PLoS ONE: Grøn te polyfenoler Fremkald p53-afhængige og p53-uafhængig apoptose i prostata cancer celler gennem to forskellige Mechanisms

Abstrakt

Inaktivering af tumorsuppressorgen p53 er almindeligt observeret i human prostatacancer og er forbundet med terapeutisk modstand. Vi har tidligere vist, at grøn te polyfenoler (GTP) inducere apoptose i prostatacancerceller uanset p53-status. Men de molekylære mekanismer bag disse observationer forblive undvigende. Her undersøgte vi mekanismerne i GTP-induceret apoptose i human prostatacancer LNCaP-celler stabilt transficeret med korte hårnål-RNA mod p53 (LNCaPshp53) og kontrol vektor (LNCaPshV). GTP behandling induceret stabilisering p53 og aktivering af downstream mål p21 /WAF-1 og Bax på en dosis-afhængig måde specifikt i LNCaPshV celler. Imidlertid GTP-induceret FAS opregulering ved aktivering af c-jun-N-terminal kinase resulterede i FADD phosphorylering, caspase-8-aktivering og trunkering af BID, hvilket fører til apoptose i både LNCaPshV og LNCaPshp53 celler. Samtidig behandling af celler med GTP resulterede i hæmning af overlevelse vej, medieret af Akt deaktivering og tab af BAD fosforylering mere fremtrædende plads i LNCaPshp53 celler. Disse distinkte veje til celledød konvergeret til en fælles syntesevej, hvilket fører til tab af mitokondrisk transmembranpotentiale, cytochrom c-frigivelse og aktivering af terminale caspaser, hvilket resulterer i PARP-spaltning. GTP-induceret apoptose blev svækket med JNK-inhibitor, SP600125 i begge cellelinier; hvorimod PI3K-Akt hæmmer, LY294002 resulterede i forøget celledød fremtrædende plads i LNCaPshp53 celler, oprettelse rolle to forskellige veje for GTP-medieret apoptose. Endvidere GTP eksponering resulterede i inhibering af klasse I HDAC-protein, akkumulering af acetyleret histon-H3 i totalt cellulært chromatin, hvilket resulterer i øget tilgængelighed af transkriptionsfaktorer til at binde med promotorsekvenserne af p21 /WAF-1 og Bax, uanset p53 status celler, i overensstemmelse med virkningerne fremkaldt af en HDAC-inhibitor, trichostatin A. Disse resultater viser, at GTP inducerer prostatacancer celledød ved to forskellige mekanismer uanset p53-status, således at identificere specifikke veldefinerede molekylære mekanismer, der kan omfattes af kemoforebyggende og /eller terapeutiske strategier

Henvisning:. Gupta K, Thakur VS, Bhaskaran N, Nawab A, Babcook MA, Jackson MW, et al. (2012) Grøn te polyfenoler Fremkald p53-afhængige og p53-uafhængig apoptose i prostata cancer celler gennem to forskellige mekanismer. PLoS ONE 7 (12): e52572. doi: 10,1371 /journal.pone.0052572

Redaktør: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, USA

Modtaget: August 29, 2012; Accepteret: November 19, 2012; Udgivet: December 20, 2012 |

Copyright: © 2012 Gupta et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forskningen arbejde er støttet af USA Public Health service Tilskud RO1 CA115491, RO1 CA108512, RO1 AT002709, og R21 CA109424 og Endowment midler til SG. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne er er taknemmelige for Dr. Mark W Jackson, der afsoner en co- forfatter i dette manuskript og er en akademisk redaktør af PLoS ONE. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Med begrænsede behandlingsmuligheder til rådighed for prostatakræft, er patienter med recidiverende sygdom behandlet med anti -androgens. Imidlertid er indledende kliniske respons ofte efterfulgt af fremkomsten af ​​hormonresistent og til sidst kemoterapi-resistent cancer [1]. Det er velkendt, at kræftceller kan erhverve kemoresistens gennem en række mekanismer, de fleste af dem indebærer en ændret apoptotisk program [2]. Nyere undersøgelser har vist, at p53-status kan være en kritisk determinant for kemo-følsomhed i humane tumorer [3], [4]. Mere end 50% af humane cancere, herunder prostatacancer, udviser tab af normale p53 funktioner og /eller defekter i p53 signalvejen samt missense mutationer eller deletioner; disse molekylære ændringer er associeret med resistens mod celledød [4], [5]. Den relative ineffektivitet af de nuværende kemoterapeutiske regimer berettiger en fortsat søgen efter sikre og effektive midler, der kan forbedre behandling og /eller hæmmer udviklingen af ​​resistens over for kemoterapi.

p53 protein, en tumor suppressor, funktioner i transskription af væksthæmmende gener involveret i apoptose, cellecyklusstandsning og DNA reparation [4] – [6]. Tumoren undertrykkende p53 skyldes primært sin rolle i en af ​​to mekanismer: enten fremme reparation og overlevelse af beskadigede celler, eller fremme permanent fjernelse af uopretteligt beskadigede celler gennem apoptose [6], [7]. For eksempel p53 forårsager cellecyklusstop primært ved at aktivere transkription af et cyclin-afhængig kinase inhibitor, p21 /WAF-1, og inducerer apoptose via transskriptionel aktivering af pro-apoptotiske Bcl2 familie gener, Bax, PUMA og Noxa [7]. En alternativ og komplementær signalvej, der fører til programmeret celledød indbefatter den ydre dødsreceptor pathway. Den ydre vej initieres ved receptor ligering af FAS /CD95 ligand medieret af en adapter-molekyle FAS-associeret dødsdomæne (FADD), der slår bro mellem receptoren og den nedstrøms effektor, caspase 8, hvilket resulterer i samlingen af ​​død-fremkaldende signaler kompleks [ ,,,0],7], [8]. De ydre og indre apoptoseveje er forbundet af den caspase-8-medieret spaltning af pro-apoptotiske Bcl-2 familiemedlem Bid. Trunkeret Bud (tBid) translokerer for mitokondrier, hvor den inducerer frigivelse af cytochrom C, efterfulgt af induktion af apoptose [9].

Som deregulering af p53 pathway i en cancercelle er en almindelig begivenhed og kan bidrage til medikamentresistens, er der behov for kemoterapeutiske strategier rettet mod denne defekt mekanisme. For eksempel kan en ny terapeutisk tilgang, der involverer farmakologisk hæmning af histondeacetylaser (HDAC), giver mulighed for lokal omformning af kromatin og dynamiske ændringer i nukleosomal emballage, via acetylering /de-acetylering af core histon proteiner, og dermed spiller en central rolle i regulering af tilgængelighed til kromosomalt DNA, og derved, i reguleringen af ​​gentranskription [10]. Blandt de vigtigste regulatorer af sådanne fænomener er specifikke enzymer, der regulerer N-terminal acetylering af lysin rester på H3 og H4 histoner, de histonacetyltransferaser (HATS) og HDAC [10], [11]. Disse enzymer kan rekrutteres til at ændre specifikke gener i komplekser med sekvensspecifikke transkriptionsfaktorer. Inhibering af HDAC-aktivitet forårsager cellecyklusstop og apoptose i cancerceller, primært gennem transkriptionel aktivering af p53-medieret pro-apoptotisk respons og induktion af cellecyklus kinase inhibitor p21 /WAF-1 og Bax, samt gennem transkriptionelt uafhængig direkte binding af p53 til Bax, Bcl2 og Bcl-

xL [12], [13].

Næste til inaktivering af apoptotiske signalsystemer elementer også tumorer udvikle kemoterapi modstand ved aktivering af overlevelse signalering såsom phosphatidylinositide 3-kinase ( PI3K) /Akt pathway [14]. Aktivering af PI3K ved receptortyrosinkinaser fører til rekruttering af proteinet kinase B (PKB /Akt) til plasmamembranen, hvor det efterfølgende aktiveres ved phosphorylering på rester Thr308 og Ser473, som igen er phosphoryleret af phosphoinositid kinaser. Aktiveret Akt forøger overlevelsen af ​​celler både ved inhibering af pro-apoptotiske proteiner

viz

. BAD eller caspase-9 og ved aktivering af anti-apoptotiske proteiner og derved fremmer celle overlevelse [14], [15].

I de seneste årtier, en række naturlige polyphenolic forbindelser er blevet vurderet for deres mulige anvendelse ved forebyggelse og behandling af cancer [16]. Grøn te polyphenoler, hovedbestanddelen af ​​hvilke er epigallocatechic-3-gallate (EGCG), er blevet vist at inducere cellecyklus og apoptose i forskellige cancer celletyper [17]. Vores laboratorium har foretaget omfattende undersøgelser af de mekanismer, der ligger bag de anti-kræftfremkaldende virkninger af grøn te polyfenoler i humane prostata kræftceller [12], [13]. Vi har tidligere vist, at grøn te polyfenoler forårsage apoptose i prostatacancerceller uanset androgen forening og p53 status [13]. Desuden viste vi, at GTP og EGCG stigning p53 transkriptionel aktivitet og acetylering ved at undertrykke klasse I histondeacetylaser [12]. I den foreliggende undersøgelse, vores resultater viser, at grøn te polyfenoler inducere apoptose i prostatacancerceller ved at aktivere FAS dødsreceptor /caspase-8 pathway og inhibere p-Akt /p-BAD celleoverlevelse pathway. Vores akkumulerede resultater har stor betydning for vores forståelse af den molekylære mekanisme af kemoresistens i prostata kræftceller, og især den rolle p53 og Akt i denne proces. Da kemoresistens er en begrænsende faktor i bestræbelserne på at give en vellykket behandling for prostatakræft, er det vigtigt at forstå, hvordan GTP forskelligt overvinder terapeutisk modstand og inducerer apoptose i prostata kræftceller med varierende typer af p53 abnormiteter.

Materialer Og fremgangsmåder Salg

Celledyrkning og reagenser

LNCaPshV og LNCaPshp53 celler blev frembragt ved at inficere human prostatacancer LNCaP-celler opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA) med shp53 lentivirus fremstillet i laboratoriet ved transfektion 293T-celler med lentivirusvektorer pLVTHSiGFP eller pLVTHMshp53RNA og emballering-konstruktioner som tidligere beskrevet [18], [19]. Celler blev dyrket og opretholdt i RPMI 1640-medier (Hyclone, Thermo Fischer, Logan, UT) suppleret med 1% penicillin-streptomycin og 10% føtalt bovint serum (Foundation, West Sacramento, CA) ved 50-70% konfluens. Celler fik følgende behandlinger: 20 ng /ml Trichostatin A (Sigma, St. Louis, MO), opløst i DMSO; 20-80 ug /ml Polyphenon E® (Mitsui Norin, Japan) i det følgende benævnt som grønne te polyfenoler (GTP) til angivne tidsrum. Koncentrationer på 10 ug /ml Polyphenon E svarer til 14 uM EGCG som bestemt ved HPLC-analyse. De tilstedeværende bestanddele i Polyphenon E® er tidligere beskrevet [20]. Antistoffer for anti-p53 (SC-126), anti-p21 /WAF-1 (SC-397), anti-Akt (SC-8312), anti-Bax (SC-493), anti-BID (SC-6538), anti -HDAC1 (SC-7872), anti-HDAC2 (SC-6296), anti-HDAC3 (SC-11417), anti-HDAC8 (SC-11405), anti-FAS (SC-715), anti-FADD (SC- 5559), anti-p-FADD Ser194 (SC-12439), blev anti-caspase-8 (SC-7890) og anti-β-actin (SC-47.778) indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Antistoffer for anti-histon H3 (05-928), anti-histon acetyl H3 Lys9 /18 (07-593) fra Upstate (EMD Millipore, Billerica, MA), og BID (44-4334) blev indkøbt fra Invitrogen Corporation (Camarillo , CA). Antistoffer for anti-caspase-9 (# 9502), anti-caspase-3 (# 9662), spaltet PARP (# 9544), anti-c-IAP (# 3130), anti-X-IAP (# 2045), anti -SAPK /JNK (# 9258), anti-p-JNK Thr183 /Tyr185 (# 9251), anti-p-Akt Ser473 (# 4051), anti-Bad-(# 9292), anti-p-BAD Ser136 (# 9295 ) og anti-VDAC (# 4866) blev købt fra cellesignalering Technologies (Danvers, MA).

generation of LNCaPshV og LNCaPshp53 Cells

293T emballage celler blev udsået i 100-mm plader på dag før transfektion i DMEM indeholdende 10% varmeinaktiveret FBS uden penicillin-streptomycin. Cellerne blev transficeret med 6 ug shp53 eller shGFP (kontrol) RNA sammen med andengenerations emballage konstruktioner (pCMV-dR8.74 og pMD2G) under anvendelse lipofectamin Plus reagens (Invitrogen Corp.) ifølge protokollen tilvejebragt af sælgeren. For to efterfølgende dage, blev mediet opsamlet og lagdelt på LNCaP-celler efter tilsætning af 10 pi 4 mg /ml polybren pr 10 ml, og der steriliseres gennem filtrering.

proliferationsassav

Virkningen af ​​GTP på celleproliferation blev bestemt ved MTT [3- (4, 5-dimethyl-thiazol-2-yl) -2, 5-diphenyl tetrazoliumbromide] assay og vækstinhibering blev vurderet som procent levedygtighed hvor vehikelbehandlede celler blev sat til 100 % levedygtige som tidligere beskrevet [21].

methylenblåt farvning og kvantificering

Celler blev udpladet i 6 brønds kulturplader og behandlet med forskellige koncentrationer af camptothecin (50-200 ng /ml) i 24 timer. Medium blev derefter fjernet, og celler fikseret med opløsning af methylenblåt efter behandling og pladerne blev holdt på rysteapparat i 1 time. Pladerne blev forsigtigt vasket med dobbeltdestilleret vand for at fjerne overskydende farvestof, tørret og scannet.

lysmikroskopi

LNCaPshV og LNCaPshp53 celler blev dyrket til 70% konfluens og behandlet med 20-40 ug /ml koncentration af GTP i 24 timer. Fotografierne blev opfanget ved x40 forstørrelse med anvendelse lysmikroskop.

DNA fragmentation assay

Cellerne blev dyrket til ca. 70% konfluens og behandlet med 40 ug /ml koncentration af GTP i 48 timer. Celler blev derefter underkastet behandling til DNA-isolering og fragmentering assay. Båndene blev visualiseret under en UV-transilluminator, efterfulgt af digital fotografering som tidligere beskrevet [21].

Celledød Assay

Cell apoptose blev målt ved

in vitro

bestemmelse af cytoplasmatiske histon-associeret-DNA-fragmenter (mono og oligonucleosomes) efter induktion af celledød ved fotometrisk enzymimmunassay under anvendelse celledød Detection ELISA kit fra Roche (Cat # 11774425001) ifølge leverandørens protokol. Kort fortalt blev cellerne behandlet med 20 pM LY294002 eller 20 uM SP600125 i 8 timer og 40 ug /ml GTP i 16 timer eller i kombination i 24 timer og cytoplasmiske celleekstrakter blev overført til de streptavidinovertrukne mikrobrøndsplader med immuno-reagens indeholdende anti- histon-biotin, anti-DNA-POD. Efter inkubering blev enzymatisk reaktion udført og farve blev aflæst ved 405 nm under anvendelse reference bølgelængde som 490 nm. Baggrundsværdier (inkubationsbuffer alene) blev trukket, og OD-værdier repræsenterer nukleosomale DNA-fragmenter i behandlede prøver blev sammenlignet med disse værdier, der opnås fra ubehandlede kontrolceller, og udtrykt som fold forøgelse.

Western blot-analyse

Celler blev lyseret i radioimmunpræcipitationsanalyse (RIPA) buffer (indeholdende 1% NP40, 0,5% natriumdeoxycholat, 0,1% SDS i PBS, og frisk tilsat komplet proteaseinhibitorcocktail (Roche Applied Sciences, Indianapolis, IN). proteinkoncentrationen i cellelysat blev bestemt under anvendelse detergentforligeligt proteinassay fra Bio-Rad (Hercules, CA). Proteinprøver blev underkastet SDS-PAGE og overført til nitrocellulose-membran. membranen blev inkuberet med primært antistof i natten blokeret i 5% fedtfri mælk i PBS. Næste dag membran blev fjernet fra primære antistof, vasket med vaskebuffer og derefter inkuberet med passende peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret sekundært antistof i 1 time ved stuetemperatur. Membranen blev derefter fremkaldt med forøget kemiluminescens-reagens (GE Healthcare, Piscataway, NJ) og eksponeret for Hyblot CL autoradiografi film (Denville Scientific, Metuchen, NJ). Billede digitalisering og kvantificering blev udført med Kodak 2000 imaging system.

Ekstraktion og ekspression af acetyleret histonproteinerne Salg

human prostatacancer LNCaPshV og LNCaPshp53 celler blev behandlet med 20-80 ug /ml GTP i 24 h og blev høstet derefter vasket to gange med iskold phosphatbufret saltvand (PBS) suppleret med 5 mM natriumbutyrat. Efter vask blev cellerne resuspenderet i Triton ekstraktionspuffer [PBS indeholdende 0,5% Triton X-100 (vol /vol), 2 mM phenylmethylsulfonylfluorid, 0,02% (vægt /volumen) NaN3] og lyseret på is i 10 minutter under forsigtig omrøring, centrifugeret ved 2000 rpm i 10 minutter ved 4 ° C. Pellet blev vasket i Triton ekstraktionsbuffer og derefter resuspenderet i 0,2 N HCI. Histoner blev syre ekstraheret natten over ved 4 ° C og centrifugeret ved 2000 rpm i 10 min ved 4 ° C. Prøverne blev behandlet til analyse af histoner hjælp immunblotting.

chromatin Immunfældning (chip) Indhold

Menneskelig prostatacancer LNCaPshV og LNCaPshp53 celler blev behandlet med 20-80 mg /ml doser af GTP opløst i PBS eller kun med PBS (kontrol) i 3 dage. Ved afslutningen af ​​behandlingen blev celler inkuberet i serum indeholdende 1% formaldehyd i 15 minutter ved stuetemperatur til tværbinding. Reaktionen blev derefter afsluttet under anvendelse af 0,125 M slutkoncentration af glycin. Kromatin blev fordøjet med monococcal nucleaseenzym og inkuberet med anti-acetyleret histon H3 (Cat # 07-593, Upstate Biotechnology) antistof natten over ved 4 ° C. Tværbinding blev vendt ved at inkubere prøverne natten over ved 65 ° C. DNA blev oprenset under anvendelse af phenol-chloroform-isoamyl opløsning med ekstraktion efterfulgt af ethanolfældning. DNA blev derefter resuspenderet i nuklease-frit vand. Primere anvendt til p21 /WAF-1-genpromotoren var som følger: fremad-primere 5′-GTGGCTCTGATTGG CTTTCTG-3 ‘, reverse primere 5′-GTGAAAACAGGCAGCCCAAG-3′ og for Bax genpromotor, fremadrettede primere 5’-TAATCCCAGCGCTTTGGAA-3 ‘og revers primere 5’-TGCA GAGACCTGGATCTAGCAA-3 ‘, henholdsvis. Immunopræcipiterede DNA’er, perler eller input kontrol blev underkastet polymerasekædereaktion (PCR) amplifikation i 30 cykler fra følgende cykliseringsbetingelser: Stage-1-95 ° C i 2 min (1 cyklus), Stage-2-95 ° C i 30 s, 60 ° C i 30 s, 72 ° C i 1 min (30 cyklusser), Stage-3-72 ° C i 3 minutter (1 cyklus). PCR-produkter blev underkastet elektroforese under anvendelse af 2% agarosegel.

Cell Cycle Analysis og Apoptose Detection

Virkningen af ​​GTP på cellecyklus og subG1 blev målt ved at udføre flowcytometrisk assay. LNCaPshV og LNCaPshp53 celler blev behandlet med GTP og blev høstet ved trypsinisering efterbehandling (begge er bundet og flydende celler fra efterbehandling medier) blev opsamlet. Celler blev vasket to gange med PBS. Ca. 1 x 10

6 celler blev fikseret i 90% kold methanol og efterladt på is i mindst 30 minutter og opbevaret ved -20 ° C, indtil forarbejdet til cellecyklus. Cellerne blev pelleteret, vasket og resuspenderet i 0,04 ug /ml propidiumiodid og 100 pg /ml RNase i PBS. Prøverne blev inkuberet ved stuetemperatur i 30 min og flowcytometri blev udført på EPICS-XL MCL flowcytometer og analyseret under anvendelse Cell Quest Analysis software Modfit at bestemme antallet af celler i hver fase af cellecyklussen.

statistisk analyse

Alle eksperimenter blev gentaget mindst to gange i to eksemplarer. Resultater er udtrykt som middelværdier ± SD. Billederne blev digitaliseret og kvantificering blev udført ved anvendelse af et softwareprogram med Kodak 2000 imaging system. Statistiske sammenligninger blev udført ved ANOVA efterfulgt af en Dunnetts multiple sammenligningstest.

P

værdier. 0,05 blev betragtet som signifikante

Resultater

Selv om effekten af ​​GTP inducere apoptose i en række forskellige kræft celletyper er veldokumenteret [22] – [24], effekten af ​​GTP i fravær af p53 abnormiteter er ikke blevet undersøgt i detaljer. Tidligere undersøgelser har vist, at inaktivering af p53 ved siRNA i human prostatacancer LNCaP-celler forøget resistens mod EGCG-medieret apoptose [25]. Til utvetydigt fastslå rollen af ​​p53 og til at undersøge veje er ansvarlige for forøget cellulær resistens, genereret vi isogene celler med lentivirus vektor baggrund ved permanent knockdown p53 i LNCaP-celler for at generere LNCaPshp53 og transficeret med kontrolvektor at generere LNCaPshV celler. For at bestemme om p53 niveauer påvirker celledød respons blev de isogene celler behandlet med camptothechin, en DNA-ødelæggende anticancer middel, som forårsager apoptose i forskellige humane cancerceller [26]. Som vist i figur 1A, behandling med 50 og 100 ng /ml camptothechin i 24 timer resulterede i signifikant stigning i LNCaPshV celler i G1-fasen af ​​cellecyklussen. Sammenlignet med ubehandlet kontrol procentdelen af ​​celler i G1-fasen steg fra 67,36% til 79,62% og 86,22% efter behandling med 50 og 100 ng /ml koncentrationer af camptothecin. Ligeledes LNCaPshp53 celler udviste G1 fasen efter camptothecin behandling med 74,43% og 71,42% efter behandling med 50 og 100 ng /ml camptothecin, sammenlignet med ubehandlede celler med 62,51% i G1-fasen. Foruden G1 fasen, camptothecin forårsagede også signifikant akkumulering af celler i subG1 fase, indikerer apoptose. Sammenlignet med ubehandlede celler (3,37%), behandling af LNCaPshV celler med camptothecin steg fra 34,91% ved 50 ng /ml og 51,97% ved 100 ng /ml i sub-G1-fasen. Imidlertid LNCaPshp53 celler var mere resistente over for camptothechin-medieret apoptose med 23.87% og 29,59% ved 50 ng /ml og 100 ng /ml doser i subG1 fase, sammenlignet med 1,71% i de ubehandlede kontroller. Lignende resultater blev bemærket i klongenicitetsassayet hvor knockdown af p53 resulterede i forøget modstand mod camptothechin-medieret celledød (figur 1B).

isogene celler med Lenti-virusvektor baggrund blev dannet ved permanent knockdown af p53 i LNCaP celler [LNCaPshp53] og transficeret med kontrolvektor, LNCaPshV celler. [A] Cell behandlet med 50 og 100 ng /ml camptothecin i 24 timer høstedes, farvedes med PI og analyseret ved flowcytometri til måling af sub-G1 og G1 population. [B] Celler blev behandlet med 50, 100 og 200 ng /ml camptothecin i 24 timer og farvet med methylenblåt. Intensiteten af ​​methylenblåt optages af levende celler blev målt spectrophotometerically efter eluering farvestoffet i 0,1 N HCI og sammenlignet med ubehandlede celler. [C] Knockdown af p53 opreguleret Akt /BAD signalering i prostata kræftceller. LNCaPshV og LNCaPshp53 celler blev lyseret og Western blotting blev udført for p53, Akt, p-Akt (Ser473), dårlig, p-BAD (Ser136) proteiner. Actin blev anvendt som intern loading kontrol. [D] relative intensiteter af p-Akt og p-Bad protein i LNCaPshV og LNCaPshp53RNA celler, hvor bands var normaliseret til actin og udtrykt i relative værdier sammenlignet med det native protein. Detaljerne er beskrevet i materialer og fremgangsmåder afsnittet.

Knockdown af p53 Øger Akt Survival-signalvejen

Da undersøgelser har vist, at aktiverede Akt kan føre til nedregulering af p53-niveauer [27 ], Derefter bestemte vi effekten af ​​p53 knockdown på Akt niveauer og dens downstream mål. Som vist i figur 1C, knockdown af p53 forårsagede en signifikant stigning i p-Akt (Ser473) og p-BAD (Ser136) ekspression i LNCaPshp53 celler, sammenlignet med LNCaPshV celler. En 2,0 gange stigning i p-Akt niveauer og 3,78 gange stigning i p-BAD niveauer blev bemærket efter p53 knockdown i LNCaPshp53 celler sammenlignet med LNCaPshV celler (Figur 1D).

Grøn te polyfenoler inducere apoptose i både LNCaPshV og LNCaPshp53 celler Uafhængige af p53 status

for at karakterisere p53 status på effekten af ​​GTP behandling blev efterfølgende undersøgelser udført i LNCaPshV og LNCaPshp53 celler. Som vist i figur 2A, MTT-assay udført efter 24 timers behandling med 20-80 pg /ml koncentration af GTP udviste dosisafhængig inhibering i cellelevedygtighed fra 100% til 33.98% i LNCaPshV og 100% til 66% i LNCaPshp53 celler. I sammenligning med LNCaPshp53 celler, LNCaPshV celler var mere følsomme over for GTP eksponering i de første 24 timer af behandlingen. At undersøge virkningerne af mere langvarig udsættelse for GTP, blev tidsafhængige forsøg udført med 40 ug /ml dosis af GTP. Behandling af celler med GTP forårsagede markant akkumulering af celler i G0 /G1-fasen; 71.02% til 84,57% i LNCaPshV celler, sammenlignet med 78,39% til 81,19% i LNCaPshp53 celler mellem 48-96 timer (figur 2B). Antallet af celler i subG1 også steget betydeligt ved 96 h post-GTP behandling i begge cellelinjer; 0,53% til 66,97% i LNCaPshV celler og 0,31% til 83,94% i LNCaPshp53 celler, uanset deres p53 status (figur 2C). GTP behandling resulterede også i apoptose af begge LNCaPshV og LNCaPshp53 celler som observeret ved lysmikroskopi og DNA-fragmentering assay (figur 2 D 0,001 repræsenterer signifikante forskelle i forhold til kontrolgruppen uden GTP behandling. [B] Cell blev behandlet med 40 ug /ml GTP i 24, 48, 72 og 96 timer og distribution af celler blev optaget i forskellige stadier af cellecyklen analyseret under anvendelse af FACS-analyse. [C] Celler blev behandlet med 40 og 80 ug /ml GTP i 96 timer, og antallet af celler, som undergår apoptose blev bestemt ved måling cellepopulation i sub G1-fasen af ​​cellecyklussen. Søjlerne repræsenterer gennemsnit ± SD af mindst to uafhængige forsøg hver udført i to eksemplarer, **

s

0,001 repræsenterer signifikante forskelle i forhold til kontrolgruppen uden GTP behandling. [D] lysmikroskopisk billeder af LNCaPshV og LNCaPshp53 celler behandlet med 40 og 80 ug /ml GTP i 96 timer. GTP behandling udviser morfologiske ændringer i overensstemmelse med apoptose i begge disse celler. [E] DNA fragmentation assay. Cellerne blev behandlet med 40 ug /ml koncentration af GTP i 48 timer, opsamles til DNA-isolering og underkastet agarosegelelektroforese, efterfulgt af visualisering af bånd under UV-lys. Detaljerne er beskrevet i materialer og metoder afsnittet.

Tidligere vi rapporterede, at i humane prostata kræftceller indeholder funktionel p53, GTP konstituerende EGCG behandling opregulerer p53 og dets fosforylering på kritiske serinrester og P14

ARF-medieret nedregulering af MDM2 i p53-afhængig måde [28]. Behandling af LNCaPshV celler med 20-80 mg /ml koncentrationer af GTP i 24 timer udviste en dosisafhængig stigning i p21 /WAF-1, Bax og PUMA, velkendte downstream mål for p53, mens ingen signifikante ændringer blev noteret i p-BAD og p-Akt niveauer. I LNCaPshp53 celler, GTP behandling resulterede også i en dosis-afhængig stigning i ekspressionen af ​​p21 /WAF-1, Bax og PUMA, men ikke i det omfang observeret i LNCaPshV celler, hvilket indikerer både p53-afhængige og p53-uafhængig induktion af pro-apoptotisk proteiner i disse celler (figur 3A). Efter behandling med GTP et signifikant fald i Akt og Bad phosphorylering var tydelig i LNCaPshp53 celler. I overensstemmelse med apoptose, blev tidsafhængige stigninger i spaltet caspase 9 og caspase 3 observeret i begge cellelinier (figur 3B).

[A] Celler blev behandlet med 20-80 ug /ml koncentration af GTP i 24 h og Western blotting blev udført for p53, Akt, p-Akt (Ser473), BAD, p-BAD (Ser136), p21 /WAF1, PUMA og Bax proteiner. [B] Celler blev behandlet med 40 ug /ml koncentration af GTP for 3, 6, 9, 12, 24 og 48 timer og Western blotting blev udført i procaspase-9, kløvet caspase-9 og spaltes caspase-3-proteiner. En typisk actin-blot viser interne loading kontrol. Cytochrom c-frigivelse fra mitochondrier til cytosolen bestemtes ved Western blotting i GTP behandlede celler. En typisk actin blot demonstrerer intern belastning kontrol for cytosol mens VDAC som intern belastning kontrol for mitokondrier. [D] Celler blev behandlet med 20 uM koncentration af PI3K-Akt inhibitor LY294002 i 8 timer og med 40 ug /ml GTP i 16 timer alene eller LY294002 i 8 timer efterfulgt af GTP behandling i kombination efterfulgt af Western blotting for p-Akt , Akt, p-BAD og Bad proteiner. De udtryk for native proteiner blev betragtet som lastning kontrol. [D] Celledød måling blev udført ved fotometrisk enzymimmunoassay Celledød Detection ELISA kit. Søjlerne repræsenterer gennemsnit ± SD af mindst to uafhængige forsøg hver udført i to eksemplarer, **

s

0,001 repræsenterer signifikante forskelle i forhold til kontrolgruppen. [E] Lette mikroskopiske billeder af LNCaPshV og LNCaPshp53 celler behandlet med LY294002 og GTP alene eller i kombination. Detaljerne er beskrevet i materialer og metoder afsnittet.

Næste, vi analyserede virkningerne af GTP eksponering på downstream apoptosecyklus, specifikt effektorer af mitokondrie død kaskade, ved at evaluere cytochrom C frigivelse i cytosolen. Behandling af LNCaPshV og LNCaPshp53 celler med GTP steget markant cytochrom C niveauer i cytosolen, som toppede ved 12 timer efter GTP eksponering. Translokation af cytochrom C fra mitokondrier til cytosol blev observeret i begge cellelinier i en tidsafhængig måde (figur 3B).

Grøn te polyfenoler Inhibit Akt Ser473 phosphorylering og Downstream Mål i LNCaPshp53 Celler

Tidligere vi demonstreret, at p53 knockdown resulteret i øget udtryk af Akt og øget sin fosforylering på Ser473. Næste vi behandlet begge cellelinier med GTP og /eller LY294002, en specifik PI3K-Akt inhibitor. Phosphorylering af Ser473 og T308 aktiverer Akt at phosphorylere målproteiner gennem sin kinaseaktivitet at fremme overlevelse og inhiberer apoptose [29]. Som vist i figur 3C D, behandling af celler med LY249002 forårsagede en reduktion i p-Akt niveauer og resulterede i forøget apoptose i begge cellelinier selv om omfanget af apoptose var højere i LNCaPshp53 celler. Tilsvarende GTP behandling inhiberede Akt phosphorylering ved Ser473, hvilket var i overensstemmelse med øget apoptose, og kombineret behandling med GTP og LY294002 resulterede i en endnu højere grad af celledød i LNCaPshp53 celler end i LNCaPshV celler. Konsekvent, fosforylering af BAD faldt betydeligt som følge af nedsat fosforylering af kinase aktivitet af Akt af LY294002 og GTP; dette korreleret med samtidig øget celledød af LNCaPshp53 celler. Lignende virkninger af lavere størrelsesorden blev observeret i LNCaPshV celler (Figur 3 D & E). Disse resultater viser, at selv om omfanget af celledød forårsaget af GTP eksponering er den samme i begge cellelinier, veje, der fører til apoptose er forskellige, og kan være påvirket af p53-status.

Grøn te polyfenoler inducere dødsreceptor pathway i human prostatacancerceller

for at undersøge mulige mekanismer involveret i GTP-induceret apoptose, vi næste fokuseret på ydre vej gennem FAS. Som vist i figur 4A, behandling med GTP forårsagede induktion af FAS inden for 10 min i begge cellelinier, efterfulgt af forøgede niveauer af phosphoryleret FADD på Ser194, mens det samlede FADD niveauer forblev uændret. Men de basale niveauer af FADD var meget højere i LNCaPshp53 celler sammenlignet med LNCaPshV celler. Søgning efter opstrøms effektorer af FAS opregulering afslørede, at JNK blev aktiveret af GTP, som var tydeligt fra stigningen i p-JNK status.