PLoS ONE: Utility af en PI3K /mTOR Inhibitor (NVP-BEZ235) for kræft i skjoldbruskkirtlen Therapy

Abstrakt

Baggrund

Vi vurderede nytten af ​​den dobbelte PI3K /mTOR-hæmmer NVP-BEZ235 (BEZ235) som enkeltstof terapi og i kombination med konventionel kemoterapi for kræft i skjoldbruskkirtlen.

Metode /vigtigste resultater

Otte cellelinjer fra fire typer af kræft i skjoldbruskkirtlen (papillær, follikulært, anaplastisk, medullært ) blev undersøgt. Cytotoksiciteten af ​​BEZ235 og fem konventionelle kemoterapeutiske midler alene og i kombination blev målt under anvendelse LDH assay. Kvantitativ western blot vurderet ekspression af proteiner associeret med cellecyklus, apoptose og signalveje. Cellecyklusfordeling og apoptose blev målt ved flowcytometri. Murin flanke anaplastisk skjoldbruskkirtelkræft (ATC) blev behandlet med oral BEZ235 dagligt. Vi fandt, at BEZ235 effektivt hæmmede celleproliferation af alle cancerpatienter linjer, med ATC udviser den største følsomhed. BEZ235 konsekvent inaktiveret signalering nedstrøms mTORC1. BEZ235 generelt induceret cellecyklusstandsning ved G0 /G1-fasen, og også forårsaget apoptose i de mest følsomme cellelinier. Baseline niveauer af p-S6 ribosomale protein (Ser235 /236) og p27 korreleret med BEZ235 følsomhed. Vækst af 8505C ATC xenotransplantattumorer blev inhiberet med BEZ235 uden nogen observerede toksicitet. Kombinationsbehandling af BEZ235 og paclitaxel konsekvent demonstreret synergistiske virkninger mod ATC

in vitro

.

Konklusioner

BEZ235 som et enkelt terapeutisk stof hæmmer kræft i skjoldbruskkirtlen spredning og har synergistiske virkninger sammen med paclitaxel til behandling ATC. Disse resultater tilskynde fremtidige kliniske forsøg med BEZ235 for patienter med denne dødelige sygdom

Henvisning:. Lin SF, Huang YY, Lin JD, Chou TC, Hsueh C, Wong RJ (2012) Utility af en PI3K /mTOR Inhibitor (NVP-BEZ235) for kræft i skjoldbruskkirtlen Therapy. PLoS ONE 7 (10): e46726. doi: 10,1371 /journal.pone.0046726

Redaktør: Guillermo Velasco, Complutense University, Spanien

Modtaget: April 21, 2012; Accepteret: September 6, 2012; Udgivet: 15 oktober, 2012 |

Copyright: © Lin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Science Rådet Taiwan, Kina (NSC 98-2314-B-182A-012 -MY3) (https://web1.nsc.gov.tw/), og dels ved tilskud fra Chang Gung Memorial Hospital og Chang Gung University (CMRPG370581, CMRPG370582, CMRPG370583, CMRPG3A0161) (https://www.cgmh.org.tw/). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i skjoldbruskkirtlen er den mest almindelige endokrine malignitet, der stammer fra skjoldbruskkirtlen follikulære celler (papillære, follikulært, dårligt differentieret og anaplastisk kræft) eller parafollikulær C-celler (medullær kræft). Forekomsten af ​​kræft i skjoldbruskkirtlen er steget i de sidste 3 årtier, primært fra en stigning i påvisningen af ​​papillære kræft. I modsætning hertil var forekomsten af ​​follikulære og dårligt differentieret kræft i skjoldbruskkirtlen forbliver uændret [1], [2]. De fleste patienter med veldifferentieret kræft, herunder papillær (PTC) og follikulært (FTC) kræft i skjoldbruskkirtlen har en gunstig prognose. Alligevel omkring 5% patienter udvikler radioaktivt jod ildfaste tumorer og normalt forårsage dødsfald inden for 5 år [3]. Anaplastisk kræft i skjoldbruskkirtlen (ATC) er en sjælden, meget aggressiv, og ofte dødelig sygdom, med en median overlevelse på kun 6 måneder. Medullær thyreoideacancer (MTC) tegner sig for 3-5% af skjoldbruskkirtlen malignitet. Hyppigheden af ​​regionale og fjern metastatisk sygdom i MTC mindsker overlevelsesprocenten [4], [5]. Der er behov for nye behandlinger af refraktær og aggressiv kræft i skjoldbruskkirtlen at forbedre øjeblikket dårlige resultater for disse patienter.

PI3K /mTOR pathway er vigtig for cellens stofskifte, overlevelse og spredning. Klasse I

A PI3K’er er heterodimerer indeholdende en p85 lovgivningsmæssige og en p110-katalytisk underenheder, der phosphorylerer phosphatidylinositol-4,5-biphosphat (PIP

2), hvilket giver phosphatidylinositol-3,4,5-trifosfat (PIP

3). PIP

3 kombinerer med phosphoinositid-afhængig proteinkinase 1 (PDK1) at phosphorylere AKT på Thr308. Desuden er phosphoryleringen af ​​AKT ved Ser 473 af mTORC2 kræves til fuld aktivitet for AKT. Aktivering af AKT phosphorylerer mTORC1, som efterfølgende phosphorylerer S6 kinase1 og 4E-BP1, hvilket fører til G1 /S cellecyklusprogression og inhibering af apoptose. PTEN er en tumorsuppressor, som dephosphorylerer PIP

3 og inaktiverer denne vej [6], [7]. Ændringer i denne signalvej forekommer hyppigt i maligniteter og er potentielle mål for cancerterapi [6] – [8].

I kræft i skjoldbruskkirtlen, genetiske ændringer, der påvirker PI3K /mTOR pathway er blevet identificeret.

PIK3CA

(kodning p110α af klasse I

A PI3K) kopi nummer gevinst korrelerer med øget

PIK3CA

proteinekspression.

PIK3CA

kopi nummer gevinst forekommer hyppigere end genetiske mutationer af

PIK3CA

eller

PTEN

i kræft i skjoldbruskkirtlen [9] – [14]. Mere

PIK3CA /Akt1

mutationer og

PIK3CA

kopi gevinst er identificeret i ATC i forhold til godt differentieret kræft, tyder på, at PI3K /mTOR pathway aktivitet er involveret i processen med kræft de-differentiering [ ,,,0],3], [11], [12]. For MTC,

RET

proto-onkogen mutationer forekommer i næsten alle velkendte tilfælde (25% af MTC) og omkring halvdelen af ​​sporadisk MTC. Denne gevinst af funktion omlægning forbedrer PI3K /mTOR signalering transduktion [15], [16]. I sporadisk MTC uden

RET

mutationer, over 50% af tumorprøver viser aktivering af AKT eller mTOR ved immunhistokemi [16].

BEZ235 er en dobbelt PI3K /mTOR-hæmmer, der reducerer PI3K og mTOR kinaseaktivitet ved kompetitiv binding til ATP-bindende kløft af disse enzymer [17]. BEZ235 kan behandle kræft gennem induktion af G0 /G1 cellecyklusstop og apoptose, og har for nylig indgået kliniske fase II-undersøgelser [17] – [22]. Denne undersøgelse blev udført for at evaluere effekten af ​​BEZ235 i behandling af kræft i skjoldbruskkirtlen fra fire store patologiske typer, herunder PTC, FTC, ATC og MTC. Vi har også undersøgt kombinationseffekter af BEZ235 og i øjeblikket er ansat kemoterapeutika mod fire ATC-cellelinjer.

Resultater

cytotoksicitet BEZ235

BEZ235 hæmmede celle proliferation i alle kræft i skjoldbruskkirtlen linjer i en dosis og tidsafhængig måde (figur 1A). En lav dosis af BEZ235 på 6,25 nmol /l hindres mindst 30% af cellevækst i 6 af 8 cellelinier på dag 4. BEZ235 ved 100 nmol /l standset mere end 80% cellevækst i ATC linjer, 78% i medullært ( TT) og mere end 74% i godt differentierede kræft i skjoldbruskkirtlen linjer. Dm af BEZ235 på dag 4 blev beregnet for hver cellelinje (figur 1B). De 4 ATC linjer var de mest følsomme over BEZ235 (Dm, KAT4C = 3,9, KAT18 = 6,6, 8305C = 6,7, 8505C = 9,3 nmol /l), efterfulgt af den follikulære udifferentierede cancer FRO81-2 (Dm, 10,6 nmol /l) . Medullære thyroid cancer (TT), den veldifferentieret papillære (BHP7-13), og den follikulære (WRO82-1) kræft var mindre følsomme (Dm 17,1, 17,2, og 43,1 nmol /l, henholdsvis).

a, dosis-respons-kurver dagligt fra celler behandlet med en række seks 1:01 fortyndinger af BEZ235. B blev Dm af BEZ235 på dag 4 beregnet ved anvendelse CompuSyn software for hver cellelinie. ATC-cellelinjer (KAT4C, KAT18, 8305C og 8505C) havde den laveste Dm og dermed mest følsomme, følg med follikulært udifferentieret kræft i skjoldbruskkirtlen (FRO81-2), medullært (TT) og veldifferentieret papillære (BHP7-13) og follikulært ( WRO82-1) kræft.

Modulation af signalveje ved BEZ235

virkningerne af BEZ235 på signalveje blev undersøgt i 8505C, TT og BHP7-13 cellelinjer (figur 2, Figur S1). p-4E-BP1 (Thr70), p-4E-BP1 (Thr37 /46) og p-S6 ribosomale protein (Ser235 /236) blev alle konsekvent undertrykt af BEZ235 inden for 2 timer og hæmning effekten var betydelig og holdbar, med mindre end 12% af detekteret efter 24 timer protein. p-ERK1 /2 (Thr 202 /Tyr204) blev aktiveret ved BEZ235 2,6 til 8.6 gange stigning på 2 til 8 timer i tre cellelinier. Men BEZ235 havde heterogene effekter på p-AKT (Thr308) og p-AKT (Ser473), som kunne hæmmes i en periode i TT og BHP7-13, men blev konstant steget i 8505C. Som i 8505C celler, i KAT4C celler BEZ235 ligeledes inhiberet p-S6 ribosomal protein (Ser235 /236), men aktiverede p-AKT (Thr308), p-AKT (Ser473) og p-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204), ( Figur S1 og S2A). Den immunoblot blev kvantificeret og statistiske analyser blev udført for p-4E-BP1 (Thr37 /46) i BHP7-13 og p-S6 ribosomale protein (Ser235 /236) i 8505C og BHP7-13. BEZ235 inhiberede dybt disse proteiner ved 2 til 4 timer, og denne virkning var holdbart i 24 timer (Figur S1). p-4E-BP1 (Thr37 /46) blev undertrykt til mindre end 12% fra 2 til 24 timer og opnåede statistisk signifikans sammenlignet med basisniveauet i BHP7-13 (P 0,02, t-test). Tilsvarende p-S6 ribosomale protein (Ser235 /236) blev signifikant nedsat til mindre end 7% og 13% fra 4 til 24 timer i 8505C (P 0,01, t-test) og BHP7-13 (P 0,02, t- test), hhv. Disse resultater antyder, at BEZ235 har en stærk evne til at inhibere mTORC1 (der fører til fald i p-4E-BP1 og p-S6 ribosomalt protein) og svagere virkninger på mTORC2 (der fører til forskellige virkninger på p-AKT ved Ser473).

p-AKT (Thr308) og p-AKT (Ser473) blev forøget i 8505C i mere end 24 timer. p-AKT (Thr308) og p-AKT (Ser473) blev reduceret forbigående i TT og BHP7-13. p-4E-BP1 (Thr70), p-4E-BP1 (Thr37 /46) og p-S6 ribosomal protein (Ser235 /236) blev konsekvent reduceret fra 2 timer gennem over 24 timer i tre cellelinier. BEZ235 forårsagede en hurtig stigning af p-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204) ved 2 til 4 timer i tre cellelinier.

Effekter af BEZ235 på cellecyklus og apoptose

KAT4C , 8505C, TT, BHP7-13 og WRO82-1 blev udsat for BEZ235 i 24 eller 72 timer (figur 3A). Sammenlignet med ubehandlede kontrolceller, BEZ235 på 6,25, 25 og 100 nmol /l inducerede stigende cellefraktioner ved G0 /G1phase i alle cellelinjer. En repræsentativ cellelinie BHP7-13 demonstrerede virkningen af ​​BEZ235 på cellecyklusfordeling (figur 3B).

A, analyse af cellecyklus ved målinger af DNA-indhold viste stigende doser af BEZ235 akkumuleres celler ved G0 /G1 ved 24 timer (KAT4C, 8505C, BHP7-13 og WRO82-1) og 72 timer (TT). B, en repræsentativ cellelinie, BHP7-13 demonstrerede cellecyklusstop ved G0 /G1-fasen. C, cellecyklus regulering proteiner blev evalueret under anvendelse immunoblot i celler behandlet med BEZ235 ved 100 nmol /l. p53 blev reduceret med 2 til 4 timer i 8505C og TT. BEZ235 gradvist reduceret p21 i TT og BHP7-13. p27 blev øget i alle cellelinjer. Cyclin D1 faldt gradvist i 8505C og BHP7-13. D, apoptose målt ved flowcytometri til måling af sub-G1 celler afslørede, at BEZ235 øger andele af sub-G1 celler i KAT4C og KAT18 efter 96 timer. E, immunoblot viste BEZ235 induceret nedbrydning af bøddel caspase-3 i KAT4C og KAT18.

Virkningerne af BEZ235 (100 nmol /L) på ekspressionen af ​​G0 /G1 relateret cellecyklusproteiner blev undersøgt ( Figur 3C, fig S2B og S3). Overgangen af ​​G0 /G1 til S-fasen er en kompleks proces, der involverer cykliner, cyclinafhængige kinaser (CDK’er) og associerede proteiner, herunder p53, p21, p27 og cyclin D1 [31]. p53 er en tumorsuppressor, som kan aktivere p21, og begge p21 og p27 er inhibitorer af G1 cyclin-afhængige kinaser.

BEZ235 forøget p27 med 4 til 24 timer i alle cellelinjer, med maksimale stigninger på 3,5 til 723,2 – fold i KAT4C, TT og BHP7-13. En sådan et forhold mellem stigningen var ikke målbar i 8505C grund målbart signal i ubehandlede celler. Statistisk analyse blev udført for p27 ekspression i TT, og opnået signifikans ved 8 timer sammenlignet med basal ekspression (P = 0,019, t-test) (figur S3C). Disse data er i overensstemmelse med vores fund af G0 /G1 cellecyklusstop. BEZ235 havde varieret virkninger på ekspressionen af ​​p53, p21 og cyclin D1 i 4 cellelinier, hvilket viser, at der kan være forskellige bidrag af disse proteiner på at påvirke cellecyklusprogression. En konsekvent stigning i p27 i BEZ235 behandlede celler sandsynligvis udøvede hæmmende virkning på cellecyklusprogression ved G0 /G1. Det er muligt, at G0 /G1-cellecyklusstandsnings er resultatet af en kombineret virkning af mere end én G0 /G1 relateret protein påvirkes af BEZ235. Alternativt kan induktionen af ​​p27 alene være nok til at standse cellecyklusfremadskriden. I en p53 negativ PC3M cellelinie, BEZ235 induceret p27-ekspression og fuldstændig standsning af cellecyklus ved G1-fasen, uden at inducere p21 [17]. Denne undersøgelse viste G1 cellecyklus hæmning induceret af BEZ235 betyder ikke nødvendigvis association med p53 og p21.

Inhiberingen af ​​PI3K /mTOR pathway kan også føre til apoptose [6], [8]. Evne BEZ235 at forårsage apoptotisk celledød i skjoldbruskkirtlen cancerceller blev undersøgt (figur 3D). Sammenlignet med kontrol, BEZ235 ved 25 og 100 nmol /l signifikant induceret apoptose som målt ved andelen af ​​sub-G1 celler ved 96 timer i KAT4C. Lignende resultater blev observeret i KAT18, med BEZ235 på 6,25, 25 og 100 nmol /l køre en stigende andel af apoptotiske celler. Men BEZ235 undladt at enhver forhøjelse af sub-G1 celler i 8505C, TT, BHP7-13, og WRO82-1.

For at validere induktion af apoptose i KAT4C og KAT18 af BEZ235, caspase-3 var vurderet ved immunoblot efter 72 timers behandling (figur 3E, fig S4). Generelt højere doser af BEZ235 inducerede mere nedbrydning af apoptotisk bøddel caspase-3, med mindre end 12% af caspase-3 detekteret ved 100 nmol /l i begge cellelinier. Disse data tyder på, at apoptotiske mekanismer redegøre for cytotoksicitet BEZ235 i KAT4C og KAT18. Disse resultater er i overensstemmelse med tidligere rapporter om BEZ235 forårsager apoptose i nogle, men ikke alle, cellelinjer [17] – [22] .De underliggende mekanismer i de forskellige evner BEZ235 at inducere apoptose i forskellige doser og i forskellige cellelinier fortsat uklare [6] – [8].

BEZ235 følsomhed korrelerer med baseline udtryk for p-S6 ribosomale protein (Ser235 /236) og p27

Dm af BEZ235 spænder et bredt spektrum tværs 8 forskellige cellelinjer, med en 11-fold forskel mellem KAT4C og WRO82-1.To udforske potentielle biomarkører, der korrelerer med følsomhed BEZ235, baseline ekspression af proteiner involveret i PI3K /mTOR og RAS /RAF /ERK veje, og celle cycle- associerede proteiner blev evalueret i 6 cellelinier (figur 4A). Følsomheden af ​​de seks cellelinjer til BEZ235 blev beordret i henhold til Dm værdi.

A, de grundlæggende niveauer af proteiner forbundet med signalmolekyler transduktion og cellecyklus blev evalueret ved immunoblot. Sekvensen af ​​proteiner lastet var ifølge Dm. Udtrykket af p-S6 ribosomale protein (Ser235 /236) gradvist faldet fra KAT4C til BHP7-13, mens p-27 viste det modsatte rækkefølge. Ekspressionen af ​​de andre proteiner viste en tilfældig fordeling. B, Band tætheder blev afbildet og kvantificeret. Forholdet mellem Dm og proteinekspression blev analyseret ved hjælp af Pearsons korrelationskoefficienter, og grafer blev trukket ved hjælp KAT4C. Udtrykket af p-S6 ribosomale protein (Ser235 /236) havde en positiv sammenhæng, og p27 en omvendt korrelation, med følsomhed over for BEZ235.

udtryk for p-S6 ribosomale protein (Ser235 /236 ) falder gradvist over stigende Dm, mens niveauet af p-27 gradvist tværs stigende Dm. Statistiske relationer blev analyseret ved anvendelse Pearsons korrelationskoefficient (figur 4B). Udtrykket af p-S6 ribosomale protein (Ser235 /236) havde en signifikant sammenhæng (R

2 = 0,8475, P = 0,009) med BEZ235 følsomhed, mens p27 havde en signifikant omvendt korrelation (R

2 = 0,8117, P = 0,014). En gentagen immunoblot af p27 viste konsistente resultater (bilag S1). Ekspressionen af ​​baseline p-AKT (Thr308), p-AKT (Ser473), p-4E-BP1 (Thr70), p-4E-BP1 (Thr37 /46), p-S6 ribosomal protein (Ser240 /244), s -ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204), p53, p21 og cyklin D1 undlod at afsløre eventuelle korrelationer med BEZ235 følsomhed (data ikke vist).

BEZ235 terapi af murine flanke tumorer

athymiske nøgne mus med flanke implanteret af 8505C blev brugt til at undersøge de terapeutiske virkninger og sikkerhed for BEZ235

in vivo

. Dyr med etablerede flank tumorer af lignende udgangsmaterialer volumener blev behandlet med oral BEZ235 (50 mg /kg) eller vehikel dagligt i 25 dage og fulgt indtil dag 31 (figur 5A). BEZ235 retarderet tumorvækst og forskellen i tumor volumen mellem BEZ235 og kontrol mus var statistisk signifikant på dag 21 (94,1 ± 26,4 mm

3 og 335,1 ± 78,5 mm

3, P = 0,009, t-test) og dag 24 (109,9 ± 29,6 mm

3 og 403,1 ± 112,8 mm

3, P = 0,019, t-test). Forskellen på tumorvolumener mistet betydning på dag 28, 4 dage efter behandlingen var blevet afbrudt (402.7 ± 123,6 mm

3 og 750,3 ± 198,3 mm

3, P = 0,15, t-test). Repræsentative mus blev fotograferet på den sidste dag af behandlingen (figur 5B).

A, daglig oral sondefodring af BEZ235 (50 mg /kg) undertrykker 8505C tumorvækst. Forskellene i tumor volumen mellem BEZ235 og kontrolgruppen opnåede statistisk signifikans på dagen 21 og 24. Betydning blev tabt på dag 28, 4 dage efter behandlingen var blevet afbrudt. B, repræsentative mus med 8505C xenotransplantattumorer (pile) blev fotograferet på sidste behandlingsdag (dag 24). C, BEZ235 resulterede ikke i nogen vægttab, i behandlede og kontrol mus (P 0,05 for begge sammenligning). D, BEZ235 undertrykker p-AKT (Thr308) og p-S6 ribosomal protein (Ser235 /236) med 2 timer og caspase-3 ved 4 timer in vivo. PCNA var lidt reduceret ved tidlige periode. E, ekspression af p-S6 ribosomal protein i tumorceller detekteres ved immunfarvning ved de angivne perioder (forstørrelse, × 200). Disse resultater var i overensstemmelse med Western blot resultater.

BEZ235 ikke signifikant reducere kropsvægten mellem de to grupper i løbet af undersøgelsen periode (figur 5C). Oral BEZ235 reducerede phosphorylering af AKT og S6 ribosomale protein med 2 timer og opnåede sine største hæmmende effekt på 4 timer med kun 2% og 10% af Pakt og PS6 resterende henholdsvis. Denne inhiberende virkning varede i 24 timer i xenotransplantattumorer (figur 5D, fig S5). PCNA var lidt og transient undertrykt fra 2 til 4 timer. Imidlertid signifikant nedbrydning af caspase-3 forekom med 4 timer, med kun 4% af caspase-3 resterende ved 24 timer. Immunhistokemi af p-S6 ribosomal protein (Ser235 /236) i tumorer behandlet med BEZ235 ligeledes påvist en reduktion i farvning, mest markant fra 2 til 6 timer (figur 5E).

Interaktion af BEZ235 og kemoterapi i ATC-celler

Vi undersøgte kombinationen af ​​kemoterapeutiske midler og BEZ235 mod ATC. Fem kemoterapeutiske midler (paclitaxel, irinotecan, etoposid, 5-FU og doxorubicin) viste cytotoksiske virkninger på en dosis- og tidsafhængig måde i fire ATC cellelinjer (fig S6). Dataene blev anvendt til at beregne medianen effekt dosis (Dm) på dag 4 ved anvendelse CompuSyn software (figur 6A).

A, Dm blev beregnet ved anvendelse cytotoksicitetsdata vha CompuSyn software for hvert lægemiddel på hver cellelinje på dag 4. B, de cytotoksiske virkninger af BEZ235 og kemoterapeutiske midler (paclitaxel, irinotecan og etoposid) alene eller i kombination efter en 4-dages behandling i ATC blev vurderet ved anvendelse LDH assays. Kombinationen af ​​BEZ235 og paclitaxel viste synergistiske virkninger i alle cellelinjer. Kombinationen af ​​BEZ235 og irinotecan havde forbedret cytotoksiske virkninger ved højere doser, men afslørede begrænsede eller ingen gavnlige terapeutiske virkninger ved lavere doser. Kombinationen af ​​BEZ235 plus etoposid viste lidt ekstra cytotoksicitet. C, CI af BEZ235 og hver kemoterapeutiske middel blev beregnet ved hjælp CompuSyn software. BEZ235 plus paclitaxel udstillet synergistiske virkninger i alle cellelinjer, med CI 0,8 på de fleste forhold. BEZ235 plus irinotecan havde synergistisk til antagonistiske virkninger i 8305C, 8505C og KAT18, og antagonistiske virkninger i KAT4C. BEZ235 plus etoposid demonstreret meste antagonistiske virkninger i alle cellelinjer. De vandrette stiplede linier på CI = 1 blev trukket for diskrimination af synergisme (CI 1) og antagonisme (CI 1). D, de typiske intervaller af DRI-værdier for kemoterapeutika i kombination med BEZ235. Med tilstedeværelsen af ​​BEZ235, paclitaxel havde hovedsagelig de største Dris i 8505C, KAT4C og KAT18, og viste også gunstige Dris i 8305C.

Disse Dm af paclitaxel, irinotecan og etoposid er opnåelige i patienternes serum og har klinisk relevant [32] – [34]. Selvom doxorubicin anvendes klinisk til anaplastisk thyreoideacancer, den relativt høje Dm i disse cellelinjer antydede, at klinisk relevant dosering er ikke opnåeligt hos patienter serum og blev derfor udelukket fra disse studier. Interaktioner mellem BEZ235 og paclitaxel, irinotecan, og etoposid blev evalueret (figur 6B). Kombinationen af ​​BEZ235 og paclitaxel signifikant forbedret cytotoksicitet forhold enkeltstof behandling i fire cellelinjer. BEZ235 kombineret med irinotecan også forbedrede terapeutiske virkning, især når flere celler blev berørt. BEZ235 plus etoposid kun let øget cytotoksicitet.

Interaktioner mellem BEZ235 og hver kemoterapeutiske middel blev bestemt ved at beregne CI af Chou-Talalay ligning (figur 6C). Synergistiske virkninger blev identificeret for kombinationen af ​​BEZ235 og paclitaxel i alle ATC linier (Cl, 8305C = 0,77-0,86, 8505C = 0,43-0,59, KAT4C = 0,66-0,81 og KAT18 = 0,64-0,71).

kombination af BEZ235 med irinotecan varierede fra synergistisk til antagonist i 8305C, 8505C og KAT18 (CI, 0,86-1,34, 0,97-1,23 og 0,74-1,14) og var antagonisten i KAT4C (CI, 1,09-1,36). Kombinationen af ​​BEZ235 med etoposid var lidt synergistisk til antagonist i 8305C (CI, 0,95-1,15) og antagonist i 8505C, KAT4C og KAT18 (CI, 1,16-1,17, 1,13-2,05 og 1,05-1,19, henholdsvis).

Disse resultater viser, at BEZ235 og paclitaxel havde de bedste kombinerede virkninger ved behandling ATC. Den beregnede DRI af kemoterapien middel betyder folden af ​​dosis lægemiddel, som kan reduceres ved tilstedeværelse af BEZ235 (figur 6D). Blandt tre kemoterapeutiske stoffer, paclitaxel havde de største Dris i 8505C (2.55-4.2), KAT4C (2,25-3,19) og KAT18 (2,59-2,63), og viste også gunstige Dris i 8305C (1,55-2,16).

Discussion

BEZ235 effektivt hæmmede proliferation i otte kræft i skjoldbruskkirtlen linjer stammer fra fire store histologiske typer. ATC var de mest følsomme, efterfulgt af follikulært udifferentieret, medullær og godt differentierede skjoldbruskkirtlen cancercellelinjer. Kræftceller huser en PI3K gain-of-funktion mutation eller en

PTEN

sletning demonstrere højere PI3K /mTOR pathway aktivitet og større følsomhed over for BEZ235 [22]. Vores data tyder på, at ATC er afhængig af PI3K /mTOR aktivitet, og afbrydelse af denne vej med BEZ235 forringer ATC vækst mere markant end andre skjoldbruskkirtlen kræft histologier. De relativt lave median effekt dosis af BEZ235 i alle de kræft i skjoldbruskkirtlen linjer ( 44 nmol /L) antyder, at BEZ235 kan have nytte til behandling af en spektrum af skjoldbruskkirtlen malignitet. Ildfaste cancere, der udvikler aktivering af PI3K /mTOR signalering i færd med tumor de-differentiering kan være særligt attraktive mål for terapi.

Den manglende BEZ235 at undertrykke p-AKT (Ser473) i 8505C og KAT4C kan være relateret til en negativ feedback-inhibering. Det er tidligere blevet vist, at inhibering af mTORC1 fører til inaktivering af S6 kinase 1, der kan efterfølgende overvælder den inhiberende virkning af BEZ235 på mTORC2, aktiverer mTORC2, og forøger p-AKT (Ser473) i 8505C [35]. Tidligere rapporter viste også, at lavere doser af BEZ235 undlader at hæmme p-AKT (Ser473) i nogle cellelinjer, og højere doser af BEZ235 kan overvinde den negative feedback af mTORC1 /S6 kinase 1 feedback-sløjfe [18], [20]. Selvom p-AKT (Ser473) blev aktiveret i 8505C og KAT4C, BEZ235 havde bedre hæmmende virkninger i disse cellelinjer i forhold til TT og BHP7-13, tyder på, at andre molekyler, der berøres af BEZ235 spille en vigtigere rolle i fastsættelsen terapeutisk resultat.

Vi fandt, at ekspressionen af ​​p-S6 ribosomal protein (Ser235 /236) og p27 korrelerer med følsomheden af ​​BEZ235 i kræft i skjoldbruskkirtlen. S6 ribosomal protein er et nedstrøms for S6 kinase 1, som aktiveres ved mTORC1 [6] – [8]. Phosphorylering af S6 ribosomal protein øger translationel kontrol af proteinsyntese og forøger cellevækst. Celler med højere niveauer af p-S6 ribosomal protein (Ser235 /236) er mere modtagelige for BEZ235, hvilket antyder, at inhiberingen af ​​mTORC1 og S6 ribosomal protein er den vigtigste terapeutiske virkning af BEZ235.

p-S6 ribosomal protein (Ser235 /236) er også for nylig blevet anerkendt som en markør til at forudsige terapeutisk effekt af et mTOR-hæmmer i sarkom [36]. I denne undersøgelse, thyroidcancer linjer med højere udtryk for p-S6 ribosomal protein (Ser235 /236) viste også lavere niveauer af p27. Dette fund tyder S6 ribosomalt protein er en suppressor af p27 i kræft i skjoldbruskkirtlen, og kan forklare, hvorfor både p-S6 ribosomale protein (Ser235 /236) og p27 var prædiktorer for følsomhed over for BEZ235. Interessant p27 var tidligere bemærket at have en omvendt sammenhæng med aktiviteten af ​​PI3K /mTOR pathway i skjoldbruskkirtlen cancerceller, og undertrykkelse af denne vej forøger p27 [37].

4E-BP1 er andet protein nedstrøms for mTORC1. Hæmning af mTORC1 fører til dephosphorylering (aktivering) af 4E-BP1, øge bindingen af ​​4E-BP1to eIF4E, og blokere protein oversættelse og celledeling [7], [8]. Selvom BEZ235 påvirker både S6 ribosomalt protein og 4E-BP1 effektivt, kun p-S6 ribosomal protein (Ser235 /236) ekspression forudsiger for følsomhed for BEZ235 i denne undersøgelse. I kræft i æggestokkene, blev rapporteret biomarkører forudsige modtagelighed BEZ235 [22], og udtryk for p-4E-BP1 (Thr37 /46) gjorde korrelerer med følsomhed BEZ235.

Ud over at hæmme cellecyklusprogression , BEZ235 forårsagede apoptose i to af seks cellelinier. Inhiberingen af ​​cellecyklusprogression er en kendt virkning af BEZ235, selv ved lavere doser (≤100 nmol /L). Imidlertid synes apoptose i kun nogle cancercellelinier og er mere tydelig ved højere doser (100-1000 nmol /l) BEZ235 [17] – [22]. BEZ235 effektivt hæmmede mTORC1, et molekyle styring af både cellecyklus og apoptose, der kan føre til cellecyklusstop og apoptose i KAT4C og KAT18 [7]. Forståelse af de mekanismer, hvorigennem BEZ235 bidrager til apoptotisk celledød vil kræve yderligere undersøgelse.

ATC er langt den mest aggressive af de fire store histologiske typer af kræft i skjoldbruskkirtlen. Kemoterapi er blevet anvendt til at behandle patienter med ATC med responsrater omkring 20 til 50%. Hidtil ukendte strategier til forbedring er behov resultater. Blandt tre kombination terapi regimer, BEZ235 kombineret med paclitaxel havde den bedste synergistisk virkning i fire ATC cellelinier. Kræftceller med aktivering af PI3K /mTOR signalering er mere modstandsdygtige over for paclitaxel, og samtidig administration af PI3K /mTOR-hæmmere med paclitaxel forbedrer terapeutiske virkninger [38] – [40]. Dette fund er af klinisk relevans, da paclitaxel, et mikrotubuli stabilisator, har vist sig at opnå en 53% responsrate hos patienter med ATC i et klinisk fase II forsøg [41]. Kombinationen af ​​BEZ235 med en mikrotubulus depolymeriserende lægemiddel vincristin afslørede også lovende effekt i behandlingen af ​​sarkom [20]. Vores data viste, at de multikombinerbare virkninger af BEZ235 med inhibitorer af DNA-topoisomerase I (irinotecan) eller type II (etoposid) ved behandling ATC var stort set antagonistiske. Lignende antagonistiske virkninger af hæmning både topoisomerase aktivitet og PI3K /AKT-vejen er blevet observeret i æggestokkene cancerceller [42]. Celler i S-fase er mere modtagelige for topoisomearse inhibitorer. BEZ235-induceret akkumulering af celler ved G0 /G1 fase kan derfor reducere den terapeutiske fordel af samtidig behandling med topoisomeraseinhibitorer, forklarer de ugunstige kombinationseffekter af BEZ235 med irinotecan og etoposid.

Daglig behandling af BEZ235 signifikant retarderet 8505C xenograft tumorvækst i den terapeutiske periode. Den inhiberende virkning var mindre fremtrædende efter seponering af behandlingen, hvilket tyder på, at langvarig behandling kan være nødvendig for at opretholde terapeutisk virkning. BEZ235 væsentligt forringet caspase-3 i 8505C xenotransplantattumorer, indikerer dette stof kan inducere apoptose

in vivo

. Efter seponering af BEZ235, mængden af ​​8505C xenotransplantattumorer efterfølgende steget. Denne udvidelse af tumor efter ophør af behandlingen kan skyldes normalisering af cellestørrelse og genoptagelse af celleproliferation, som mTOR og dens downstream proteiner S6 kinase 1 og 4E-BP1 spiller afgørende roller i denne henseende [43]. Ingen signifikant vægttab eller sygdom blev observeret i forsøgsperioden, hvilket tyder på, at denne behandling kan have en lovende sikkerhedsprofil.

En tidligere rapport vist, at tilstedeværelsen af ​​genetiske ændringer af

PTEN

,

PIK3CA

Akt1

korrelerede godt med følsomhed over for en AKT-inhibitor, men havde svagere korrelationer med et mTOR-hæmmer [44]. Denne discrepency tyder på, at mTOR aktivitet ikke udelukkende afhænger af PI3K /AKT-aktivitet. De rapporterede data for genetiske ændringer i 8 skjoldbruskkirtlen kræft cellelinjer blev opsummeret (bilag S2). Begrænset genetiske ændringer på RAS /RAF /ERK og PI3K /mTOR veje blev identificeret. De tilgængelige data viser ikke nogen sammenhæng mellem genetiske afvigelser af PI3K /mTOR veje og følsomhed BEZ235, som ingen mutation af denne vej i disse cellelinjer rapporteret. Mutationer af p53 og BRAF synes også at ikke være korreleret med følsomhed BEZ235, fordi både følsom (8305C), og mindre følsomme (WRO82-1) cellelinjer havnen mutationerne. Udforskning af genetiske ændringer af mTOR, de store mål for BEZ235, måske en dag give oplysninger, der kan forudsige terapeutisk effekt.

Hæmning af mTORC1 kan aktivere MAPK vej gennem en PI3K-afhængig feedback-sløjfe [45], hvilket forklarer hvorfor BEZ235 blev set her for at aktivere ERK1 /2 i skjoldbruskkirtlen kræftceller. Kombinere BEZ235 med en inhibitor målretning MAPK-vejen kan være en potentiel metode til at fremme terapeutisk virkning. For nylig blev en kombination af en pan-RAF-inhibitor og BEZ235 vist at inducere standsning af cellecyklus ved G0 /G1-fasen, og havde gavnlige kombination virkninger ved behandling kræft i skjoldbruskkirtlen [46]. Snit blev modfarvet med hæmatoxylin.