PLoS ONE: purinnukleosid Analog – sulfinosin Modulerer Diverse mekanismer i kræft Progression i multiresistent kræftceller

Abstrakte

At opnå en effektiv behandling af kræft er svært, især når der er udviklet resistens over for konventionel kemoterapi. P-glycoprotein (P-gp) aktivitet regulerer multiresistens (MDR) udvikling i forskellige cancer celletyper. Identifikation af anticancer-midler med potentiale til at dræbe kræftceller og samtidig hæmmer MDR er vigtigt at intensivere søgningen efter nye terapeutiske tilgange. Vi undersøgte virkningerne af sulfinosin (SF), et helt uudforsket purin nukleosidanalog, i MDR (P-gp over-udtrykkende) ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) og glioblastomcellelinier (NCI-H460 /R og U87-TXR , henholdsvis). SF viste samme effekt mod MDR kræft cellelinjer og deres følsomme kolleger. Det var imidlertid ikke-toksiske for normale humane keratinocytter (HaCaT). SF induceret caspase-afhængig apoptotisk celledød og autofagi i MDR cancerceller. Efter SF ansøgning blev reaktive ilt arter (ROS) genereret og (GSH) koncentration glutathion blev reduceret. Udtrykket af centrale enzym til GSH-syntese, blev gamma glutamyl-cystein-syntetase (γGCS) faldt såvel som udtryk for

gst-π

mRNA. Derfor SF faldt betydeligt udtryk for

HIF-1α

,

MDR1

VEGF

mRNA selv i hypoxiske betingelser. SF forårsagede hæmning af P-gp (kodet af

MDR1

) udtryk og aktivitet. Ophobningen af ​​standard kemoterapeutisk middel – doxorubicin (DOX) blev induceret ved SF i koncentrations- og tidsafhængig måde. Den bedste virkning af SF blev opnået efter 72 timer, når det nås virkningen af ​​kendte P-gp-inhibitorer (Dex-verapamil og tariquidar). Følgelig SF sensibiliseret de resistente kræftceller til DOX i efterfølgende behandling. Endvidere SF nedsatte experssion af vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) på mRNA og protein niveau og moduleret dens sekretion. Afslutningsvis virkningerne på P-gp (impliceret i farmakokinetik og MDR), GSH (impliceret i afgiftning) og VEGF (impliceret i tumor-angiogenese og progression) kvalificere SF multi-potent anti-cancer middel, som brug, anses især for resistente maligniteter

Henvisning:. Dačević M, Isaković A, Podolski-Renić A, Isaković AM, Stanković T, Milošević Z, et al. (2013) purinnukleosid Analog – sulfinosin modulerer Diverse mekanismer i kræft Progression i multiresistent kræftceller. PLoS ONE 8 (1): e54044. doi: 10,1371 /journal.pone.0054044

Redaktør: Michihiko Kuwano, Kyushu University, Japan

Modtaget: 26 juli, 2012; Accepteret: December 5, 2012; Udgivet: 11 Jan 2013

Copyright: © 2013 Dačević et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Ministeriet for Uddannelse, Videnskab og teknologisk udvikling af Serbien (tilskud nummer III 41031 og III 41025) støttede denne forskning. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

sulfinosin eller SF (figur 1, [R, S] -2-amino-9-β-D-ribofuranosylpurine-6-sulfinamid) er den oxiderede form af 6-thioguanosine [1]. Det er en ganske uudforsket anticancermiddel i forhold til andre thiopuriner (6-thioguanin og 6-mercaptopurin). SF hæmmer kræft cellevækst, i det mindste delvist, ved inkorporering af sin fosforyleret derivat i DNA. Den metaboliske omdannelse af SF til tilsvarende 5′-monophosphat derivat er mere kompleks end andre thiopuriner [2].

Da SF anvender forskellige metaboliske veje for sin intracellulære aktivering, SF behandling ikke inducerer resistens i cancerceller. I modsætning hertil udeladelsen af ​​et enkelt enzym er ansvarlig for den metaboliske aktivering af andre purin nukleosidanaloger er nok for udvikling af resistens. SF bedre penetrerer centralnervesystemet (CNS) end dens parentale molekyle – 6-thioguanosine og er mere effektiv til kræftbehandling. SF er nyttig mod maligniteter resistente over for andre thiopuriner [3]. På trods af begrænsninger for deres anvendelse, nogle purinanaloger tæt relateret til SF viste betydelige antiangiogene aktiviteter, der fortjener videnskabelig opmærksomhed [4].

metabolisme SF indebærer cellernes glutathion system. SF let addukter til sulfhydrylforbindelser (glutathion og cystein) og ved at undertrykke glutathion afgiftning systemet og hæve koncentrationen af ​​reaktive oxygenarter (ROS), kan SF inducerer død af cancerceller [2].

I betragtning af sin store effekt i kræftbehandlingen og moderat toksicitet for normale celler [2], SF er egnet til kombination med andre kemoterapeutiske midler. SF virker synergistisk med doxorubicin (DOX), curcumine (CUR) og verapamil (VER) i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) cellelinier [5] – [7]. Effektiviteten af ​​den kombinerede anvendelse med SF tilladt at anvende disse stoffer i lavere koncentrationer, der er mindre giftige med færre bivirkninger. Vi antager, at alle de nævnte anti-cancer effekter af SF kunne være nyttigt for reversion af resistens over for kemoterapeutika.

Multi-resistens (MDR) er den vigtigste begrænsning for udførelsen af ​​en vellykket kræftbehandling. MDR fænotype ofte vedrører overekspression af P-glycoprotein (P-gp), en membran transportør, der effektivt ekstruderer de cytotoksiske lægemidler fra kræftceller og ændrer deres farmakokinetik. P-gp fungerer som en efflux pumpe til forskellige hydrofobe anticancer lægemidler, såsom antracykliner, vinca-alkaloider, taxaner, epipodophyllotoxiner, og nogle af de nye lægemidler (fx imatinib, nilotinib, everolimus). P-gp over-ekspression er almindelig i eksperimentelle kræftmodeller samt i cancervæv fra patienter [8]. Derfor har P-gp blevet en vigtigste terapeutisk mål for at overvinde MDR.

Blandt mange muligheder for at vende tilbage MDR, kan agenterne med en anti-cancer aktivitet af deres egne undersøges som potentielle MDR-modulatorer. Vi spekulerede tidligere, at udover synergien mellem SF og DOX som anti-cancer medicin, der virker gennem separate veje, kunne ændringer af MDR-relaterede gener udtryk og reduktion af P-gp-aktivitet bidrager til kemo-overfølsomhed effekt af SF [5], [6].

Derfor har vi gennemført yderligere undersøgelser af mekanismer involveret i SF aktion i resistente og uhelbredelige kræftformer. Til det formål, vi ansat to forskellige MDR kræft cellelinjer med overekspression af P-gp (NCI-H460 /R og U87-TXR) [9], [10]. Vi undersøgte potentialet i SF til at dræbe cancerceller og inducerer autophagy samt at modulere involveret i cancer progression mekanismer, såsom glutathion (GSH) afgiftningssystem, P-gp-medieret lægemiddel transport, vaskulær endothelial vækstfaktor (VEGF) ekspression and.secretion. Vi fandt, at ændringen af ​​redox status ved SF førte til faldet i ekspressionen af ​​hypoxi inducerbar faktor-1α (HIF-1α), som regulerer ekspressionen af ​​P-gp og VEGF. Således modulation af MDR af SF er konsekvensen af ​​GSH afgiftning systemets undertrykkelse.

Materialer og metoder

Narkotika

SF ([R, S] -2-amino -9-β-D-ribofuranosylpurine-6-sulfinamid) blev syntetiseret fra 6-thioguanosine ifølge den offentliggjorte fremgangsmåde [1]. DOX opløsning blev opnået fra EBEWE Arzneimittel GmbH, Wien, Østrig. R ± Verapamil (Dex-VER) blev indkøbt fra Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Tyskland. Tariquidar (TQ) blev venligst stillet til rådighed af Dr. Sven Rottenberg fra Holland Cancer Institute, Amsterdam. CoCl

2 blev opnået fra Fisher Scientific, USA. SF blev holdt ved -20 ° C. Før behandling, SF og CoCl

2 blev frisk fortyndet i vand, mens portioner af DOX blev optøet fra -20 ° C. Dex-VER blev holdt som 1 mM stamopløsning ved stuetemperatur. TQ blev fortyndet i dimethylsulfoxid (DMSO) og 10 uM portioner blev opbevaret ved -20 ° C.

Kemikalier

RPMI 1640-medium, Minimum Essential Medium (MEM), penicillin-streptomycin-opløsning, antibiotikum-antimykotisk opløsning, L-glutamin og trypsin /EDTA blev indkøbt fra PAA, Wien, Østrig. Føtalt bovint serum (FBS), blev sulforhodamin B (SRB) og acridinorange opnået fra Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Tyskland. Matrigel blev venligst stillet til rådighed af Dr. Sanja Mijatovic fra Institut for Biologisk forskning “Sinisa Stankovic”, University of Beograd, Serbien. Propidiumiodid (PI) blev købt fra Roche Applied Science, Basel, Schweiz og Annexin-V-FITC (AV) fra Abcam, Cambridge, UK. FITC-konjugeret anti-P-gp-antistof blev leveret af BD Biosciences, Storbritannien, mens PE-konjugeret anti-VEGF-antistof blev opnået fra R BD Biosciences, San Jose, CA, USA) i RPMI 1640 medium med 10% FBS. Celler blev inkuberet i 72 timer og fotograferet live af fase mikroskopi.

Bestemmelse af celleproliferation (CFSE farvning)

Hastigheden af ​​celleproliferation blev målt ved flow-cytometrisk analyse af celler mærket med carboxyfluorescein succinimidyl ester eller CFSE [12]. Kort fortalt, løsnede celler (5 x 10

6 celler /ml) blev farvet med 1 pM CFSE i 10 minutter i mørke ved 37 ° C, vasket to gange i frisk medium, podet i seks-brønds plader med 5 × 10

4 per brønd, og derefter udsat for SF. Efter 72 timers dyrkning blev cellerne trypsineret og vasket to gange i PBS. Endelig blev cellerne resuspenderet i PBS og analyseret ved flow-cytometri. Grøn fluorescensemission blev målt ved hjælp af et FACSCalibur flow-cytometer (Becton Dickinson, Oxford, Storbritannien) og analyseret ved hjælp af Cell-Quest software.

Cell Død Detection

De procentdele af apoptotiske, nekrotiske og levedygtige celler blev bestemt ved Annexin-V-FITC (AV) og propidiumiodid (PI) mærkning. NCI-H460 /R og U87-TXR celler blev udpladet og inkuberet natten over i 6-brønds plader med densitet på 80.000 og 160.000 celler /brønd, henholdsvis. Efter 72 timer SF behandling blev fastgjort og flydende celler opsamlet ved centrifugering. Den celler pellet blev resuspenderet i 100 pi bindingsbuffer indeholdende 10 mM HEPES /NaOH, 140 mM NaCl, 5 mM CaCI

2 (pH 7,4), suppleret med 0,2 ug AV og 1 ug PI. Efter inkubationsperioden (30 minutter ved 37 ° C i mørke), blev yderligere 400 pi bindingsbuffer tilsat, og AV /PI-farvning blev analyseret inden for 1 time ved flow-cytometri. Fluorescensintensiteten (grøn FL1-H og rød FL2-H) blev målt på FACSClibur flow-cytometer (Becton Dickinson, Oxford, England). I hver prøve, blev registreret 10.000 celler (gated at udelukke celle debris), og de procentdele af levedygtige (AV- PI-), tidlig apoptotisk (AV + PI-), apoptotisk og nekrotisk (AV + PI +), og allerede død (AV- PI +) celler blev analyseret ved CellQuest Pro dataanalyse software.

caspaseaktivering

Aktivering af caspaser blev målt ved flow-cytometri efter mærkning af cellerne med en celle-permeabelt, FITC-konjugeret pan- caspaser inhibitor (ApoStat; R 0,05 (*), s 0,01 (**), s. 0,001 (***)

Resultater og Diskussion

SF hæmmer væksten af ​​MDR cancer Cells

Vi har etableret NSCLC og glioblastom P-gp over-udtrykkende cellelinjer (NCI-H460 /R og U87-TXR) med MDR fænotype for at undersøge potentielle anti-cancer stoffer [9], [10 ]. NCI-H460 /R og U87-TXR er MDR kræft cellelinjer, der stammer fra NCI-H460 (NSCLC cellelinje) og U87 (glioblastoma cellelinje). De parentale cellelinier blev betragtet som følsomme, da de celler afledt fra patienter, som ikke havde undergået kemoterapi. I den foreliggende undersøgelse, forsøgte vi at belyse virkningen af ​​sulfinosin (SF), et syntetisk purin nukleosid analog, i disse to MDR cancercellelinjer. Vi vælger SF på grund af beviser, at dets terapeutisk effektive koncentrationer ikke kunne fremkalde modstand. SF også effektivt trænger til CNS [2]. Desuden viste nylig klinisk undersøgelse, at kombinationen behandling inklusive 6-thioguanin (nært beslægtede molekyle til SF) er lovende for patienter med recidiverende høj kvalitet anaplastisk gliom [19].

Virkningerne af SF om kræft cellevækst efter 72 h behandling blev evalueret af kemo-følsomhed assay – sulforhodamin B (SRB). SF hæmmede væksten af ​​følsomme og MDR cancercellelinier på en dosis-afhængig måde (figur 2A, C). Da anvendelse af anti-cancer er begrænset af deres giftighed over for normale celler, vi testede effekten af ​​SF på HaCaT celler (normale humane keratinocytter). Virkningerne på vækst i HaCaT efter kontinuerlig behandling af 72 timer blev også vurderet af SRB assay. SF ikke signifikant reducere antallet af normale celler selv med den højeste koncentration (100 uM) (figur 2C). Vi viste, at SF hæmmer væksten af ​​følsomme samt resistente NSCLC og glioblastomaceller i mikro-molær koncentrationsområde, og at dets virkning ikke blev påvirket af tilstedeværelsen af ​​MDR-fænotypen. Desuden SF var ikke-toksiske for normale celler (HaCaT) i det koncentrationsområde, der er nødvendige for at hæmme væksten af ​​cancerceller.

væksthæmmende effekter af SF på NCI-H460 og NCI-H460 /R ( A), blev U87, U87-TXR og HaCaT (C) celler dyrket på plast efter 72 h behandling vurderet ved SRB-assay. Gennemsnitlig ± standardafvigelse værdierne blev beregnet ud fra fem uafhængige forsøg (n = 5). NCI-H460 og NCI-H460 /R (B), U87 og U87-TXR (D) celler blev farvet med CFSE og inkuberet i 72 timer med 10 pM SF. Satsen for spredning (CFSE deklination) blev bestemt ved flow-cytometri på kanal FL1. Lysmikroskopi af NCI-H460 og NCI-H460 /R (E), U87 og U87-TXR (F) cellevækst på plast (2-D kultur) og matrigel vækst (3-D kultur) efter 72 timer på 10 uM SF behandling.

Dernæst vurderede vi cytostatiske virkning 10 uM SF i hver cellelinje ved CFSE-farvning (figur 2B, D). CFSE er en vitalfarvestof stabilt i cytoplasmaet i ca. 7-8 generationer, men intensiteten af ​​CFSE fluorescens falder på grund af sin gradvise halvering inden datterceller efter hver celledeling. På den måde kan den CFSE fordeling i cellerne estimere hastigheden af ​​celleproliferation. The CFSE fordeling i kontrol og SF-behandlede prøver er illustreret ved flow-cytometrisk profilerede histogrammer (figur 2B, D). Inhiberingen af ​​proliferation observeret i nærvær af SF var den mest pronunced i NCI-H460 /R-celler. Disse resultater viste, at inhiberingen af ​​proliferation er delvis ansvarlig for den anti-cancer aktivitet af SF.

Da NSCLC og glioblastomcellelinier har høj metastatisk potentiale, sammenlignede vi virkningerne af SF til at inhibere cellevækst efter 72 t på plast (2-D kultur) og i rekonstitueret basalmembran – matrigel (3-D kultur) (Figur 2E, F). Vi fandt, at SF hæmmede væksten i 3-D kultur med samme effekt observeret i 2-D kultur. Det faktum, at cellerne blev løsnet fra hinanden efter SF behandling i matrigel, især glioblastomceller, peger på ændringen i deres adhæsive egenskaber. Derfor er vi spekulere, at SF kan påvirke affinitet af kræftceller til at invadere blodkarrene, fremkalde tumor-angiogenese og metastase.

SF inducerer Caspase-afhængig apoptose i MDR Kræftceller

Næste, vi fortsatte med at undersøge, om induktion af apoptose bidrager til anti-cancer virkning af SF i MDR cancercellelinier. For at vurdere apoptose induceret af SF efter 72 h blev cellerne podet ved optimal tæthed til deres voksende egenskaber. På den måde, havde de ubehandlede kontroller ikke opnå sammenflydning i slutningen af ​​inkubationsperioden. Annexin-V-FITC /propidiumiodidfarvning afsløret, at SF øger andelen af ​​apoptotiske celler (AV + PI-) i begge MDR cancercellelinier. Resultaterne er opsummeret i (figur 3A, B, C, D): levende celler er negative for begge, Annexin-V og propidiumiodid (AV-PI-);