PLoS ONE: Kræft Stemness i Apc- vs. Apc /KRAS-Driven Intestinal Tumorigenesis

Abstrakt

konstitutiv aktivering af Wnt sti fører til adenom dannelse, et obligatorisk skridt mod tarmkræft. I betragtning af den etablerede rolle Wnt i reguleringen stemness, vi forsøgte at isolering af cancer stamceller (CSCS) fra

Apc

– og

Apc

/

KRAS

-mutant intestinale tumorer. Ud fra følgende betragtninger CSCS er til stede i

APC

/

KRAS

tumorer, de synes at være meget sjælden ( 10

-6) i

Apc

-mutant adenomer . I modsætning hertil Lin

-CD24

hiCD29

+ subpopulation af adenocarcinomceller synes at være beriget i CSCS med forøgede niveauer af aktiv β-catenin. Ekspression profilering analyse af CSC-beriget subpopulation bekræftet deres forbedrede Wnt aktivitet og afslørede yderligere differentiel ekspression af andre signalveje, en vækstfaktor-bindende proteiner, og ekstracellulære matrixbestanddele. Som forventet, gener er karakteristiske for den Paneth cellelinie (fx defensiner) er co-udtrykte sammen med stamceller gener (fx

Lgr5

) inden for CSC-beriget delpopulation. Dette er af interesse, da det kan indikere en kræft stamceller niche rolle for tumor-afledt Paneth-lignende celler, svarende til deres rolle i at støtte Lgr5

+ stamceller i den normale tarm krypt. Samlet set vores resultater viser, at onkogene

KRAS

aktivering i

Apc

-driven tumorer resulterer i en udvidelse af CSCS rummet ved at øge ®-catenin intracellulær stabilisering

Henvisning.: Ghazvini M, Sonneveld P, Kremer A, Franken P, Sacchetti A, Atlasi Y, et al. (2013) Cancer Stemness i

Apc

– vs.

Apc

/

KRAS

-Driven Intestinal tumorigenese. PLoS ONE 8 (9): e73872. doi: 10,1371 /journal.pone.0073872

Redaktør: Cara Gottardi, Northwestern University Feinberg School of Medicine, USA

Modtaget: Marts 8, 2013; Accepteret: 24 juli 2013; Udgivet: 17 september, 2013 |

Copyright: © 2013 Ghazvini et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Disse undersøgelser blev støttet af tilskud fra den hollandske Cancer Society (EMCR 2001-2482), Nederlandene Organisation for Videnskabelig Forskning (NWO /Vici 016.036.636), programmet BSIK (Kennisinfrastructuur) af den hollandske regering tilskud 03038 (www.stemcells. nl) og Nederlandene Institute for regenerativ medicin (NIRM, www.nirm.nl), og EU FP6 og FP7 konsortier Migrering Cancer Stamceller program (MCSCs, www.mcscs.eu) og TuMIC (integreret begreb tumormetastaser (http : //itgmv1.fzk.de/www/tumic/tumic_main.htm)

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

tyktarmskræft er stadig en ideel model til at studere de molekylære og cellulære mekanismer, der ligger til grund for tumor debut og progression i retning af malignitet [1], den såkaldte adenom-carcinom sekvens [2]. alt i alt, tab af funktion mutationer i

APC

(adenomatøs polypose coli) tumorsuppressorgen eller onkogene mutationer i β-catenin (

CTNNB1

) føre til konstitutiv aktivering af Wnt /β-catenin signalering og repræsenterer den mest almindelige hastighedsbegrænsende (adenom dannende) hændelser blandt patienter med tyktarmskræft. Adenom vækst og progression er ofte ledsaget af ændringer i

KRAS

eller

BRAF

, efterfulgt af tab af

TP53

Smad4

tumorsuppressorer menes at ligge under malign transformation til lokalt invasiv adenokarcinom [1]. Men denne veletablerede genetiske evolution modellen ikke tager hensyn til andre væsentlige karakteristika for de menneskelige kolon kræft, nemlig deres cellulære heterogenitet (forskellige cellelinier er ofte til stede i det primære masse) og den formodede rolle, som en delpopulation af tumorceller spillet, den cancer stamceller (CSCS), i kørsel tumorvækst og bestemme lokal invasion i omgivende væv og fjernt metastase [3]. Faktisk selvom ovenstående genetiske model ville forudsige, at hver tumor celle i et tyktarmskræft angiveligt indledt af en

APC

eller β-catenin mutation bør altid øremærkes af kendetegnende for konstitutive Wnt aktivering, nemlig nuklear β- catenin akkumulation, er dette kun observeret i et mindretal af celler normalt placeret på den invasive foran den primære læsion [4], hvorfra de frigøre og invadere det omgivende stroma [5], [6]. Denne “β-catenin paradoks” pænt illustrerer, hvordan intra-tumor heterogenitet og muligvis tumor stemness opstå på meget indledende faser af adenom-karcinom sekvensen og føre til forskellige Wnt signalsystemer niveauer blandt forskellige tumorceller afstamninger deler den samme (

APC

) mutationer [7]. Den angiver også, at tab af

APC

funktion (eller onkogen β-catenin aktivering) er formentlig nødvendig for indtræden af ​​den oprindelige dysplastiske læsion, men utilstrækkelig til fuldt ud at aktivere Wnt signaltransduktion og fremme malign transformation i fravær af yderligere miljø- og (epi) genetiske faktorer.

Tidligere ved at ansætte

in vivo

mutagenese [8], [9] og gen-targeting i musen [10], [11], var det vist, at tabet af

APC

funktion resulterer i adenom dannelse i den øvre mave-tarmkanalen. Men disse mus adenomer mislykkes, at gå videre til malignitet og ikke spontant akkumulere yderligere genetiske hits på endogene

Kras

TP53

gener [12]. Især mens onkogen

KRAS

aktivering på egen hånd er i stand til at indlede tarm tumorigenese hvis ikke med meget sent indsættende og kun efter somatiske hits på

TP53

gen [13], sammensatte

Apc

1638N /+ /

KRAS

V12G mus er kendetegnet ved en 10-dobling i tumor mangfoldigheden og ved accelereret tumor progression sammenlignet med

Apc

1638N /+ søskende, med det store flertal af tumor læsion er repræsenteret ved adenokarcinomer [14]. Yderligere analyser viste, at

Apc

og

KRAS

mutationer er synergistisk at fremme β-catenin nuklear translokation og dermed styrke kanonisk Wnt signaltransduktion [14]. Sidstnævnte er sandsynligvis resultere fra evnen af ​​aktiveret KRAS, gennem downstream og endnu ukendte kinaser, at fremkalde β-catenin-tyrosinphosphorylering hvilket fører til en væsentlig forøgelse af dens cytoplasmatisk pool og den efterfølgende translokation til kernen, hvor det virker som en transkriptionel aktivator af adskillige Wnt nedstrøms målgener. Derfor intestinale tumorer fra

Apc

1638N /+ /

KRAS

V12G mus viser en betydelig stigning i celler med nukleare akkumulering af β-catenin sammenlignet med

apc

1638N /+ dyr [14].

I de senere år har CSCS succes blevet oprenset fra humane coloncancerformer ved anvendelse forskellige celleoverflademarkører såsom CD133 [15], [16] , EpCAM, CD44 og CD166 [17], og EphB2 [18]. Men selv om de ovennævnte celleoverfladeantigener har været medvirkende til identifikation af tumor celle subpopulationer med berigede tumor-initierende egenskaber, når transplanteret ind immun-inkompetente modtagende mus, vores forståelse af de mekanismer, der ligger tarmkræft stemness og den rolle, som CSCS spilles i progression i retning af malignitet er stadig stort set ufuldstændig. Tidligere Vermeulen et al. viste, at høj Wnt aktivitet øremærker CSCS inden suspension sfærer afledt af colontumorer [19]. Ud fra dette perspektiv, en række yderligere spørgsmål skal løses: er nukleare β-catenin ophobning en funktionel markør for tarm CSCS

in vivo

? Er tumorceller med stamceller-lignende egenskaber allerede er til stede i begyndelsen, godartede læsioner såsom adenomer? Her tog vi fordel af

Apc

1638N /+ og

Apc

1638N /+ /

KRAS

V12G musemodeller for tarm tumorigenese til fremadrettet at identificere subpopulationer af tumor stamceller-lignende celler og karakterisere dem med hensyn til deres multipotency, selvfornyelse, genom-dækkende udtryk profil, og Wnt /β-catenin signalering aktivitet.

Resultater

Tumor-initierende celler er til stede i

Apc

1638N /+ /KRAS

V12G

men er meget sjældne i

Apc

1638N /+

Intestinal Tumorer

Apc

1638N /+ mus model udvikler et gennemsnit på 4-5 godartede øvre GI tumorer (adenomer) i C57BL /6J genetiske baggrund [10], [11]. Disse læsioner kun sjældent (og med sen debut) udvikle sig til adenokarcinomer som også fremgår af den manglende spontane somatiske mutationer opstår på

Kras

og

TP53

gener [12]. For at vurdere tilstedeværelsen af ​​tumor-initierende celler i

Apc

1638N /+ adenomer, dvs. celler i stand til den gentog den primære læsion når transplanteres i en recipient dyr blev intestinale tumorer indsamlet fra

Apc

1638N /+ dyr og dissocieret mekanisk og enzymatisk til enkeltcelle-suspensioner og depleteret fra endotel og hæmatopoietiske celler (Lin

+) ved fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS). Dernæst forskellige mangfoldigheder af den resulterende Lin

– population af bulk tumorceller blev transplanteret subkutant i NOD-SCID dyr. Som vist i tabel 1, blev der ikke observeret nogen tumorvækst selv ved injektion af så mange som 0,5-1,0 * 10

6 Lin

-. Celler og 6 måneder efter transplantationen

Næste, vi gentog transplantation assay med bulk-Lin

– tumorceller fra

APC

1638N /+ /

KRAS

V12G intestinale tumorer. Som tidligere rapporteret, at størstedelen af ​​de intestinale tumorer, der findes i disse sammensatte dyr i samme indavlede C57B6 /J genetisk baggrund er lokalt invasive adenocarcinomer [14]. I skarp kontrast til den Lin

– celler fra

Apc

1638N /+ adenomer, blev observeret tumorvækst i 23 ud af 33 injektioner med 10

5

Apc

1638N /+ /

KRAS

V12G Lin

– celler og, om end på lavere forekomst (3 ud af 48 transplantationer), selv med så lav som 1500-celler (tabel 1). Ved at begrænse fortynding analyse (L-Calc ™) hyppigheden af ​​tumor-initierende celler i Lin

– befolkningen fra

Apc

1638N /+ /

KRAS

V12G intestinale tumorer blev anslået som en i 72.838 (95% CI af 109467 til at 48465). Som for

Apc

1638N /+ adenomer, tumor-initierende celler vil sandsynligvis være til stede, hvis overhovedet, på betydeligt lavere frekvenser ( 10

-6). Derfor er tilstedeværelsen af ​​tumor-initierende celler, som defineret af transplantation analyser, ser ud til at være begrænset til tumorer fra

Apc

1638N /+ /

KRAS

V12G mus sammenlignet med dem fra den

Apc

1638N /+ mus model.

den Lin-CD24

hiCD29

+ delpopulation fra

Apc

1638N /+ /KRAS

V12G

Intestinal tumorer Encompass tumor-initierende og selvfornyende CSCS

for at prospektivt berige og til sidst isolere tumor-initierende celler fra hovedparten Lin

– befolkning

Apc

1638N /+ /

KRAS

V12G tumorer, vi først testet et panel af tidligere fastsatte (kræft) stamceller markører herunder CD24, CD29 (β1 integrin), CD44, CD97, og L1CAM af FACSorting og efterfølgende transplantation i NOD-SCID mus. I modsætning til CD44, L1CAM, og CD97 (tabel S1), transplantation af Lin

-CD24

+ CD29

+ celler viste en svag endnu betydelig berigelse tumor-initierende celler (estimeret frekvens af 1 i 56.463 , med CI på 399211 til at 7986) (tabel 2). Da Lin

-CD24

+ CD29

+ befolkning udgør en relativt stor andel af bulk celler (~ 80%, data ikke vist), vi så defineret yderligere tre yderligere FACS porte baseret på den relative ekspression af CD24 celleoverflade antigen (CD24

hi, CD24

with, og CD24

lav) (figur 1a). Ud af 30 primære

Apc

1638N /+ /

KRAS

V12G tumorer analyseret ved FACS, den gennemsnitlige størrelse (udtrykt i procent af bulk Lin

– fraktionen ) af hver CD24 /CD29 sorteres delpopulation bestemmes: CD24

-CD29

-, 3,4% (SD 2.6); CD24

-CD29

+, 7,8% (SD 4.7); CD24

+ CD29

-, 4,4% (SD 3.4); CD24

loCD29

+ (P1), 7,9% (SD 2.5); CD24

medCD29

+ (P2), 52,9% (SD 7,4); CD24

hiCD29

+ (P3), 10,0% (SD 4.7). Bemærk, at disse procenter ikke øger 100% simpelthen på grund af bevidst udelukkelse af celler placeret i adskillelser mellem sortering porte (se figur 1a).

a. Stort panel: punktdiagram repræsenterer farvningsmønstret opnået ved farvning med anti-CD24 APC-konjugerede og anti-CD29 PE-konjugerede antistoffer. Lineage positive celler (Lin

+) blev udelukket (gated ud) ved farvning med biotinylerede antistoffer mod afstamning markører og Streptavidin-PerCPCy5.5. P1 (Lin

-CD24

lowCD29

+), P2 (Lin

-CD24

medCD29

+), og P3 (Lin

-CD24

hiCD29

+) populationer er angivet i plottet. Små paneler: dot plots repræsentative for celler farvet med isotypekontrol antistoffer (til venstre), kompensationskontrol farves kun med anti CD24-APC-antistoffer (i midten), kompensationskontrol farvet kun med anti CD29-PE-antistoffer (til højre). b. FACS-analyse af CD24 /CD29 mønster af tumorer opnået ved seriel transplantation af P3 celler suspensioner fra

APC

1638N /+ /

KRAS

V12G intestinale tumorer. Venstre: primær transplantation. Til højre: sekundær transplantation. c. Immunhistokemi analyse af tumorer opnået ved 3 runder af seriel transplantation af P3 celler suspensioner fra

Apc

1638N /+ /

KRAS

V12G intestinale tumorer.

hyppigheden af ​​tumor-initierende celler i P1, P2 og P3 subpopulationer blev bestemt ved at transplantere 1500 celler af hver i NOD-SCID-mus. Især henviser til denne mangfoldighed CD24

medCD29

+ og CD24

loCD29

+ celler konsekvent undladt at danne tumorer (kun 1 vækst ud af 56 transplantationer), Lin

-CD24

hiCD29

+ subpopulationen viste sig at omfatte en væsentlig berigelse i tumorigene celler (13/28; tabel 2). Så selv i dette tilfælde kunne vi ikke udføre begrænsende fortynding analyse af L-Calc ™ (da en fast mangfoldighed af celler var ansat) Lin

-CD24

hiCD29

+ tumor delpopulation synes at være præget af en betydelig relativ berigelse på ca.. 20-25 gange sammenlignet med total Lin

– bulk-celler (1 CSC ud af ~3000 tumorceller vs. 1 i 72.838)

Definitionen af ​​cancer stamceller kan ikke udelukkende baseret på deres evne. til at danne tumorer, når transplanteret ved lav multiplicitet i immun-inkompetente mus. Lige så vigtige karakteristika CSCS er deres unikke evne til at forny sig selv og differentiere til brændstof og rekapitulere den heterogene sammensætning af den primære tumor, de stammer fra. For at afgøre, om de tumor-initierende celler omfattet af Lin

-CD24

hiCD29

+ befolkningen er også i stand til selv-fornyelse og differentiering, vi udførte serielle transplantationscentre eksperimenter. Først 1500 Lin

-CD24

hiCD29

+ celler blev isoleret fra

Apc

1638N /+ /

KRAS

V12G primære intestinale tumorer og transplanteret i NOD-SCID recipientmus. Som forventet fra vores tidligere resultater, denne indledende analyse gav anledning til subkutane tumorer inden 8 til 10 uger. De resulterende tumorer blev derefter skåret ud fra de modtagende NOD-SCID dyr og ansat til både FACS og histologisk analyse. Som for FACS blev tumorer dissocieret til enkeltcelle-suspensioner og analyseret, sorteret og transplanteres efter deres CD24 og CD29-ekspressionsniveauer. Sekundære tumorer stammer fra Lin

-CD24

hiCD29

+ celler fuldt sammenfattet CD24 /CD29 FACS udtryk profil af de primære læsioner (Figur 1b og figur S2). Ligeledes ved transplantation af 1500 celler fra hver af de Lin

-CD24CD29 populationer opnået fra de sekundære tumorer, kun Lin

-CD24

hiCD29

+ celler var i stand til at danne tertiære tumorer. Følgelig FACS profil af de tertiære tumorer sammenfatter den for de primære læsioner (figur 1b). Især immunhistokemi (IHC) og enzymatisk farvning afslørede en gradvis stigning i den relative forekomst af tarm differentiering slægter, nemlig Flammernes (Periodic Acid Schiff, PAS), Paneth (lysozym), og entero-endokrine (synaptophysin) celler i de transplanterede intestinale tumorer sammenlignet med den primære

Apc

1638N /+ /

KRAS

V12G læsioner (figur 1c). FACS-analyse af de serielt transplanterede tumorer viste imidlertid, at den relative størrelse af de enkelte CD24 /CD29 subpopulationer ikke ændret sig væsentligt (figur S3).

Således Lin

-CD24

hiCD29

+ delpopulation af tumorceller fra

Apc

1638N /+ /

KRAS

V12G adenokarcinomer omfatter

bona fide

CSCS med tumor-initierende, selv -renewing og differentiering kapacitet.

Lin-CD24

hiCD29

+ Celler fra

APC

1638N /+ /KRAS

V12G

Intestinal Tumorer Show forøget intracellulær β catenin ophobning

Vi har tidligere foreslået, at det mindretal af tyktarmskræft celler byder ophobning nukleare β-catenin og ikke-tilfældigt fordelt langs den invasive front repræsenterer CSCS [7]. Især begge

Apc

1638N /+ adenomer og

Apc

1638N /+ /

KRAS

V12G karcinomer deler den samme “β- catenin paradoks “observeret i humane coloncancerformer i at efter IHC-analyse, kun et mindretal af tumorceller viser ophobning nukleare β-catenin, uanset at de fleste, om ikke alle, deler de to hits på

Apc

locus [12], [14] (figur 2a). For at vurdere, om de CSCS beriget i Lin

-CD24

hiCD29

+ tumor delpopulation er karakteriseret ved et forhøjet niveau af intracellulær β-catenin, vi analyserede protein udtryk i forskellige FACSorted tumor celle subpopulationer af to uafhængige assays, nemlig immunfarvning og western blot-analyse. Immunfarvning viste, at hovedparten af ​​Lin

-CD24

hiCD29

+ intestinale tumorceller er kendetegnet ved intracellulær akkumulering af β-catenin sammenlignet med andre sorterede populationer og hovedparten (Lin

-) tumorceller (figur 2b). Dette resultat blev også bekræftet i en mere kvantitativ måde ved western-analyse udført med antistoffer specifikke for signal–kompetente fraktion (dvs. dephosphoryleret ved resterne Ser37 og Thr41) af β-catenin-protein (figur 2c og fig S4).

Immuno-histokemi (a., b.) og western blot (c.) analyse af β-catenin i primære

APC

1638N /+ tarm adenomer (a.) og i FACSorted tumorer i fra

Apc

1638N /+ /

KRAS

V12G intestinale tumorer (f. og c.). Søjlerne i c. repræsenterer kvantificering af de bands, der opnås med en anti-aktiv β-catenin Ab (anti-ABC, klon 8E7, # 05-665, Millipore) ved at scanne og analysere western blot med Odyssey scanner og efter normalisering med β-actin.

Samlet set bekræfter disse data, at Lin

-CD24

hiCD29

+ delpopulation fra

Apc

1638N /+ /

KRAS

V12G tumorer, her vist sig at være beriget i CSCS, omfatter et væsentligt højere niveau af intracellulær og signaler-kompetent β-catenin i forhold til bulk-Lin

– og andre tumor celle subpopulationer. Den øgede Wnt signalering aktivitet i CSCS blev senere bekræftet ved ekspression profilering og Taqman qPCR analyse af Wnt nedstrøms målgener (fx

Lgr5

,

Axin2

,

T

, og

LEF1

;. se her nedenfor)

Den Expression underskrift CSCS fra

Apc

1638N /+ /KRA

SV12G

Intestinal Tumorer er forskellig fra differentierede og Bulk tumor celler og omfatter både Stem og Paneth Cell Markers

For at identificere molekylære forskelle mellem stilk-lignende og mere differentierede (bulk) tumorceller fra

Apc

1638N /+ og

Apc

1638N /+ /

KRAS

V12G intestinale tumorer, isolerede vi total RNA fra 10

4 Lin

-CD24

hiCD29

+ (P3), Lin

-CD24

medCD29

+ /Lin

-CD24

loCD29

+ (P1 + P2, fusionerede port) og Lin

– ( bulk) tumorceller fra 5 individuelle mus af hver genotype (

Apc

1638N /+ og

Apc

1638N /+ /

KRAS

V12G). Total RNA-prøver blev derefter anvendt til at hybridisere oligonukleotid mikroanalyse (Affymetrix musegenomet 430A 2.0 Array) ifølge traditionelle protokoller.

Først de forskellige tumorcellepopulationer isoleret fra mus med forskellige genotyper (

Apc

1638N /+ og

Apc

1638N /+ /

KRAS

V12G) blev sammenlignet ved ANOVA (3 måder) med en FDR (falsk opdagelse sats) sæt ved 0,05 til selektion for gener med ≥2 gange differentiel ekspression. Især P3 (CSCS fra begge genotyper) vs. Lin

– (bulk begge genotyper) og P3 vs P1 + P2 sammenligninger resulterede i betydelige forskelle og i definitionen af ​​to lister med differentielt udtrykte probe sæt (n = 1062 [851 ikke-redundante, kommenterede gener] og 746 [602 ikke-redundante, kommenterede gener] henholdsvis; Borde S3 og S4). På denne måde har vi identificeret en liste over 587 differentielt udtrykte probesæt fra skæringspunktet mellem Lin- vs. P3 og P1 + P2 vs. P3. De identificerede probe sæt svarer til 482 gener (ikke-redundante) (tabel S5).

Udtrykket profiler opnået fra CSC-berigede delpopulationer (Lin

-CD24

hiCD29

+) af begge genotyper (

Apc

1638N /+ og

Apc

1638N /+ /

KRAS

V12G) adskiller sig fra dem af mere differentieret (Lin

-CD24

medCD29

+ /CD24

loCD29

+) og Lin

– bulk-subpopulationer som tydeligt kan ses i den hierarkiske clustering (HCA) og principal komponent ( PCA) analyse (figur 3).

(a.) Hierarkisk klyngedannelse og (f.) Principal Components Analysis (PCA) (begge implementeret i Partek) af Lin

-CD24

hiCD29

+ (P3), Lin

-CD24

medCD29

+ /Lin

-CD24

loCD29

+ (P1 + P2, fusionerede port) og Lin

– ( bulk) tumorceller fra 5 individuelle mus af hver genotype (

Apc

1638N /+ og

Apc

1638N /+ /

KRAS

V12G). For bedre visualisering individuelle farver blev brugt for hver gruppe og i f. ellipsoider blev trukket rundt om de tre tumorer i

Især den

Apc

-. og

Apc

/

KRAS

-mutant genotyper er ikke løses ved HCA og PCA, muligvis på grund af det relativt begrænsede antal

Apc

1638N /+ og

Apc

1638N /+ /

KRAS

V12G tumorprøver (n = 5 for hver gruppe) ansat til den sammenlignende udtryk profilering analyse, utilstrækkelig til at fremhæve de angiveligt mere subtile forskelle mellem godartede og ondartede CSCS.

Dernæst fra ovennævnte lister over differentielt udtrykt prober mellem P3 og andre tumorcellepopulationer vi valideret ekspressionen af ​​i alt 35 gener ved kvantitativ realtids-PCR (tabel S2). Udvælgelsen af ​​validerede gener indbefatter, bortset fra den øverste op- og ned-regulerede gener, også yderligere medlemmer af den kanoniske Wnt signaltransduktionsvej, og gener vides at spille relevante roller i cancer. Generelt blev det store flertal af de udvalgte gener (33/35) valideret for deres differentielle ekspression af qPCR (figur S1).

Gene ontologi analyse [20] af skæringspunktet signatur afslørede en temmelig bredt spektrum af cellulær funktioner, strukturer og processer blandt de up-regulerede gener, herunder ekstracellulære matrix, celleadhæsion, orgel udvikling og morfogenese (tabel S6). Især analyse af generne udtrykkes forskelligt i CD24

hiCD29

+ celler fra

Apc

1638N /+ og

Apc

1638N /+ /

KRAS

V12G tumorer i sammenligning med bulk og mere differentierede tumorceller, afslørede adskillige biologiske processer, der kan spille funktionelle roller i kræft stemness. Først som også fremgår af den intracellulære akkumulering af aktiv β-catenin, flere mål og medlemmer af Wnt signalering kaskade udtrykkes forskelligt i P3 signatur herunder

Lgr5

,

MMP2

MMP7

,

DKK2

,

Pla2g2a

,

Prox1

,

Sox17

,

T Hotel (Brachyury),

Wif1

, og

Fzd5

. Tilstedeværelsen af ​​

Lgr5

blandt de opreguleres gener er af interesse, da det tyder på, at denne velkendte markør for normale cykling stamceller i musetarm [21] kan også repræsentere en nyttig CSC markør i muse intestinale tumorer nylig demonstreret ved afstamning opsporing [22]. Også transkriptionsfaktoren

Prox1

, en direkte og dosisafhængig mål for Wnt /β-catenin-signalvejen, blev opreguleret i P3 population.

Prox1

er tidligere vist sig at fremme dysplasi i colon adenomer og kolorektal cancer progression [23]. Men vi kunne ikke finde nogen signifikante forskelle mellem

Prox1

udtryk niveauer mellem

Apc

1638N /+ og

Apc

1638N /+ /

KRAS

V12G tumorceller i både de oprindelige microarray data og upon qPCR validering (Figur S1). Denne observation afspejler en mere generel mangel på signifikante forskelle mellem P3 populationer af

Apc

1638N /+ og

Apc

1638N /+ /

KRAS

V12G tumorer, som også fremgår af hierarkisk klyngedannelse og PCA-analyse (figur 3a og b, henholdsvis). I vores tidligere undersøgelse [14], udtryk profilering af bulk tumorer fra

Apc

1638N /+ og

Apc

1638N /+ /

KRAS

V12G mus heller ikke løse de to genotyper. Faktisk kunne kun det relative antal af tumorceller med nukleare β-catenin væsentligt at skelne mellem

Apc

1638N /+ fra

Apc

1638N /+ /

KRAS

V12G intestinale tumorer [14].

Udover Wnt, yderligere signalveje repræsenteres af de differentielt regulerede gener som vist ved differentiel ekspression af

BMP7

Bmper

(BMP signalering),

Fgfbp1

,

Fgfrl1

, og

Etv5

(fibroblast vækstfaktor receptorer, bindende proteiner og transkriptionsfaktorer), og

IGF1

,

IGFBP1

,

Igfbp5

, og

Igfbp7

(insulin-lignende vækstfaktorer og bindende proteiner).

Samlet set disse resultater viser, at CSCS fra

Apc

– og

Apc

/

KRAS

-mutant tumorer har forskellige udtryk profiler fra andre tumor cellepopulationer og er kendetegnet ved øget Wnt signalering aktivitet efter aftale med deres forstærkede niveauer af intracellulær β-catenin sammen med andre signalering pathays (BMP IGF), og ved ekspression af Paneth celle-specifikke gener.

diskussion

Mutationer i

APC

tumorsuppressorgen repræsenterer den primære igangsættende og hastighedsbegrænsende begivenhed i adenom-carcinom sekvens fører til tyktarmskræft i mennesket [1]. Tab af

APC

funktion fører til konstitutiv aktivering af den kanoniske Wnt /β-catenin signalvej kendt for at spille afgørende roller i reguleringen af ​​selv-fornyelse og differentiering i et bredt spektrum af vævsspecifikke stamceller nicher herunder den intestinale krypt og følgelig i indtræden af ​​mange cancertyper [24]. Konstitutiv Wnt signalering aktivering i tarmepitelet udløser adenom dannelse og er en nødvendig, men ikke tilstrækkelig, skridt for malign transformation. Somatiske mutationer i

KRAS

,

BRAF

,

TP53

, og

Smad4

normalt ligge til grund for yderligere progression af godartet tumor i lokalt invasiv adenokarcinom og metastase på fjerne organsteder [1]. Mutationer i endogene mus

Apc

gen også føre til tarm polyp dannelse, selvom primært placeret i den øvre mave-tarmkanalen. Især mus

Apc

-driven tarm adenomer ikke spontant akkumulerer

Kras

eller

TP53

somatiske mutationer og følgelig meget sjældent fremskridt til adenocarcinomer [12].

i vores laboratorium har vi skabt den

Apc

1638N /+ mus model kodning for en hypomorphic

Apc

mutation resulterer i få (5-6) øvre GI adenomer , længere overlevelse, og en øget risiko for spontan malign transformation dog kun i dyr ældre end 1 år [10], [11], [12]. I modsætning hertil sammensatte heterozygote

Apc

1638N /+ /

KRAS

V12G mus er karakteriseret ved øget tumor mangfoldigheden (~ 10 gange) og accelererede ondartet progression med størstedelen af læsioner bliver lokalt invasive adenokarcinomer [14]. Især onkogen aktivering af

KRAS-service /

Kras

på egen hånd er utilstrækkelig til at indlede tarm tumorigenese [25], hvis ikke med sen debut og ved somatiske inaktivering af

TP53

gen [13]. Derfor de dramatiske fænotypiske forskelle som følge af onkogen aktivering af

KRAS

gen i forbindelsen

APC

1638N /+ /

KRAS

V12G mus resulterer fra dens synergistisk virkning i forbindelse med fremme kanonisk Wnt signalering, som vist ved stigningen i TOP-Flash reporter aktivitet og i antallet af tumorceller øremærket ved akkumulering nuklear β-catenin [14].

den observerede relative stigning i antallet af

Apc

1638N /+ /

KRAS

V12G tumorceller øremærket af nukleare β-catenin er af betydning i betragtning af den såkaldte “β-catenin paradoks “[7]: uanset at tabet af

APC

funktion er fælles for alle tumorceller og forventes at resultere i den intracellulære og nuklear akkumulering af β-catenin, dette er kun observeret i et mindretal af cancerceller gennemgår en epitelial-til-mesenchymal overgang (EMT) og ikke-tilfældigt fordelt på den invasive foran tumormassen [4], [5] (se også fig. 2a). Denne observation førte til den hypotese, ifølge hvilken nukleare β-catenin øremærker stamceller-lignende intestinale tumorceller med højere Wnt signaleringsaktivitet i stand til at løsgøre fra den primære masse og effektivt formidle og indre i distal, vitale organer [6], [19], [26].

Her har vi forsøgt den kommende rensning af cancer stamceller (CSCS) fra

Apc

1638N /+ /

KRAS

V12G intestinale tumorer. Især tilstedeværelsen af ​​tumor-initierende celler, kunne ikke påvises i

Apc

1638N /+ tumorer. Ifølge den operationelle CSC definition, at nemlig deres kapacitet danne tumorer ved begrænsende fortynding transplantation i modtagende mus,

bona fide

CSCS er enten fraværende eller meget sjældne ( 10

-6) i tarm læsioner karakteristisk for

Apc

1638N /+ mus. I modsætning hertil malign transformation og accelereret adenom-carcinom sekvens som følge af gut-specifikke udtryk for onkogen

KRAS

resultat i etableringen af ​​en delpopulation af tumor-initierende celler (anslået som en på ca.. 7 × 10

4 bulk-tumorceller).

en. b.