 aktivering.

Rolle MAPK’er i VEGF produktion af Caco-2 celler

For at bestemme hvis produktionen VEGF differentielt blev reguleret i Caco-2-celler ud over den potentielle autokrin rolle PGE

2, vi slået til identifikation af MAPK involverede veje. Da vi har vist før en rolle for ERK 1/2, JNK og p38 i PGE

2 generation [24], og for at undgå det potentielle problem dette kan udgøre at fortolke resultaterne, blev udført eksperimenter i tilstedeværelse af en uM NS-398. Farmakologisk hæmning af ERK 1/2 og p38 veje viste en fælles rolle i aktivering af enten hypertonisk stress eller CoCl

2 (figur 4A og B). JNK rolle var mere begrænset, da SP 600.125 markant hæmmet VEGF produktion fremkaldt af CoCl

2 aktivering, mens det ikke påvirkede VEGF produktion induceret af hypertonisk stress (figur 4A og B).

inhibitorer af JNK, SP600125 ; p38, SB202190; og MEK 1/2, U0126 blev tilsat før stimulering med hypertonisk stress (100 mM NaCl) (A) eller 1 mM CoC

2 (B) i 24 timer. Caco-2-celler blev forbehandlet med 1 uM af NS-398 for at forhindre endogen PGE

2-produktion i alle prøver. VEGF-produktion blev bestemt ved ELISA i supernatanter af Caco-2-celler. +, *

s 0,05

, når sammenlignet med ikke-stimulerede celler eller stimulerede celler. Graph søjler viser middel ± SEM fra tredobbelte prøver.

Diskussion

rolle PGE

2 i udviklingen af ​​kræft er normalt beskrevet som en autokrin faktor stand til at modulere mange aspekter af kræft cellebiologi, navnlig af epitelial oprindelse [28], [29]. PGE

2 er blevet vist at forøge proliferation, metastatisk kapacitet og produktion af pro-angiogene faktorer [17], [30], [31]. Men sådanne undersøgelser mangler normalt oplysninger om de stimuli, der vil drive arachidonsyrekaskaden og i sidste ende PGE

2 generation ud induceret ekspression af COX-2. Vi har for nylig vist, at en hyperosmotisk miljø kan fremkalde COX-2-ekspression og PGE

2 generation i Caco-2 tyktarmscancerceller [24]. Vigtigst er det, kan hyperosmolaritet udløse begrænsende trin i PGE

2 generation ved at aktivere CPLA

2-α og inducere frigivelse af fri arachidonsyre. Normale intestinale epitelceller viste ingen produktion af PGE

2 under samme hyperosmotisk stimulus. Efter at have identificeret en relevant fysiologisk stimulus for colon cancerceller, undersøgte vi virkningen af ​​hypertonisk medium på produktionen af ​​de store pro-angiogen faktor, VEGF, og den potentielle autokrin indflydelse af PGE

2.

Eksponering af Caco-2 celler til hypertonisk medium ført til en betydelig produktion af VEGF. Som påvist før denne VEGF produktion fandt sted parallelt med PGE

2 generation. PGE

2 er beskrevet som en potent inducer af VEGF baseret på eksperimenter, hvor COX-2-overekspression øgede VEGF produktion ved kolon og brystcancercellelinier. Endvidere var dette VEGF-produktion inhiberet af selektive COX-2-inhibitorer. Vi søgte derfor at undersøge den autokrine indflydelse PGE

2 generation på Caco-2 celler stimuleret af hypertonisk medium. Suprisingly, inhibering af enten CPLA

2 eller COX-2, ved ATK eller NS-398 henholdsvis yderligere øget produktion af VEGF. Denne effekt kan tilskrives hæmning af PGE

2 generation som restaurering af PGE

2 niveauer ved exogen tilføjelse vendt VEGF produktion til det oprindelige niveau i ATK behandlet Caco-2 celler. HCT116 celler kan også aktiveres ved hypertonisk medium til frembringelse af VEGF. Imidlertid HCT116 celler hverken udtrykkelig COX-2 eller producere PGE

2 [31] trods cellerne aktiveres eller ej. Således den manglende effekt af ATK og NS-398 på HCT116 udelukker eventuelle off target effekter af disse inhibitorer [32].

PGE

2 virker på en gruppe G-protein-koblede receptorer ( GPCR’er). Der er fire GPCR’er reagerer på PGE

2 udpegede undertyper EP1, EP2, EP3 og EP4, der fører til særskilte signalvej og samlet biologisk virkning [27]. For at bestemme afhængigheden af ​​PGE

2 autokrine virkninger på EP-signalering, anvendte vi en ikke-specifik antagonist af alle fire EP-receptorer, AH 6809. Behandlingen med AH 6809 efterlignede virkningen af ​​inhibering af VEGF-produktion af PGE

2, hvilket indikerer, at PGE

2 signaler gennem sine plasmamembranreceptorer at nedregulere VEGF-produktion induceret af hypertonisk medium. Den særlige subtype involverede tilsyneladende EP2 som dens agonist, Butaprost, er i stand til fuldt erstatte PGE

2. På den modsatte, hverken EP1 eller EP3-agonister behandlinger præsenterede hæmmende effekt på VEGF produktion. EP2 synes at par med øgede cAMP niveauer og efterfølgende aktivering af PKA, som hæmning af PKA ved H-89 gengiver virkningerne af at hæmme PGE

2 generation eller handling. Det er vigtigt at bemærke, at forsøgene blev udført med PGE

2 og dets analoger i koncentrationer, der var kompatible med de endogent producerede niveauer. Effekter i VEGF produktion ved kolon kræftceller er blevet tilskrevet PGE

2 ved hjælp af koncentrationer på op til 100 uM [13], hvad langt overstige den mængde PGE

2 rent faktisk er behov for at aktivere sine receptorer [27], eller hvad er produceret i tumorale masse [33].

det er blevet vist aktiveringen af ​​EP2-cAMP-PKA-GSK-3 signalvejen fører til fald af beta-catenin phosphorylering, så dets translokation og aktivering af TCF /lef afhængige-transskription (for en gennemgang, se [34]) af gener involveret i kræft, såsom COX-2 og VEGF. Men i vores model for hypertonisk stress, EP2 signalvej aktivering forårsager undertrykkelse af VEGF-produktion. For bedre at forstå reguleringen af ​​denne reaktionsvej i hypertonisk stress undersøgte vi rollen af ​​GSK-3in denne aktivering med anvendelse af SB216763, en kompetitiv GSK-3 α og β inhibitor (50-5000 nM, data ikke vist). Behandlingen øgede VEGF-produktion, hvilket indikerer, at den inhiberende virkning af EP2 på angiogen faktor produktion er ikke afhængig af denne kinase. En mulighed for særskilt effekt af EP2 aktivering i hypertonisk stress er, at denne forordning sker gennem cAMP. Nogle undersøgelser har vist cAMP kan inhibere produktionen af ​​cytokiner ved at inhibere Ras-afhængige signaler ved PKA, inaktivering MEK /ERK-signalering eller ved blokering phosphorylering af p38 MAPK [35] – [37]. Som ERK /p38 MAPK pathway er involveret i vores model overtalelse VEGF produktion, kunne sådanne fund være tegn på den mekanisme, hvorved EP2 signalering blokerer VEGF produktion i hypertonisk stress.

For at afgøre, om den hæmmende rolle PGE

2 kan udvides til andre stimuli, brugte vi CoCl

2 at fremkalde stabilisering HIF-1α og efterligne svaret på hypoxi [13]. Som vist for hypertonisk stimulation, CoCl

2 induceret PGE

2 generation var afhængig af COX-2. PGE

2 generation blev også parallelt med VEGF-produktion. Induktion af VEGF produktion ved CoCl

2 er blevet vist før i humane fibroblaster [38], lungecancer cellelinje [39], retina epitel [40], gliomcellelinier [41], prostatacancer-cellelinier [42] og i astrocytter [43], men der var ingen forsøg på at undersøge potentialet produktion af PGE

2 eller dets autokrine virkninger. Inhibering af COX-2 inhiberede VEGF-produktion induceret af CoCl

2, hvilket indikerer en stimulatorisk rolle for PGE

2, og at den autokrine virkning af PGE

2 er afhængig af typen af ​​stimuli anvendes.

Hypertonisk medium inducerer aktivering af flere MAP kinaser der kan være involveret i regulering af VEGF udtryk [24]. Da disse MAP kinaser også er involveret i at stimulere CPLA

2-α-aktivitet og produktion af PGE

2, vi elimineret den hæmmende effekt af PGE

2, før du forsøger at analysere deres rolle på VEGF produktion. Caco-2-celler aktiveres af hypertonisk medium i nærvær af NS-398 viser tydeligt en markant afhængighed af p38 og i mindre grad på ERK 1/2 til frembringelse af VEGF. CoCl

2-induceret VEGF-produktion af Caco-2-celler udviste tilsvarende følsomhed profil til MAP-kinaseinhibitorer med undtagelse af en markant reduktion af JNK-inhibitor. De forskellige roller for JNK tyder på, at forskelle i hypertonisk medium og CoCl

2-induceret produktion af VEGF gå ud over følsomhed over for autocrin hæmmende effekter af PGE

2. Det er i øjeblikket under efterforskning, hvis sådanne signalering forskelle kan være ansvarlige for de forskellige virkninger af PGE

2 på hver type stimuli.

Et af kendetegnene i den nuværende model for regulering af angiogenese i tumoren masse, især i coloncancer, er regulering af endotelcellefunktion af kræftceller. Følgelig er begrænset til en autokrin stimulering af pro-angiogene faktorer produktion af tumorcellen rolle PGE

2 i angiogenese. Selvom interessant, denne model hverken omfatter de potentielle ydre stimuli involveret i COX-2-ekspression og VEGF-produktion eller situationer, hvor cellen udtrykker COX-2 og producerer PGE

2 er andet end cancercellen. For eksempel, ektopisk vækst af HCT116 og HT29 celler, som ikke udtrykker COX-2 eller producere PGE

2, er afhængig af COX-2-ekspression ved endothelceller og stromale celler [44]. COX-2-ekspression i musemodeller for familiær adenomatøs polypose,

Min

[33], [44] og APC

Δ716 [45] mus, er begrænset til stromale og interstitielle celler. Forskelle i JNK afhængighed og autokrine PGE

2 hæmmende effekt på VEGF produktion af den samme tyktarmskræft cellelinje er en klar indikation af, hvordan modellen også skal tage hensyn til, at disse celler udsættes for forskellige microenvironmental stimuli.

tak

forfatterne vil gerne takke Dr. Karen A. Bell for hendes kommentarer til manuskriptet.

Be the first to comment

Leave a Reply