PLoS ONE: Ophævelse af TNF Produktion under Cancer Immunterapi er afgørende for at undertrykke Side Effects På grund af den systemiske Expression af IL-12

Abstrakt

For mere end et årti, cytokin interleukin-12 (IL-12) er blevet udnyttet, enten alene eller i kombination med andre lægemidler, som en behandling for kræft. De mange anti-tumor egenskaber af IL-12 stadig skabe interesse for den kliniske anvendelse af dette cytokin, selv om det har vist toksicitet ved indgivelse systemisk. Som en fremgangsmåde for at eliminere denne toksicitet, har talrige laboratorier forsøgt at inducere IL-12-ekspression ved stedet for tumoren. Men for tumorer, som er svære at fjerne eller til behandling af disseminerede metastaser, systemisk ekspression af dette cytokin stadig som den mest effektive indgivelsesmåde. Alligevel finde alternative metoder til anvendelse af IL-12 til behandling af cancer og optrævling grundlag af IL-12-bivirkninger forbliver en udfordring. I det foreliggende arbejde demonstrerer vi, at systemisk ekspression af IL-12 gennem hydrodynamisk injektion af IL-12-cDNA er i stand til at inducere forskellige typer af leverlæsioner er forbundet med en toksisk patologi. Men vi rapporterer her, at hepatisk toksicitet formindskes og overlevelse af mus forbedrede i fravær af tumornekrosefaktor-alfa (TNFa). Denne observation står i modsætning til adskillige murine modeller og kliniske forsøg, som postulerer interferon gamma (IFNy) som det vigtigste cytokin ansvarlig for IL-12 toksicitet. Desuden demonstrerer vores arbejde, at når IL-12-cDNA er co-injiceret med IL-18 cDNA eller når mus forbehandlet med en lav dosis af IL-12 cDNA forud for modtagelse af en høj dosis af IL-12-cDNA, systemiske niveauer af TNFa er næsten fuldstændigt ophævet, hvilket resulterer i forbedret overlevelse og mindre leverskade. Vigtigt er, betyder ophævelsen af ​​TNFa signalering ikke påvirke stærke anti-tumor aktivitet af IL-12. Således neutralisere TNF med antagonister allerede er godkendt til human anvendelse tilbyder en lovende tilgang til at ophæve IL-12 bivirkninger under brugen af ​​dette cytokin til behandling af kræft

Henvisning:. Barrios B, Baez NS, Reynolds D , Iribarren P, Cejas H, Ung HA, et al. (2014) Ophævelse af TNF Produktion under Cancer Immunterapi er afgørende for at undertrykke Side Effects På grund af den systemiske Expression af IL-12. PLoS ONE 9 (2): e90116. doi: 10,1371 /journal.pone.0090116

Redaktør: Irving Coy Allen, Virginia Tech University, USA

Modtaget: September 11, 2013; Accepteret: 27 Jan 2014; Udgivet: 28 februar 2014

Dette er en åben-adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Finansiering:. Dette projekt er finansieret delvist med føderale midler fra Intramural Research Program for Center for Cancer Research, National Cancer Institute (NCI) , National Institutes of Health, og også af Agencia Nacional de Promocion Científica y Tecnológica (Argentina) og Secretaria de Ciencia y Técnica de la Universidad Nacional de Córdoba (SeCyT-UNC, Argentina). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

immunmodulerende og anti-angiogene funktioner af IL-12 har givet begrundelsen for at udnytte dette cytokin som et middel mod cancer. Mere end et årti siden, kliniske forsøg administrerer IL-12 til behandling af tumorer, herunder T-celle lymfom [1], non-Hodgkin lymfom [2], melanom [3], ovariecancer [4], Kaposis sarkom [5] og renal carcinoma [6] blev igangsat. Systemisk IL-12 blev vist at være i stand til at undertrykke tumorvækst, metastase, og angiogenese

in vivo

[7] – [11], men dets anvendelse er blevet forbundet med signifikant dosis- og tidsplan-afhængige toksicitet, repræsenterer en væsentlig hindring for den kliniske anvendelse [1], [3], [4], [6], [7]. Grade 1-4 giftighed inhiberet anvendelse af IL-12 som en cancerterapi. Imidlertid alternative metoder til anvendelse af IL-12 er under intensiv undersøgelse i dyremodeller af cancer og i de seneste kliniske undersøgelser, [12] – [16]

Adskillige kliniske forsøg, der anvender IL-12 har vist, at forøget. niveauer af den inflammatoriske cytokin IFNy var forbundet med forskellige kvaliteter af hepatotoksicitet og andre toksiske bivirkninger [2], [4], [6], [17]. Desuden er der i flere murine modeller, den IFNy udtryk fremkaldt efter IL-12 administration viste sig at være ansvarlig for de fleste af de observerede bivirkninger [18] – [21].

Ved hjælp forskellige murine tumor-modeller, vi har tidligere rapporteret, at systemiske niveauer af IL-12 alene eller sammen med IL-18, inducerede efter hydrodynamisk injektion af de respektive cDNA’er, fuldstændigt ophævet subkutan tumorvækst og pulmonal og hepatiske metastaser [10]. Endvidere co-ekspression af IL-12 + IL-18 var i stand til at forbedre overlevelsen ved aftagende IL-12-bivirkninger [10]. Vores tidligere arbejde viste også, at IFNy var delvist ansvarlig for de IL-12-bivirkninger. Endvidere demonstrerede vores data, at forøget overlevelse af IL-12 + IL-18-behandlede mus er associeret med tidlig IL-10-produktion og en reduktion af IFNy og TNFa serumniveauer [10]. I denne sammenhæng skal arbejde viser, at ved hjælp hydrodynamisk injektion for at inducere systemisk co-ekspression af IL-12 + IL-18 cDNA’er eller ved præ-injektion af en lav dosis af IL-12-cDNA forud for en stor dosis af IL-12 cDNA, vi observerede signifikant øget overlevelse og formindsket hepatotoksicitet. Interessant, begge metoder viser, at denne virkning er stærkt forbundet med ophævelse af TNFa ekspression, en inflammatorisk cytokin, som også spiller en patologisk rolle ved sepsis chok og

in vivo

LPS behandling [22] – [25]. Sammen dataene i dette arbejde bidrager til vores forståelse af grundlaget for IL-12-systemiske bivirkninger. Desuden foreslår vi, at afhængigt af det anvendte system til at fremkalde systemisk IL-12 udtryk; forskellige giftige mæglere kunne være hovedpersonerne i negative bivirkninger. Desuden kan data præsenteret i dette manuskript danne grundlag for udvikling af nye metoder til at mindske IL-12 toksicitet, når udformningen af ​​fremtidige behandlinger til kræftbehandling involverer dette cytokin.

Materialer og metoder

mus og cellelinier

C57BL /6 (B6) -mus, 6-10 uger gamle, blev anvendt og holdt under specifikke patogenfrie betingelser. Inducerbar nitrogenoxidsyntase (iNOS) knock out (KO), blev TNFa KO og TNFa receptor én (TNFαR1) KO-mus på en C57BL /6 genetisk baggrund købt fra The Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME, USA. Animal Care blev ydet i overensstemmelse med de procedurer, der er skitseret i vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr (NIH-publikation nr 86-23, 1985). De eksperimentelle protokoller blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología (CIBICI), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET). Vores dyr facilitet har fået NIH dyrevelfærd forsikring (forsikring nr. A5802-01, Office of Laboratory Animal Welfare, NIH, Bethesda, MD, USA). For at undgå dyrs lidelser, blev mus hurtigt aflivet ved cervikal dislokation. Under milten (I.S.) tumorceller injektion blev en kortere tid for kirurgi anvendes, og de indsnit blev gjort så minimal som muligt under proceduren. Under genopretning fra kirurgi blev mus placeret i varme tæpper og deres øjne blev hydreret med en saltvandsopløsning. Dyrene blev placeret tilbage i bure efter fuldstændig bedring fra operationen.

B16-F10 melanomceller blev opnået fra American Type Culture Collection. Cellelinien var fri for mycoplasma-infektion og testet ved PCR hver 6. måned. B16-F10 melanomceller blev dyrket i DMEM indeholdende 10% FBS, 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, og ikke-essentielle aminosyrer ved 37 ° C, 5% CO

2.

Hydrodynamisk cDNA injektioner

proceduren for hydrodynamiske genoverførsel er blevet beskrevet tidligere [10], [26]. Kort beskrevet blev dyr injiceret i halevenen på mindre end 8 sekunder med de respektive cDNA’er opløst i 1,6 ml steril 0,9% natriumchloridopløsning og opdelt i 3 grupper, kontrol: 5-15 ug ORF tom vektor kontrol cDNA, IL 12: 5 ug IL-12 cDNA (pscIL-12, p40-p35 fusionsgen) og IL-12 + IL-18: 5 ug IL-12 cDNA (pscIL-12, p40-p35 fusionsgen) plus 10 ug af IL-18 cDNA (PDEF pro-IL-18). Alle ekspressionsplasmider udnytter den menneskelige forlængelse 1-α-promotor til at drive transskription.

in vivo

effekter observeret ved cytokin induktion er rent på grund af ekspressionen af ​​de cytokin cDNA og ikke af LPS forurening. WT og TLR4 KO-mus udvikle lignende niveauer og kinetikken for TNFa ekspression efter IL-12 cDNA behandling således indikerer fravær af LPS i cytokin-cDNA præparat, der anvendes til injektion (data ikke vist).

milt prøver

cytokiner analyse af

in vitro

stimulerede celler, milte blev knust, depleteret for røde celler ved inkubering i ACK lyseringsbuffer (Biowhittaker, Walkersville, MD), vasket og resuspenderet i suppleret medium (RPMI 1640, 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 5 x 10

-5 M 2-mercaptoethanol, 1 mM natriumpyruvat og ikke-essentielle aminosyrer). Cellesuspensioner blev talt og stimuleret

in vitro

med supplerede medier, anti-CD3 overtrukket antistof (Ab) (BD-Pharmingen, La Jolla, CA) ved 2 ug /ml eller LPS (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ved 1 pg /ml i 72 timer i en inkubator indstillet til 37 ° C og 5% CO

2.

cytokin og ALT assays

Sera blev analyseret for cytokin produktion ved ELISA ifølge producentens anvisninger. De anvendte kits var: mIL-10, mIFNγ, mTNFα (BD-Pharmingen, La Jolla, CA). Alaninaminotransferase (ALAT) sera blev bestemt ved hjælp af en specifik kolorimetrisk kit (Wiener Laboratories) og ved at følge producentens anvisninger.

Hystopathological analyse af levervæv

Lever opnået fra mus i den forskellige behandling grupper blev høstet på dag 15 efter cDNA behandling, fikseret i 4% formaldehyd og derefter indlejret i paraffin. 6 um snit blev forberedt og hematoxilin /eosin (H /E) eller Periodiske syre-Schiff (PAS) pletter blev anvendt til afsnittene. Sektioner uden identifikation, blev analyseret for væv ændringer under et optisk mikroskop af en patolog.

Flowcytometrianalyse

For flerfarvet farvning, fluorocrome-konjugeret Abs (BD-Pharmingen, La Jolla, Californien ) mod afstamning markører blev anvendt i forskellige kombinationer. Kort fortalt blev Fc receptorer på celler blokeret med et anti-CD16 /32 Ab i 30 min ved 4 ° C og vasket. Celler blev derefter farvet for overflademarkører i 30 minutter ved 4 ° C, vasket to gange og analyseret ved flowcytometri med en BD FACS Canto ™ II cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Til flowcytometri cellesortering, splenocytter fra IL-12 + IL-18-cDNA-behandlede mus blev farvet med fluorocrome-mærket CD4 (klon RM4-5), CD8 (klon 53-6.7), CD11b (klon M1 /​​70) og CD11c (klon HL3) antistoffer (BD-Pharmingen, La Jolla, CA) og sorteres til en renhed på 97-99% under anvendelse af en MoFlo sorteringsanlæg (Dako Cytomation).

mRNA ekstraktion og analyse

totalt RNA blev isoleret under anvendelse af et enkelt trin phenol /chloroform-ekstraktion procedure (TRlzol; Invitrogen Life Technologies). RT-PCR blev udført med 100 ng af total RNA for hver prøve (Super Script III ét trin RT-PCR med platin Taq, Invitrogen), der består af en 15 minutters revers transkriptionsreaktion ved 45 ° C, 40 cykler af denaturering ved 94 ° C (15 s), annealing ved 55 ° C (30 s) og forlængelse ved 68 ° C (60 s), med en endelig forlængelse i 5 minutter ved 68 ° C. Primere anvendt var:. INOS, fornemmer 5′-GCA TTT GGG AAT GGA GAC TG-3 ‘, antisense 5′-GTT GCA TTG GAA GTG AAG CGT TTC-3’

vestlige immunoblotting

Splenocytter blev lyseret med 150 pi iskold lysepuffer og centrifugeret ved 14.000 rpm, 4 ° C i 5 min. Proteiner ekstrakter blev elektroforesebehandlet på en 10% SDS-PAGE-gel og overført til et Immun-Blot PVDF-membran (Bio-Rad, Hercules, CA). Membraner blev blokeret med 5% mælk, 0,1% Tween-20 i TBS natten over ved 4 ° C og derefter inkuberet med primære antistoffer i 3 timer ved stuetemperatur. Efter inkubation med et peberrodsperoxidasekonjugeret konjugeret sekundært antistof (Cell Signaling Technology, Inc. Beverly, MA) blev proteinbånd påvist med et Super Signal Chemiluminescent Substrate (Pierce) og Biomax-MR film (Eastman Kodak, Rochester, NY). Salg

Arginase aktivitetsassay

Triton X-100 (0,1%, 100 pi) blev tilsat til splenocyt pellets, som derefter blev behandlet som angivet. Efter 30 min inkubation blev Tris-HCI og MnC

2-blanding (100 pi) tilsat til cellerne i 10 minutter ved 56 ° C. Pladerne blev inkuberet med L-arginin (100 pi) ved 37 ° C i 30 minutter, og derefter en H

2SO

4 /H

3PO

4 /H

2O-blanding ( 800 pi) blev tilsat og opvarmet med α-isopropyliden nitrobenzen acetone (50 pi) ved 95 ° C i 30 minutter. Komplekset i hver brønd blev fortyndet 20 gange med PBS for at detektere den optiske densitet (OD) værdier ved 540 nm med en UV-spektrofotometer.

Nedsat metastase assay og subkutan tumorvækst

C57BL /6 og TNFαRI KO-mus var der injiceret med B16-F10 melanomceller (0,5 × 10

6 celler /0,5 ml 0,9% natriumchloridopløsning) for hepatisk metastase analyse. Tre dage senere blev cDNA’er leveret af hydrodynamisk injektion. Elleve dage senere blev lever opsamlet, og antallet af metastaser blev bestemt under et dissektionsmikroskop.

At evaluere subkutan tumorvækst blev C57BL /6 og TNFαRI KO-mus barberet og injiceret s.c. i den venstre flanke med 1 × 10

6 B16-F10 melanomceller i 0,2 ml af en steril 0,9% natriumchloridopløsning. Efter 10-14 dage, når faste tumorer var synlige (4-5 mm diameter) blev mus hydrodynamisk injiceret med de udpegede cDNA’er. Tumorvækst blev overvåget med en passer. Dag 0 svarer til den dag, hvor cDNA’er blev administreret.

Statistisk analyse

For statistisk signifikans, data blev analyseret ved hjælp af en Student uparret

t

test (sammenligning af to forsøgsgrupper) eller ANOVA test (sammensætning mere end 2 forsøgsgrupper) med p 0,05 betragtes som signifikant. Ikke-parametrisk test (Kruskal-Wallis test) blev anvendt når

n

var mindre end 10. Mouse overlevelseskurver blev afbildet som Kaplan – Meier-kurver under anvendelse af GraphPad Prism version 4 (GraphPad Software, San Diego, CA) og en p 0,05 blev betragtet som signifikant

Resultater

Ændringer i leukocytter tal efter systemisk udtryk af IL-12 eller IL-12 + IL18

Vi har tidligere vist, at. depletion af T-celler og NK /NKT-celler forøger overlevelsen af ​​IL-12-behandlede mus [10]. , En resterende toksicitet vedvarer Men efter T /NK /NKT cellereduktion, hvilket tyder på, at andre celletyper også kunne være en del af IL-12-negative virkninger [10]. Som et første skridt til at undersøge dette spørgsmål, vi analyserede den relative udvikling i antallet af leukocytter til stede i milten (og lever, ikke vist) sammenlignet med kontrol mus. Som det ses i figur 1, er antallet af NK og NKT delmængder stærkt reduceret op til 50 dage efter behandlingen efter administration af enten IL-12 eller IL-12 + IL-18 cDNA’er. Disse data syntes ganske overraskende, da udtømning af NK /NKT-celler korrelerer med forbedring i overlevelse af mus behandlet med IL-12 cDNA. når vi evaluerede fænotypen af ​​NK-celler opnået fra IL-12-behandlede mus, observerede vi imidlertid, at de udtrykker høje niveauer af IFNy og tidlig aktivering markør CD69 (data ikke vist). Disse data antyder, at selv om de findes i meget lave antal, NK /NKT-celler demonstrerer en aktiveret fænotype og kan således være delvist ansvarlig for toksiciteten observeret efter systemisk ekspression af IL-12.

C57BL /6-mus blev hydrodynamisk injiceret med kontrol, IL-12 og /eller IL-18 cDNA’er. Op til 50 dage efter injektion blev dyrene aflivet, og enkeltceller suspensioner af miltceller blev opnået. Procentdelen af ​​de forskellige undersæt blev opnået ved overfladen afstamning farvning med kombination af følgende Abs: NK1.1, CD3, CD11, CD19, CD4 og CD8 og analyseret ved flowcytometri. Relative celleantal i de forskellige cellepopulationer blev beregnet ved at dividere den absolutte celleantal opnået fra cytokin-behandlede mus ved de absolutte celleantal opnået fra kontrolmus. Data udtrykkes som gennemsnit af en pulje af 4 forskellige eksperimenter (total n = 12 mus per gruppe). * 12 + 18 og 12 vs kontrol p 0,05,

# 12 vs 12 + 18 p. 0,05

Vi observerede også en ændring i antallet af T-lymfocytter efter cytokin cDNA administration. Mens CD4

+ T-celler udviser en lavere cellularitet under de fleste tidsperioder analyseret, CD8

+ T celler undergår en udvidelse i antal i den første uge efter behandlingen, men så efterfølgende vende tilbage til normale niveauer (fig.1).

Næste vi evalueret makrofag (MO) befolkningen i de behandlede mus. IL-12 alene inducerer en tidlig forøgelse i MO-numre, mens der til gengæld kun antallet af disse celler i IL-12 + IL-18-behandlede mus ikke ekspanderet (dag 2 og 3 efter behandling). Selv om MO numre nå et højere top i IL-12 + IL-18-behandlede mus på dag 10, vender de tilbage til normale niveauer på dag 50 efter behandling, mens antallet af MO i IL-12-behandlede gruppe er stadig forhøjet . Den omstændighed, at en patogen rolle for disse celler i en anden murin model for IL-12 + IL-18 systemisk ekspression er tidligere blevet beskrevet [19], vi hypotesen, at mediatorer produceret af MO kunne være ansvarlig, i det mindste delvis, for den toksiske bivirkninger observeret efter systemisk IL-12-behandling.

balancen mellem nitrogenoxid (NO) ekspression og arginase aktivitet foreslår en mere inflammatorisk profil i makrofager fra IL-12-behandlede i forhold til IL-12 + IL-18 -behandlede mus Salg

Dernæst undersøgte vi rollen af ​​NO som grundlag for IL-12-bivirkninger som NO vides at blive induceret af MO i nærværelse af IL-12 + IL-18 [27] . Produktion af NO ved neutrofiler og monocytter øges i septiske patienter og deres persistens er forbundet med en dårlig klinisk resultat [28]. Desuden overdreven NO-dannelse spiller en vigtig rolle i patogenesen af ​​chok og multipelt organsvigt under sepsis og i akut lungeskade [29]. I denne sammenhæng, vi først analyseret, hvis NO /iNOS er udtrykt i vores eksperimentelle model. Som det kan ses i figur 2A, iNOS RNA-ekspression er signifikant opreguleret i både IL-12 og IL-12 + 18-behandlede mus tidligt efter cDNA administration og vedvarer i mindst 15 dage efter behandling (data ikke vist). Interessant protein afslørede, at efter 15 dage efter behandling, iNOS-ekspression stadig opreguleres i IL-12-behandlede mus, men lavere eller ingen ekspression observeres i IL-12 + IL-18-behandlede mus (fig. 2B) . Desuden

in vitro Salg NO-niveauer evalueret på dag 15 efter behandling fra splenocytter stimuleret med LPS viste en lavere ekspression i celler opnået fra IL-12 + IL-18-behandlede mus (data ikke vist). Disse data førte os at bestemme, om den lavere ekspression af iNOS /NO i IL-12 + IL-18-behandlede mus kunne forklare den forbedrede overlevelse resultat observeres i denne gruppe, sammenlignet med IL-12-behandlede mus [10]. Overraskende, når vi overvåget overlevelse i WT og iNOS KO-mus efter IL-12 eller IL-12 + IL-18 cDNA administration, observerede vi, at manglen på iNOS-ekspression ikke forbedres resistens over for de behandlinger (fig. 2C). Disse resultater førte os til at hypotese, at NO måske ikke direkte involveret som en giftig mediator af disse behandlinger, men forholdet mellem MO NO /arginase udtryk kunne give oplysninger om den inflammatoriske miljø som følge af de forskellige behandlinger. Følgelig figur 2D viser, at splenocytter fra IL-12-behandlede mus har signifikant lavere arginase aktivitet sammenlignet med splenocytter fra IL-12 + IL-18-behandlede mus. Sammen med iNOS data konkluderer vi, at NO /arginase forholdet er højere i mus behandlet med IL-12 alene, end i mus behandlet med IL-12 + IL-18. Dette resultat antyder, at behandlingen med IL-12 + IL-18 inducerede en makrofag fænotype mindre inflammatorisk sammenlignet med IL-12-behandlede mus.

(A) RT-PCR-analyse af iNOS-genekspression i splenocytter opnået fra mus injiceret med de udpegede cDNA’er 12 + 18 og 12 vs kontrol p 0,05. (B) Western blot-analyse af splenocyt proteinekstrakter opnået fra mus injiceret med de udpegede cDNA’er, 12 vs 12 + 18, p 0,05. (C) Overlevelse overvåget i B6 (WT) eller iNOS KO-mus i de dage post-IL-12 eller IL-12 + IL-18-cDNA injektion. (D) Arginase aktivitet målt bestemmelse af urinstof niveauer i 1 × 10

6 splenocytter. Dataene i A, B og D er udtrykt som middelværdien af ​​2 forskellige eksperimenter med 4-5 mus pr gruppe. Overlevelse kurve blev bygget som en pulje af 2 forskellige eksperimenter med 5 mus per gruppe. * 12 + 18 vs 12 p. 0,05

Angivelse af IFNy, TNF og IL-10 efter IL-12 + IL-18 behandling

Vi har rapporteret, at i IL 12 + IL-18-behandlede mus, tidlig ekspression af IL-10 styrer niveauet for de inflammatoriske cytokiner IFNy og TNFa [10]. Men selv om vi udførte disse eksperimenter ved at nedbryde forskellige leukocytter populationer og evaluering overlevelse i hvert tilfælde, kunne vi ikke identificere kilderne til de cytokiner [10]. For at undersøge dette problem, vi evaluerede produktionen af ​​IL-10, IFNy og TNFa fra sorterede splenocytter opnået fra IL-12 + IL-18-behandlede mus på dag 3 efter behandling, en tidspunkterne, hvor vi tidligere havde observeret produktion af disse cytokiner (figur 3). Vi observerede, at TNFa er stærkt produceret af CD8

+ T-celler og CD11b

+ plus CD11c

+ -celler (MO, dendritiske celler (DC’er) og naturlige dræberceller (NK) -celler sorteret sammen). Eftersom NK-celler og DC’er udgør en meget lille population af splenocytter i disse mus (Fig. 1 og data ikke vist), vi sorteret alle disse celler sammen for at øge antallet af udvundne celler. For at bestemme bidraget fra MO alene, vurderet vi cytokin-ekspression i kulturer af beriget adhærente splenocytter ( 85% MO), og observeret, at disse celler udtrykte også høje niveauer af TNFa. Denne observation tydede på, at ekspressionen af ​​TNFa kan primært hidrøre fra MO snarere end de andre 2 celletyper stede i CD11b /c

+ sorterede gruppe (fig. 3A). I modsætning hertil er IFNy udtrykkes af CD4

+ og CD8

+ T-celler, men ikke fra MO, hvilket viser, at CD11 /c-ekspression skyldes sandsynligvis tilstedeværelsen af ​​NK-celler i denne gruppe (fig. 3B). Interessant er IL-10 produceret af CD4

+ T-celler og også af DC’er eller NK-celler, men ikke af MO (fig. 3C). Disse data antyder, at udtømning af T, NK og NKT-celler, kunne eliminere kilderne til IFNy (som vi tidligere rapporteret [10]), men MO stadig som en meget vigtig kilde til TNFa. Dette fund er sandsynligvis grunden udtømning af lymfocytterne kun delvist forbedrede overlevelse i IL-12-behandlede mus [10]. Den omstændighed, at MO profil synes at være mere inflammatorisk baseret på NO /arginase data, kunne forklare, hvorfor IL-12-behandlede mus udviser meget lavere overlevelse end IL-12 + IL-18-behandlede mus.

Splenocytter fra IL-12 + IL-18-mus blev opnået og farvet med anti-CD4, anti-CD8 og anti-CD11b /c fluorocrome mærket Abs og sorteres derefter til en renhed på 97-99% under anvendelse af en MoFlo sorteringsanlæg (Dako Cytomation). Sorterede celler blev derefter dyrket i nærvær af anti-CD3 overtrukket Ab (2 ug /ml) og LPS (1 ug /ml) i 72 timer. Supernatanter blev derefter høstet og (A) TNFa, (B) IFNy og (C) IL-10 ekspression blev vurderet ved ELISA. Data er udtrykt som middelværdien af ​​2 forskellige eksperimenter med 4-5 mus pr gruppe. * Stimuleret vs ikke-stimuleret, s. 0,001

TNF er en vigtig cytokin, der medierer IL-12 systemisk toksicitet

For at undersøge rollen af ​​TNF som et giftigt mægler efter IL -12 systemisk ekspression analyserede vi overlevelsen af ​​TNFa KO eller TNFαR1 KO-mus efter IL-12-behandling. Som det ses i figur 4A, ophævelse af TNFa eller dets type 1 receptor-gener signifikant forøget overlevelse af IL-12-behandlede mus sammenlignet med WT-mus. Interessant, når vi analyserede kinetikken for TNFa serumniveauer, vi observeret, at proteinekspressionsplasmider toppe omkring dag 4 i både IL-12 + IL-18- og IL-12-behandlede mus; imidlertid niveauerne er meget lavere i IL-12 + IL-18-behandlede mus (fig. 6C). Desuden ved dag 8 og op til dag 12 efter behandling, TNFa sera niveauer begynder at falde i begge grupper; imidlertid fortsat vedholdende og altid højere i IL-12-behandlingsgruppen (fig. 4B).

(A) Overlevelse blev overvåget i WT, TNFa KO og TNFRI KO-mus i dagene efter IL-12 cDNA behandling. * WT vs TNF KO og TNFRI KO, s 0,01. (B) Mus fra kontrol, IL-12 eller IL-12 + IL-18-cDNA behandlede grupper blev tappet og TNFa sera blev bestemt i dagene efter behandling. (C) Splenocytter fra kontrol, IL-12 eller IL-12 + IL-18 cDNA-behandlede mus opnåedes og dyrkedes i nærvær af medier (NS), anti-CD3 overtrukket Ab eller LPS i 72 timer. Supernatanter blev derefter høstet og TNFa ekspression blev bedømt ved ELISA. * IL-12 vs IL-12 + IL-18, s 0,05. (D) Sera fra B6 mus behandlet med kontrol eller IL-12-cDNA og fra TNFRI KO-mus behandlet med IL-12-cDNA blev opnået i dagene efter behandlingen. ALT-niveauer blev bestemt ved anvendelse af en specifik kolorimetrisk kit. Dataene i A, B og C udtrykkes som middelværdien af ​​2 forskellige eksperimenter med 4 mus pr gruppe. Dataene i D udtrykkes som middelværdien af ​​den pulje af 3 forskellige eksperimenter (WT n = 12, TNFR1 KO n = 9). * WT IL-12-cDNA vs TNFRI KO IL-12-cDNA, s. 0,05

Næste, vi sammenlignet TNF

in vitro

udtryk ved splenocyter opnået fra mus behandlet

in vivo

med IL-12 alene eller med IL-12 + IL-18. Mens TNFa fremstillet efter

in vitro

stimulering med et anti-CD3-Ab (stimulering af T-celler) er meget lig mellem celler opnået fra begge grupper, er signifikant lavere i IL-12 + IL-18-behandlede mus når stimuleret

in vitro

med LPS (dvs. MO og DCs stimulation) (fig. 4C). Disse data antyder, at de lavere niveauer af systemisk TNFa observeret i IL-12 + IL-18-behandlede mus er sandsynligvis på grund af et mindre bidrag af MO og DC’er i ekspressionen af ​​dette cytokin i denne behandlingsgruppe.

systemisk IL-12 eller IL-12 + IL-18 behandling provokerer patologiske virkninger i immun- væv og leveren

systemisk ekspression af IL-12 er blevet rapporteret at inducere flere typer af patologiske ændringer i musemodeller og cancer patienter [2], [4], [6], [17]. For at evaluere den generelle toksicitet af IL-12-behandling, vi aflivet kontrol og syge IL-12 og IL-12 + IL-18-behandlede mus og udført en komplet analyse af organ- patologi. Som det kan ses i tabel S1, de større ændringer observerede atrofi af thymus og lymfoid udtømning, og disse ændringer forekom tilsvarende i IL-12 og IL-12 + IL-18-behandlede mus.

Men analyse afslørede også en mere intens histiocytose i lymfeknuder (LN) opnået ved IL-12-behandlede mus sammenlignet med IL-12 + IL-18-behandlede mus. Histiocytose er forbundet med tilstedeværelsen af ​​makrofager i vævet, så det forværres patologi i IL-12-behandlede mus er associeret med en større udvidelse /tilstedeværelse af makrofag i LN.

Ændringer i levervæv efter systemisk ekspression af IL -12 eller IL-12 + IL-18

Selv om vi ikke observere forskelle i histiocytose når man sammenligner lever af IL-12 og IL-12 + IL-18 mus, tidligere resultater bekræftede, at sera niveauer af den leverenzymer ALT og aspartat aminotransferase (AST) var signifikant højere i IL-12-behandlede mus [10]. Næste besluttede vi at evaluere patologi dette organ i stedet for det fund, at en af ​​de mest uønskede virkninger af systemisk IL-12-terapi er hepatotoksicitet observeret efter administration af denne cytokin [2], [4], [6], [17]. Interessant nok som vist i figur 4D, IL-12-behandling af TNFa type 1 receptor KO-mus ophæver peak ALT observeret ved dag 15 i WT mus.

histopatologiske træk er til stede i lever fra mus behandlet med IL- 12 eller IL-12 + IL-18 cDNA’er afslørede store ændringer i vævet, herunder udseende: celler med en rund form (celle ballooning) (fig 5B.) sammenlignet med den klassiske sekskantede form af hepatocytter fra kontrolmus (fig. 5A). Endvidere leverne fra behandlede mus viser tab af de hepatiske sinusoider der klart kan observeres i kontrolmus (Fig. 5A vs 5B). Derudover observerede vi foci af ektopisk hæmatopoiese (fig. 5C) med tilstedeværelsen af ​​megakaryocytter (fig. 5D) i hele leveren i IL-12- eller IL-12 + IL-18-behandlede mus, men ikke i kontrolmus. Både Mallory organer (fig. 5E) og byrĺdsmedlem organer (fig. 5F) og foci af nekrotisk væv (fig. 5G) kun kan ses i mus behandlet med cytokin cDNA’er. Endelig har vi observeret, at glykogen indskud er stærkt reduceret i mus behandlet med IL-12 eller IL-12 + IL-18 (fig. 5I) sammenlignet med kontrolmus (Fig. 5H). Selvom alle disse læsioner er til stede i hele levervævet hos mus behandlet med enten IL-12-cDNA alene eller IL-12 + IL-18 cDNA’er (toppede mellem dag 14-16), co-administration af IL-12 og IL-18 er i stand til at reducere forekomsten af ​​disse IL-12-associeret hepatiske abnormiteter (tabel S2). Disse observationer korrelerer med vores tidligere data, som viste lavere ALT og AST sera niveauer i 12 + IL-18-behandlede mus [10]. Desuden TNFαR1 KO-mus (fig. 5K) udviste en lavere forekomst af disse patologiske træk efter IL-12 cDNA behandling end hvad der blev observeret i behandlede WT mus (Fig. 5J), især i antallet og størrelsen af ​​infiltrat foci (tabel S2 ).

Lever opnået fra mus i de forskellige grupper blev opnået på dag 14-16 post-cDNA behandling. Dele af 6 um blev opnået og (A-G) hematoxilin /eosin (H /E) eller (H-I) Periodisk syre-Schiff (PAS) pletter blev anvendt til afsnittene. (A) hepatocytter og sinusoids fra en kontrol mus, 100 ×. (B) Ballon hepatocytter og fravær af hepatiske sinuskurver i en IL-12-cDNA behandlet mus, 100 ×. (C) Fokus for ektopisk hæmatopoiese i et IL-12-cDNA behandlede mus, 100 ×. (D) megakaryocyt i en IL-12-cDNA behandlet mus, 100 ×. (E) Mallory og (F) Rådmand organer i et IL-12-cDNA behandlede mus, 100 ×. (G) Fokus for nekrose; 10 ×. Glykogen indskud opnået i en mus fra (H) kontrolgruppen eller (I) IL-12-cDNA-gruppe, 20 ×. Lever sektioner fra (J) WT eller (K) TNFR1 KO mus 15 dage efter IL-12 cDNA behandling. Billeder er repræsentative for 2 forskellige eksperimenter med 4-5 mus pr gruppe.

B6 mus blev behandlet med IL-12-cDNA alene (sort cirkel), IL-12 + IL-18 cDNA (åben cirkel