PLoS ONE: Selektiv Allosterisk Hæmning af MMP9 er effektivt i prækliniske modeller af colitis ulcerosa og Colorectal Cancer

Abstrakt

Angivelse af matrixmetalloproteinase 9 (MMP9) er forhøjet i en række inflammatoriske og onkologiske indikationer, inklusive ulcerosa colitis og tyktarmskræft. MMP9 er en nedstrøms effektor og en opstrøms mediator af involverede veje i vækst og inflammation, og har længe været betragtet som en lovende terapeutisk mål. Imidlertid har tidligere bestræbelser på at målrette matrixmetalloproteinaser (MMP’er), herunder MMP9, anvendes bredspektret eller semi-selektive inhibitorer. Mens nogle af disse lægemidler viste tegn på effekt i patienter, har alle MMP-målrettede hæmmere været hæmmet af dosisbegrænsende toksicitet eller utilstrækkelig klinisk fordel, sandsynligvis på grund af deres mangel på specificitet. Her viser vi, at selektiv inhibering af MMP9 ikke inducerede bevægeapparatet syndrom (en karakteristisk toksicitet pan-MMP-inhibitorer) i en rottemodel, men reducere sygdommens sværhedsgrad hos en dextran natriumsulfat-induceret musemodel af ulcerøs colitis. Vi fandt også, MMP9 inhibering faldt tumorvækst og metastaser forekomst i en kirurgisk ortotopisk xenograft model af colorektal carcinom og at inhibering af enten tumor- eller stroma-afledt MMP9 var tilstrækkelig til at reducere primær tumorvækst. Kollektivt antyder disse data, at selektiv MMP9 inhibering er en lovende terapeutisk strategi til behandling af inflammatoriske og onkologiske indikationer, hvor MMP9 opreguleres og er forbundet med sygdom patologi, såsom ulcerativ colitis og tyktarmskræft. Derudover rapporterer vi udviklingen af ​​en kraftigt virkende og meget selektiv allosteriske MMP9 inhibitor, det humaniserede monoklonale antistof GS-5745, som kan anvendes til at evaluere det terapeutiske potentiale af MMP9 inhibering i patienter

Henvisning:. Marshall DC , Lyman SK, McCauley S, Kovalenko M, Spangler R, Liu C, et al. (2015) Selektiv Allosterisk Hæmning af MMP9 er effektiv i prækliniske modeller af colitis ulcerosa og tyktarmskræft. PLoS ONE 10 (5): e0127063. doi: 10,1371 /journal.pone.0127063

Academic Redaktør: Fabio Cominelli, CWRU /UH Digestive Health Institute, UNITED STATES

Modtaget: December 23, 2014 Accepteret 11. april 2015; Udgivet: Maj 11, 2015

Copyright: © 2015 Marshall et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Alle forfattere og anerkendte personer er nuværende eller tidligere medarbejdere i Gilead Sciences. Gilead Sciences finansieret al forskning rapporteret i dette studie og var udelukkende involveret i undersøgelsen design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, og forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har følgende interesser: Alle forfattere er nuværende eller tidligere medarbejdere i Gilead Sciences. Denne undersøgelse blev finansieret af Gilead Sciences. Gilead Sciences har patent ‘Antistoffer til matrix metalloproteinase 9’ (US8501916 B2) og patentansøgningen ‘Antistoffer til matrix metalloproteinase 9’ (US20130281676 A1), og er i øjeblikket evaluere humaniseret monoklonalt antistof GS-5745 i kliniske fase 1 forsøg (ClinicalTrials .gov identer NCT01831427, NCT02077465, og NCT01803282). Ingen af ​​disse konkurrerende interesser påvirker forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker vedrørende deling af data og materiale i forbindelse med det indsendte manuskript.

Introduktion

Matrix (MMP) -medieret proteolyse spiller en nøglerolle i modulering af cellulær homeostase: MMP’er kan initiere, forstærke, eller nedregulere signalering kaskader involveret i vækst og inflammation ved at aktivere cytokiner og frigivelse sekvestrerede vækstfaktorer, og kan ændre vævsarkitekturen ved nedbrydning strukturelle komponenter af den ekstracellulære matrix (ECM) [1 -6]. Af de 23 MMP familiemedlemmer, MMP9 (også kendt som gelatinase B) viser særligt lovende som et terapeutisk mål, da liget af dokumentation for sin deltagelse i patologiske processer, der bidrager til kronisk inflammation, tumorgenese, og metastase [5-7].

dysreguleret MMP9-ekspression og aktivitet er forbundet med adskillige inflammatoriske lidelser, herunder ulcerativ colitis (UC) [1, 7-12]. UC er en recidiverende /remitterende autoimmun inflammation i tyktarmen [13-16], der indeholder induktion af MMP9 proteinniveauer og proteolytisk aktivitet i områder med aktiv sygdom [10, 11, 17]. MMP9-aktivitet i UC er impliceret i både generering og bevarelsen af ​​en inflammatorisk tilstand-det induceres af pro-inflammatoriske cytokiner, såsom TNF-α og IL1- α [18-20], og det kan hjælpe med at opretholde pro-inflammatoriske processer ved at frigive TNF -α og TGF-β, ved potensering IL-8, og ved at aktivere IL1-β [4, 21-26]. MMP9 kan også bidrage til det inflammatoriske miljø gennem proteolyse af basalmembranen (BM) bestanddele collagen IV og laminin [7]. Ødelæggelse af epitelial BM, et afgørende træk ved UC [13, 14, 16, 18], kan resultere i epitelcelle apoptose [27], som bidrager til tab af integritet af colon mucosa-epitelbarrieren, yderligere forværrer inflammation. Ligeledes kan sprængning af endotel BM lette lymfocyt og neutrofil transmigration til stedet for inflammation [28-30].

Kronisk UC andMMP9 ekspression i UC er risikofaktorer for udvikling af colorektal carcinom (CRC) [15 , 31-33], og selv om den nøjagtige vej fra kronisk inflammation til dysplasi til neoplasme er ikke klart, inddragelse af MMP9 i processer, som muliggør etablering og propagering af begge disse sygdomme [1, 6, 7, 34, 35] antyder, at det kan spille en rolle i udviklingen af ​​UC til cancer. MMP9-ekspression er forhøjet og er korreleret med dårlig prognose i en bred vifte af tumorer, herunder CRC [5, 6, 35-47], og det spiller flere roller i tumorigeneseprocessen: MMP9 produceres af tumorceller såvel som af stromale inflammatoriske celler såsom tumorassocierede makrofager (TAM’er) og neutrofiler, og er en vigtig mediator af det tumor-stroma krydstale, der resulterer i reciprok aktivering af pro-onkogen signalering i disse to rum [48-52]. MMP9 fremmer metastase ved at lette tumorcellemigration og invasion via spaltning af BM og andre ECM komponenter [53], og det har også været impliceret i primær tumorvækst i kraft af sin position som både en nedstrøms target [54-63] og en opstrøms regulator af centrale onkogene signalveje. I sidstnævnte egenskab kan MMP9 aktivere pro-onkogen signalering via dets evne til at frigøre vækstfaktorer, såsom EGF, FGF-2, og VEGF [64-67], og at modulere integrin og receptortyrosinkinase-funktion [54, 68, 69 ]. I sidste ende, at disse forskellige aspekter af MMP9 funktion arbejde i koncert påvirke signalering dysregulering og matrix proteolyse, der bidrager til vækst og spredning af tumorer [53, 64, 70-73].

Relevansen af ​​MMP9 i patologi af visse inflammatoriske og onkologiske indikationer er blevet påvist ved rapporter, der viser, at

MMP9 – /-

mus udstillet nedsat sygdommens sværhedsgrad i prækliniske modeller af colitis og leddegigt, og vises også reduceret tumorvækst og /eller reduceret metastaser i flere kræftmodeller [1, 66, 74-81]. Selv om disse og andre offentliggjorte iagttagelser antyder, at MMP9 er en overbevisende terapeutisk mål, tidligere bestræbelser på at målrette MMP’er (herunder MMP9) udnyttes pan-specifikke eller semi-selektive inhibitorer, og var vellykket på grund af dosisbegrænsende bivirkninger såsom muskuloskeletale syndrom (MSS ) og /eller til en generel mangel på klinisk fordel [1, 17, 39, 82-84]. Set i bakspejlet, manglen på et terapeutisk vindue med disse bredere spektrum MMP inhibitorer er forståeligt i betragtning af de roller, som MMP’er kan spille i kritiske homeostatiske processer [22, 85].

Her rapporterer vi udviklingen af ​​en yderst selektive og potente allosterisk antistof inhibitor af MMP9: vi viser, at inhibering af MMP9 er effektivt i musemodeller for UC og kolorektal cancer, og at denne behandling ikke inducerer MSS i en rottemodel. Vi foreslår, at selektiv hæmning af MMP9-medieret patologisk signalering og matrix proteolyse er en roman terapeutisk mulighed i inflammatoriske tilstande såsom UC, og i kræft såsom CRC.

Materialer og metoder

Væv

Frisk-frossen (FF) og fikseret i formalin og indlejret i paraffin (FFPE) humane væv blev opnået fra Cureline, Inc. (Burlingame, CA), Asterand (Detroit, MI), eller Folio Biosciences (Powell, OH) .

Rekombinante MMP9 proteiner og immunisering

Humant MMP9 protein blev genereret ved kloning af fuldlængde cDNA i pSecTag2hygro (B) vektor (Life Technologies, Carlsbad, CA) og transient transfektion den i HEK293 celler (ATCC, Manassas, VA). Det konditionerede medium blev oprenset med en Ni-Sepharose Fast Flow 16/20 XK-søjle (GE Life Sciences, Pittsburgh, PA). Dette protein og Ribi adjuvans blev anvendt til at immunisere BALB /c-mus (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine) via trædepuden. Mus med serum antistoftitere mod MMP9 blev anvendt til at fremstille hybridomaceller biblioteker via fusion af B-celler isoleret fra lymfeknuder. Disse biblioteker blev subklonet ved en enkelt cellesortering at generere klonpopulationer hvorfra anti-human MMP9 antistof AB0041 blev identificeret. Immuniseringerne, hybridoma bibliotek skabelse og antistof kloning blev udført ved antistofopløsninger (Sunnyvale, CA). Den anti-muse MMP9 monoklonale antistof AB0046 blev tilsvarende genereret, med de undtagelser, at MMP9 knockout-mus (Jackson Laboratories) blev anvendt, og at en mus MMP9 protein sammensat af kun de pro og katalytiske domæner (aa 1-445) blev anvendt til immunisering. For specificitet analyse blev fuld længde MMP familiemedlemmer proteiner indkøbt fra R 10 mM natriumphosphat, 140 mM natriumchlorid). Antistof renhed blev vurderet ved at løse reducerede og ikke-reducerede prøver med SDS-PAGE 4-12% Bis-Tris geler og farvning med Simple Blå Safe farvning (Invitrogen). De rensede antistoffer viste sig at indeholde mindre end 5% aggregater ved SEC-HPLC ved hjælp TSKgel G3000SWXL kolonne fra Tosoh (King of Prussia, PA). LAL test (Endosafe, Charles River Laboratories, Charleston, SC) blev anvendt til at bekræfte antistofpræparater indeholdt mindre end 5 EU /mg endotoksin.

MMP9 direkte binding enzymbundet immunsorbentassay (ELISA)

Direkte binding antigen-down ELISA-analyser med oprenset rekombinant MMP9 proteiner blev udviklet til at måle den tilsyneladende bindingsaffinitet AB0046, AB0041, og GS-5745. Alle vaske blev med PBS + 0,05% Tween-20 (PBST). Fuld længde MMP9 proteiner blev overtrukket på Maxisorp-plader (NUNC, Rochester, NY), efterfulgt af blokering med PBS + 5% (w /v) bovint serumalbumin (BSA; EMD Millipore). Pladerne blev derefter vasket og serielle fortyndinger af anti-MMP9 antistoffer i PBS blev tilsat. Efter vask blev pladerne inkuberet med peberrodperoxidase (HRP) -konjugeret sekundært antistof (Thermo Scientific, Fair Lawn, NJ) fortyndet 1: 10.000 i PBS + 0,5% (w /v) BSA derefter vasket og udviklet ved anvendelse af 3,3 ‘, 5,5’- tetramethylbenzidin (TMB, Sigma, St.Louis, MO) i 1 minut. Reaktionen blev standset ved tilsætning af 1 M saltsyre. Kvantificering blev udført på en SpectraMax M5-pladelæser (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) i absorption tilstand ved en bølgelængde på 450 nm. Tilsyneladende dissociationskonstanter (K ​​

D (ELISA)) blev bestemt under anvendelse SoftMax Pro software (Molecular Devices) ved at plotte absorbansværdierne vs. koncentrationen af ​​antistof og tilpasning af dataene til en 4-parameter logistisk ligning, med “C “parameter ligning defineret som den tilsyneladende K

D.

epitop kortlægning af AB0041 og AB0046

Alle mutant MMP9 konstruktioner, der anvendes i epitop kortlægning blev genereret ved at mutere mus og menneskelige MMP9 ekspressionsvektorer hjælp en QuikChange II mutagenese kit (Stratagene, La Jolla, CA). Individuelle kloner blev verificeret ved DNA-sekvensanalyse, og mutant MMP9 proteiner blev genereret ved transient transfektion i HEK293-celler. Konditionerede medium blev høstet efter 24 til 48 timer og anvendt til at coate en His-Select Hi-Capacity Ni2

+ overtrukne plade (Sigma), natten over ved 4 ° C. Den følgende dag blev pladerne vasket i PBST og blokeret med 5% BSA i PBS i én til to timer ved omgivelsestemperatur, efterfulgt af inkubering med enten 10 nM eller 1 nM antistof fortyndet i PBST. Plader blev vasket og inkuberet med et gede-anti-muse IgG HRP-konjugeret sekundært antistof (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA,) fortyndet 1: 10.000 i 0,5% BSA i PBS. Plader blev vasket, udviklet, og læses som beskrevet ovenfor

MMP9 aktivitetsassays

MMP9 aktivitet blev vurderet ved hjælp quenchet fluorogene substrater.; spaltning frembringer fluorescens, som er proportional med mængden af ​​enzymaktivitet [86]. Humane og muse-assays anvendes QXL 520-γ-Abu-P-Cha-Abu-Smc-HA-Dab (5-FAM) -AL-NH2, hvor Smc = S-methyl-L-cystein, Abu = 2-aminosmørsyre og Cha = β-cyclohexylalanin (AnaSpec Inc., Fremont, CA), og rotte anvendte assay Mca-PLGL-Dpa AR-NH2; (R en 4-parameter kurvetilpasningen blev anvendt til at bestemme en IC

50.

TNF-α fusionsprotein spaltningsbestemmelse

Det rekombinante humane pro-TNF-α-fusionsprotein spaltningsbestemmelse (R 2 eksperimentel) af 6 rotter /gruppe baseret på deres kropsvægt. Rotterne blev holdt i individuelle bure i et temperaturkontrolleret rum med en 12-timers lys /mørke-cyklus, og havde ad libitum adgang til drikkevand og dyr chow under hele undersøgelsen. AB0041 (50 mg /kg) eller vehikel (PBS pH 6,5, 0,01% Tween-20) blev administreret til 6 rotter to gange ugentligt ved intravenøs injektion i halevenen. Som en positiv kontrol for MSS blev 6 rotter behandlet med marimastat (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) gennem et kirurgisk implanteret SubQ Alzet pumpe (Alzet, Cupertino, CA). Hver pumpe indeholdt i alt 60 mg marimastat, som blev leveret med en hastighed på 2,5 pl /time i en periode på 28 dage. En fjerde gruppe på 6 rotter modtog køretøjet anvendes til marimastat fortynding (50% DMSO /50% vand) gennem en SubQ Alzet pumpe. Marimastat release lå mellem 6,8 mg /kg /dag (ved forsøgets igangsættelse) og 5,7 mg /kg /dag (ved afslutning af studiet). Dyr blev observeret og scoret dagligt for MSS symptomer efter de ovenfor i Renkiewicz et al kriterier. [88]. Resting kropsholdning, gangart og vilje til at flytte: hvile kropsholdning blev scoret som 0 (normal), 1 (hvilende på den ene fod) eller to (hvilende på hverken den ene fod eller to fødder). Gait blev scoret som enten 0 (normal), 1 (undgår anvendelse af en bagben) eller 2 (undgår anvendelse af begge bagpoter). Vilje til at flytte efter stimulering blev bedømt som enten 0 (normal bevægelse), 1 (noget tilbageholdende med at flytte), 2 (moderat tilbageholdende med at flytte) eller 3 (meget tilbageholdende med at flytte). Ved afslutning af studiet (dag 28) blev lemmer høstet og fikseret i 10% neutral pufret formalin for histopatologisk analyse. Lemmer var afkalket og derefter trimmet, forarbejdet, indlejret i paraffin, snittet, farvet med hematoxylin og eosin (H . Produkt nr 160.110;. Varenummer 5237K) i drikkevandet på undersøgelsesdagene 0 til 5. DSS opløsningen var erstattet med en frisk fremstillet opløsning på dag 3. en gruppe mus (n = 5) modtog ikke DSS og tjente som ingen sygdom kontrolgruppen. På undersøgelsesdag 6, blev 14 dyr per gruppe intraperitonealt administreret enten PBST køretøj, isotype kontrol antistof (30 mg /kg), AB0046 (30 mg /kg), eller etanercept (10 mg /kg, Clayworth Healthcare, Castro Valley, CA) . Køretøj og antistoffer blev doseret på dag 6, 9 og 12, og etanercept blev doseret på dag 6, 8, 10, og 12. Alle dyr blev vejet og vurderet visuelt for tilstedeværelsen af ​​diarré og blodig afføring dagligt. På afslutning af studiet (dag 14), alle dyr undergik video endoskopi af den nedre tyktarm med et lille dyr endoskop (Karl Storz Endoskope, Tyskland). Dyrene blev bedøvet med isofluran og colitis blev scoret visuelt med følgende skala [89]: 0 (for normal), 1 (for tab af vaskularisering), 2 (for tab af vaskularisering og dokumentation for sprødhed), 3 (for sprødhed og erosioner ), og 4 (for alvorlig sårdannelse). Hver mus fik en enkelt score (betegnet endoskopi score), der svarede til den mest alvorlige skader iagttaget over hele længden af ​​tyktarmen. Ved afslutning af studiet blev dyrene aflivet ved eksponering for C0

2. At evaluere colitis sværhedsgrad histologisk, et bord-certificeret veterinær GI patolog, blindet med hensyn til at studere grupper, vurderet H 25% angrebne), 2 (26-50% angrebne), 3 (51-75% angrebne), og 4 ( 76% angrebne). Disse scorer blev midlet til at opnå en enkelt gennemsnitlig score per mus per parameter. Denne undersøgelse og den tilhørende histopatologiske analyse (herunder udvælgelse af repræsentative billeder) blev udført af Biomodels, LLC.

HCT116 kirurgisk ortotopisk xenograftmodel

Alle tre HCT116 prækliniske studier blev udført af AntiCancer Inc. (San Diego, CA). Kvinde Ncr nu /nu mus blev opnået fra Charles River (Wilmington, MA) og blev avlet af AntiCancer Inc. til at producere studere dyr. Forsøgsdyr blev holdt ved i et HEPA-filtreret miljø med en 14 timers lys /10 timer mørke-cyklus til eksperimentet. Bure, foder og strøelse blev autoklaveret; LabDiet musefoder blev opnået fra PMI Nutrition International Inc. (Brentwood, MO) og blev tilvejebragt ad libitum, som var drikkevand. Mus blev randomiseret baseret på kropsvægt i 4 grupper (en kontrolgruppe, 3 forsøgsgrupper) af 15 dyr. Pre-implantation tumor lagre af den humane kolorektal cancer cellelinie HCT116 udtrykker GFP (AntiCancer Inc.) blev fremstillet ved subkutan injektion af HCT116-GFP-celler ved en koncentration på 5 x 10

6 celler /100 ul i flanken af ​​nøgne mus. Efter ekspansion blev tumorvæv høstet fra mus og skåret i fragmenter på ca. 1 mm

3. To sådanne tumorfragmenter blev derefter kirurgisk orthotopisk implanteret (SOI) i nærheden af ​​tyktarmen for hvert forsøg dyr, under Ketamin /acepromazin /Xylazin anæstesi.

Når kirurgisk implanterede tumorer nåede en gennemsnitlig volumen på ca. 70-100 mm

3 blev musene inddelt i behandlingsgrupper. Behandling blev initieret 16 dage efter tumor implantering for Undersøgelse 1 og Undersøgelse 3, og 17 dage efter implantation for Studier 2. Alle mus behandlet med AB0041 /AB0046 cocktail fik en startdosis på AB0046 på 50 mg /kg på den første dag i behandling. AB0041 og AB0046 blev derefter doseret ved intraperitoneal injektion to gange om ugen med 15 mg /kg, enten enkeltvis eller i kombination (i kombinationen gruppen, hvert antistof var til stede ved 15 mg /kg). Kontrolmus blev doseret med vehikel (PBS, 0,01% Tween-20). Primær tumor størrelser og legemsvægt blev målt (ved skydelære eller ved elektronisk skala, henholdsvis) to gange om ugen for Studie 2 og Studie 3, og en gang om ugen for Studier 1. Caliper-baserede størrelse estimater blev opnået ved at måle den vinkelrette mindre dimension ( W) og større dimension (L) af palperes tumor. Omtrentlig tumor volumen (mm

3) blev beregnet ved formlen (W

2x L) /2.

Mus blev afsluttet ved 20 dage efter behandlingsstart (Studie 3), 18 dage efter behandling indledning (Undersøgelse 2), eller 28 dage efter behandlingsstart (Studie 1). Udløser for eutanasi blev: tumor volumen 2000 mm

3, 20% vægttab, observeret interferens med en vital fysiologisk funktion, eller ulceration eller nekrose af tumor. Den primære colon tumor og eventuelle organer med metastase blev høstet ved undersøgelsens afslutning, og den primære tumor blev vejet efter udskæring. Tumorer blev gennemskæres, og halvdelen blev fikseret i 10% neutral pufret formalinopløsning til histologi analyse. Den anden halvdel, og alle GFP-positive metastatiske tumorer fra andre organer blev anbragt i vævs- kassetter og blev lynfrosset i flydende nitrogen. Den FluorVivo imaging system (INDEC Biosystems, Santa Clara, CA) blev anvendt til hele kroppen billeddannelse. Ved obduktion blev åben billeddannelse udført i brysthulen og maveregion til inspektion af metastase til lymfeknuder, lunge- og andre områder. Tilstedeværelsen af ​​nekrotisk væv i H Aragen Udvalget for Animal Care og Brug (IACUC godkendelsesnummer SA-003-A); Animal Care og brug Udvalg på AntiCancer (IACUC godkendelsesnummer 14-090).

Graphing og statistisk analyse

Data blev analyseret og visualiseret ved hjælp af Prism-software (GraphPad, v5.01). For kliniske, histopatologiske og immunhistokemi vurderinger, blev betydningen af ​​regulering af behandlingsgrupper vs. køretøjet gruppen vurderet som følger: D’Agostino Pearson omnibus normalitet test blev anvendt til at bestemme, om data normalt fordelte. Data, der blev normalfordelt blev evalueret af en envejs ANOVA med Dunnetts multiple sammenligningstest post-test. Ikke-normalt fordelte data blev vurderet ved enten en Mann Whitney-test (for parvis analyse) eller af en Kruskal-Wallis test med Dunns multiple sammenligningstest post-test. Fishers eksakte test blev anvendt til analyse af metastaser data. P værdi betegnelser er som følger: * 0,05, ** 0,01, *** 0,001, **** 0,0001.

Resultater

Generation og karakterisering af anti-MMP9 antistoffer

MMP9 målrettet monoklonale antistoffer blev genereret ved at immunisere mus med rekombinante humane eller mus MMP9 proteiner, og kandidatlandene antistoffer blev identificeret ved

in vitro

screening for target binding, hæmning af substrat proteolyse, og selektivitet vs. andre MMP familiemedlemmer. Udvælgelsesprocessen gav AB0041, som hæmmer både menneskelige MMP9 (hMMP9) og rotte MMP9 (rMMP9), men binder ikke til mus MMP9 (mMMP9); og AB0046, hvilket omvendt inhiberer mMMP9, mens ikke binding til rMMP9 eller hMMP9 (tabel 1). Begge antistoffer havde høj affinitet og fremragende potens: for AB0041 målrettet hMMP9, K

D (app) = 0,133 ± 0,030 nM og IC

50 = 0,172 ± 0,007 nM, og for AB0046 målrettet mMMP9, K

D (app) = 0,218 ± 0,097 nM og IC

50 = 0,029 ± 0,005 nM (tabel 1). AB0041 og AB0046 var meget selektiv, med mere end 500-gange selektivitet for MMP9 versus andre MMP familiemedlemmer (herunder stærkt homologe MMP2) (tabel 1 og tabel 2). Begge antistoffer opførte sig som ikke-kompetitive inhibitorer, som IC

50 værdier genereret mod enzymaktiviteten på et peptidsubstrat blev ikke væsentligt påvirket af substrat koncentrationer fra 1-20 pM (Fig 1A). Derudover begge antistoffer inhiberede MMP9-medieret spaltning af det fysiologisk relevante substrater gelatine og basalmembran collagen IV, med potenser svarende til dem frembragt i peptidsubstratet assay. IC

50 af AB0041 var 0,34 ± 0,061 nM for gelatine spaltning (Fig 1B) og 0,30 ± 0,025 nM for kollagen IV spaltning (Fig 1C), og IC

50 af AB0046 for gelatine spaltning var 0,26 ± 0,018 nM (fig 1B). Mus MMP9 ikke fordøje human collagen IV, så AB0046 ikke blev vurderet i dette assay.