PLoS ONE: Menneskelig Voltage-Gated Proton Channel HV1: en ny potentiel biomarkør for Diagnose og Prognose for kolorektal Cancer

Abstrakt

Solide tumorer findes i en hypoxisk mikromiljø, og besidder høj-glycolytiske metabolitter. For at undgå acidose, skal tumorceller udviser en dynamisk cytosolisk pH-regulering mekanisme (r). Den spændingsstyret proton kanal HV1 medierer NADPH oxidase funktion ved at kompensere cellulær tab af elektroner med protoner. Her viste vi for første gang, at HV1 ekspression er forøget i kolorektal tumorvæv og cellelinier, der er forbundet med dårlig prognose. Immunhistokemi viste, at HV1 stærkt udtrykkes i adenokarcinomer, men ikke eller ydmyge udtrykt i normal kolorektal eller hyperplastiske polypper. HV1 udtryk i kolorektal cancer er signifikant associeret med tumor størrelse, tumor klassificering, lymfeknude status, klinisk fase og p53 status. Høj HV1 udtryk er forbundet betydeligt med kortere samlet og tilbagefald overlevelse. Endvidere real-time RT-PCR og immuncytokemi viste, at HV1 er overudtrykt i de kolorektale cancercellelinjer SW620, HT29, LS174T og Colo205, men ikke i SW480. Hæmninger HV1 udtryk og aktivitet i de meget metastatiske SW620 celler ved små interfererende RNA (siRNA) og Zn

2+ henholdsvis markant formindske celleinvasion og migration, tilbageholdenhed proton ekstrudering og den intracellulære pH opsving. Vores resultater antyder, at HV1 kan anvendes som en potentiel biomarkør for diagnose og prognose af colorektal carcinom og et potentielt mål for anticancerlægemidler i kolorektal cancer terapi

Henvisning:. Wang Y, Wu X, Li Q, Zhang S, Li SJ (2013) Humant Voltage-Gated Proton Channel HV1: en ny potentiel biomarkør for Diagnose og Prognose for kolorektal cancer. PLoS ONE 8 (8): e70550. doi: 10,1371 /journal.pone.0070550

Redaktør: Rakesh K. Srivastava, The University of Kansas Medical Center, USA

Modtaget: Januar 27, 2013; Accepteret: 19. juni 2013; Udgivet: August 5, 2013 |

Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (31.271.464). Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

spændingsstyret proton kanal HV1 blev identificeret ved anvendelse bioinformatik søgninger baseret på kendte kationkanaler, som hovedsageligt udtrykkes i immunceller, såsom makrofager, neutrofiler og eosinofiler [1], [2]. HV1 i mammale fagocytter blev foreslået at være ansvarlig for proton-transport pathway’en, som regulerer intracellulær pH ​​under iltforbrug forbundet med fagocytose, kaldet “respiratory burst” [3], [4]. HV1 aktiveres ved depolarisering og intracellulær forsuring, hvis aktivitet fastholder intracellulær pH ​​neutral at holde reaktive ilt arter (ROS) generation [5], [6]. HV1 ikke kun regulerer pH i cytoplasmaet, men kan også give protoner i fagosomet, en lukket membran rum til at dræbe og fordøjelse af et patogen [3]. HV1 er yderst selektiv for H

+, uden nogen påviselig permeabilitet over for andre kationer [7], [8]. Spændingen aktivering forhold HV1 afhænger stærkt af både den intracellulære pH (pH

i) og ekstracellulær pH ​​(pH

o). Stigende pH

o eller sænkning pH

i fremmer H

+ -kanal åbning ved at flytte den tærskel aktivering til mere negative potentialer [3]. Endvidere HV1 strøm inhiberes af submillimolar koncentrationer af Zn

2+ og Cd

2+ og andre divalente kationer [9]

HV1 indeholder tre forudsagte domæner:. N-terminale syre og prolin- rige domæne, transmembrane spænding-sensor domæne (VSD), og C-terminale domæne. Spændingsafhængige K

+ -kanaler består af fire underenheder, som hver har en pore-domæne og et VSD. De fire pore domæner kommer sammen til et enkelt centralt pore, og fire perifere VSD styre porten af ​​pore [10]. I modsætning til den spændingsstyrede K

+ -kanaler, indeholder HV1 en VSD men mangler pore domæne. Nylige undersøgelser viste, at HV1 fungerer som en dimer, hvor den intracellulære C-terminale domæne er ansvarligt for den dimere arkitektur af proteinet, og hver underenhed indeholder sin egen proton-transporterende pathway [11] – [14]. Den intracellulære C-terminale domæne af HV1 danner en dimer via en parallel

α

helical coiled-coil og er afgørende for den proteinlokalisering [14].

Tumorceller findes ofte i en hypoxisk mikromiljø og besidder høj glykolytisk aktivitet og producerer sure metabolitter [15], [16]. At undgå acidose følge af reduktion i cytosolisk pH, skal tumorceller ekstrudere excessing cytosoliske protoner at opretholde cytosolisk pH, hvilket resulterer i sure tumormikromiljøet. Den hypoxiske og sure tumormikromiljøet spiller en central rolle i cancerudvikling, progression, og metastase [15]. Vores tidligere arbejde viste, at HV1 specifikt udtrykkes i højt metastatiske humane brysttumor væv og cellelinier, og fremmer brystcancer celle progression og metastase, gennem regulering brystcancercelle intracelular pH [17], [18]. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi ekspressionen af ​​HV1 i colorektale tumor- væv og cellelinier og dens potentielle association med klinisk-patologiske træk og post-resectional overlevelse. Hæmninger HV1 udtryk og aktivitet i de meget metastatiske kolorektal cancer celler markant nedsætte celleinvasion og migration, tilbageholdenhed proton ekstrudering. Vores resultater antyder, at HV1 overekspression kan anvendes som en uafhængig biomarkør for prognosen og diagnosen af ​​patienter med colorectal cancer.

Materialer og metoder Salg

etiske retningslinjer

Alle af de procedurer blev udført i overensstemmelse med Helsinki-deklarationen og relevante politikker i Kina. Vi opnåede det skriftligt informeret samtykke fra alle deltagere, der er involveret i vores undersøgelse. Godkendelsen undersøgelse opnåede etik for vores undersøgelse fra den etiske komité i Tonghua Center Hospital.

Patienter og prøver

kolorektal cancer vævsprøver blev opnået fra patienter, som gennemgik rutine helbredende kirurgi ved Institut for Kirurgi , Tonghua center Hospital mellem 2001 og 2007. patienterne blev ikke forbehandlet med strålebehandling eller kemoterapi før kirurgi. 139 kolorektal cancer væv og parrede tilstødende ikke-tumor colorektale væv blev fikseret i 10% formalin og indlejret i paraffin til immunhistokemisk analyse. De klinisk-patologiske træk ved disse patienter er vist i tabel 1. Derudover at kontrollere ekspressionen af ​​HV1 i præmaligne dysplastiske læsioner blev 10 normale colorektal, 18 hyperplastisk polyp og 20 adenom væv også undersøgt under anvendelse immunohistokemi. Hver patients kliniske status blev klassificeret i overensstemmelse med den patologiske tumorklassificering, tumorstørrelse, lymfeknude-status. Tumor differentiering blev gradueret af Edmondson grading system. Denne undersøgelse blev godkendt af den etiske komité for Tonghua Center Hospital, og informeret samtykke blev opnået fra hver patient.

Generering af en anti-HV1 polyklonale antistof

En anti-HV1 polyklonale antistof blev genereret mod den carboxylterminale domæne af HV1 (resterne 221-273 af HV1, KTRSERQLLRLKQMNVQLAAKIQHLEFSCSEKEQEIERLNKLLRQHGLLGEVN). Proteinet blev oprenset til homogenitet efter ekspression i

Escherichia coli

[19]. Det oprensede protein blev injiceret i mus og anti-HV1 polyklonalt antistof blev oprenset ved rPA Sepharose (GE, Healthcare) søjle. HRP-konjugeret ged anti-mus IgG’er blev købt hos Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. (West Grove, PA).

Ekspressionsvektor og transfektion

HV1 cDNA blev klonet ind i pEGFP-N1 (Clontech ) for at skabe HV1 ekspressionsplasmid pHv1-EGFP, fusioneres med den forstærkede grønt fluorescerende protein (EGFP) bundet til C-terminalen af ​​HV1 [14]. 293 T-celler blev dyrket i DMEM (Dulbeccos modificerede Eagles medium, GIBCO) med 10% føtalt bovint serum plus antibiotika (100 enheder /ml penicillin og 100 g /ml streptomycin, GIBCO) i en CO 5%

2 inkubator ved 37 ° C. Celler dyrket på dækglas ved 50-70% konfluens i en seks-brønds plade blev transient transficeret med pHv1-EGFP plasmid ved anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ved at følge fabrikantens protokol. Celler blev anvendt til eksperimenter 36-48 timer efter transfektion.

Western blotting

Western blotting blev udført med et anti-HV1 polyklonalt antistof (1 mg /ml) som beskrevet ovenfor med en slutfortynding af 1 1000. De denaturerede proteiner blev separeret ved 12,5% SDS-PAGE og derefter overført til en PVDF-membran (GE, Healthcare) ved befugtning elektroblotting enheder. Specifikt protein absorption blev forhindret ved anvendelse af 5% (vægt /volumen) skummetmælk i phosphatbufret saltvand indeholdende 0,1% Tween 20 (PBS-T) i 1 time. Primært antistof inkubation i PBS-T blev udført i 1 time ved stuetemperatur. HRP-koblet anti-muse-sekundært antistof blev anvendt i en slutfortynding på 1 15.000 i PBS-T, og HRP blev afsløret med et kemiluminescerende påvisningssystem (Millipore).

Immunhistokemi

Histologisk diagnoser af tumor-relaterede og ikke-tumor-relaterede formalinfikserede og paraffinindlejrede væv blev bekræftet i hæmatoxylin og eosin-farvede snit. Immunhistokemi blev udført med et anti-HV1 polyklonalt antistof. Den anti-HV1 antistof (1,0 mg /ml) blev fortyndet 100 gange med PBST (phosphatbufret saltvand indeholdende 0,1% Tween-20) indeholdende 1% (vægt /volumen) BSA. De paraffinindlejrede sektioner fyldt med 10 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) puffer (pH 8,0) blev opvarmet i en mikrobølgeovn i 12 minutter. Efter afkøling blev sektionerne behandlet med 0,5% Triton X-100 i PBS i 10 minutter, udsat for 3% (vol /vol) hydrogenperoxid (H

2O

2) i 10 minutter for at inhibere endogen peroxidaseaktivitet . Efterfølgende blev sektionerne inkuberet i PBST indeholdende 5% kalvefosterserum og 2% BSA i 30 min for at reducere ikke-specifik binding. Inkubation med primært antistof blev udført natten over ved 4 ° C i et fugtigt kammer. HRP-koblet anti-muse-sekundært antistof blev anvendt i en slutfortynding på 1 400 i 1 time. Endelig blev visualisering signal fremkaldt med diaminobenzidin (DAB) og objektglassene blev modfarvet i hematoxylin. Negativ kontrol blev udført for at behandle med ikke-immunt mus serum som det primære antistof i stedet for anti-HV1 antistof.

Farvede sektioner blev evalueret i et blindet måde uden forudgående kendskab til den kliniske oplysninger ved hjælp af tyske immunoreaktive score, immunreaktive-score (IRS). Kort fortalt IRS tildeler sub-score for immunoreaktiv distribution (0-4) og intensitet (0-3), så ganger dem til at give IRS score. Den procent positivitet blev scoret som “0” ( 5%), “1” (5-25%), “2” (25-50%), “3” (50-75%), “4” ( 75%). Den farvningsintensitet var score ifølge området af HV1-positiv farvning celler som “0, -” (negativ, 5%), “1, +” (svagt positiv, 5-25%), “2, ++ “(positive, 25-50%), og” 3, +++ “(stærkt positiv, 50%). Det endelige HV1 ekspression score blev beregnet ud fra værdierne af procent positivitet score og farvningsintensitet score, der blev varierede fra 0 til 12. Vi estimerede IRS ved midling af værdierne i otte felter på × 500 forstørrelse til hver prøve. HV1 udtryk niveauer blev defineret som følger: lav ekspression (score ≤3) og høj ekspression (score 3). Immunhistokemisk analyse og scoring blev udført af to uafhængige erfarne patologer.

Cell kultur

De humane kolorektale cancer cellelinjer SW620, HT29, LS174T, Colo205 og SW480 blev dyrket ved 37 ° C i en atmosfære af 95% luft og 5% CO

2 med DMEM suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin og 20 mM L-glutamin.

immuncytokemi

SW620, HT29, LS174T, Colo205 og SW480 celler dyrket på dækglas ved konfluens i seks-brønds vævskulturplader blev fikseret med 4% (vægt /volumen) paraformaldehyd i PBS ved stuetemperatur i 30 min, vasket i PBS, behandlet med 0,5% Triton X-100 i PBS i 20 min, udsat for 3% (vol /vol) hydrogenperoxid (H

2O

2) i 15 min, og blokeret med 5% føtalt bovint serum og 2% BSA i PBST i 20 minutter ved stuetemperatur. De blokerede dækglas blev inkuberet med anti-HV1 antistof (1,0 mg /ml) ved en fortynding på 1 200 med PBST indeholdende 1% (vægt /volumen) BSA ved 37 ° C i 1 time. Efter vask i PBS tre gange blev dækglassene inkuberet yderligere med HRP-koblet anti-muse-sekundært antistof ved en endelig fortynding på 1 400 i 1 time. Signaler blev visualiseret ved den HRP /DAB-system. Cellekernerne blev farvet med hematoxylin.

Kvantitativ realtids-PCR

mRNA ekspressionsniveauer af HV1 i SW620, HT29, LS174T, Colo205 og SW480 celler, blev vurderet ved kvantitativ realtids PCR under anvendelse af ABI PRISM 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA). Totale RNA’er blev ekstraheret ved anvendelse RNAiso Reagent (Takara), og revers-transskriberet af MMLV super transkriptase (Takara). Real-time kvantitativ revers transkription PCR blev udført med SYBR PrimeScriptTM RT-PCR Kit (Takara) ifølge producentens instruktioner. Primerne var som følger: HV1, 5′-CAGGTCATCATCATCTGCTTG-3 ‘(fremad) og 5′-CCGTTCTGAACGTGTCTTAAC-3′ (bagside); GAPDH, 5’-CCAAGGTCATCCATGACAAC-3 ‘(fremad) og 5′-AGAGGCAGGGATGATGTTCT-3’ (revers). PCR termiske tilstand anvendte var: 94 ° C i 30 s; annealing, 52 ° C i 30 s; forlængelse, 72 ° C i 30 s. Relative mRNA ekspressionsniveauer af proteiner blev beregnet ifølge ligningen: 2

-ΔΔCT, hvor ΔΔCT = (CT

HV1 – CT

GAPDH) – (CT

HV1 – CT

GAPDH )

SW620. Alle eksperimenter blev udført tredobbelt.

Immunofluorescens

SW620 og SW480-celler dyrket på dækglas blev fikseret med 4% (v /v) paraformaldehyd i phosphatbufret saltvand (PBS) ved stuetemperatur i 30 minutter, vasket i PBS, behandlet med 0,5% Triton X-100 i PBS i 20 min, og blokeret med 5% kalvefosterserum og 2% BSA i PBST i 1 time. De blokerede dækglas blev inkuberet med anti-HV1 antistof (1,0 mg /ml) ved en fortynding på 1 200 i 2% BSA ved 4 ° C natten over. Efter vask med PBS i 5 min i fire gange, blev dækglassene inkuberet yderligere i 1 time ved stuetemperatur med et FITC-konjugeret ged anti-mus IgG ved en fortynding på 1 400 i 2% BSA, efterfulgt af en anden vaskning som beskrevet ovenfor . Konfokale billeder af FITC fluorescens af SW620 og SW480 celler blev registreret på et Leica TCS SP5 konfokal mikroskopi (LEICA, Tyskland) med FITC-filtersæt til HV1 og DAPI filter indstillet til den nukleare DAPI farvestof. Billederne blev senere behandlet af Adobe Photoshop software.

Undertrykkende HV1 mRNA-ekspression

Sekvensen af ​​siRNA rettet mod HV1-genet var 5′-CTACAAGAAATGGGAGAAT-3 ‘, og den tilfældige sense-sekvensen var 5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3 ‘, som begge blev opnået fra Ribobio (Guangzhou, Kina) [17]. SW620-celler dyrket ved konfluens blev overført i 6-brønds plader ved 30% konfluens og inkuberet natten over, derefter transficeret med siRNA og den negative kontrol, henholdsvis ved hjælp af Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ifølge producentens protokol. Slutkoncentrationen af ​​siRNA var 100 nM. Silencing blev undersøgt 48 timer efter transfektion. Effektiviteten af ​​siRNA til undertrykkelse HV1 ekspression blev bestemt ved kvantitativ realtids-PCR, immunocytokemi og western blotting under anvendelse af anti-HV1 antistof som beskrevet ovenfor.

Migration kinetik

For at undersøge virkningen af ​​HV1 på den vandrende evne kolorektal cancer celler, vandringer SW620, SW480 og SW620 celler nedreguleret HV1 udtryk og hæmmede HV1 aktivitet ved siRNA og Zn

2+ henholdsvis blev vurderet i såret monolag model. Nedregulere HV1 ekspression blev SW620 celler dyrket til konfluens og transficeret med siRNA og negativ kontrol i 24 t. Til hæmning HV1 aktivitet blev 1 M ZnCl opløsning tilsat til DMEM medium til en slutkoncentration på 100 pM [1], [2]. De SW620 og SW480-celler blev plantet i en plade med 24 brønde (1,5 x 10

5 pr brønd) og dyrket i 24vh til sammenflydning og efterfølgende såret med en spids. Cell bevægelse blev observeret under fase-kontrast mikroskopi, og blev taget til fange med et digitalt kamera hver 12 timer.

Invasion og migration analyser

In vitro

invasion og migration assays var udført for at vurdere virkningerne af HV1 om invasive og vandrende evner SW620 og SW480 celler. SW620 og SW480-celler blev dyrket i seks-brønds plade i DMEM medium med 10% FBS ved konfluens transficeret med siRNA og negativ kontrol for henholdsvis 24 timer og derefter trypsineret, vasket og talt. For celleinvasion, transbrøndene med 8 um porestørrelsesfiltre (Millipore) blev dækket med matrigel (Becton Dickinson) og indsat i plader med 24 brønde. Og for celle migration, blev transbrøndene beklædt med matrigel. DMEM-medium (500 pi) indeholdende 10% FBS blev tilsat til det nederste kammer, og 200 pi af en cellesuspension (5 x 10

4 celler) blev anbragt i det øvre kammer. Pladerne blev inkuberet ved 37 ° C i fugtig atmosfære indeholdende 5% CO

2 i 24 timer. Til hæmning HV1 aktivitet blev 1 M ZnCl opløsning tilsat til DMEM medium til en slutkoncentration på 100 pM [1], [2]. De trængte celler er fastsat ved paraformaldehyd, farvet med krystalviolet løsning, og fotograferet. Hvert eksperiment blev udført fire gange. migration og invasion satser De blev beregnet som [migration celle Antal test /migration celle Antal kontrol

SW620] × 100% og [invasion celle Antal test /invasion celle Antal kontrol

SW620] × 100%, hhv.

aktivitet af HV1 kanal

aktiviteten af ​​HV1 i kolorektal cancer celler blev vurderet som en ændring i intracellulær pH ​​(pH

i) som svar til membran depolarisering ved BCECF fluorescens [11]. Cellerne blev inkuberet med 3,0 uM BCECF-AM (Molecular Probe) i serumfrit DMEM-medium i 30 minutter, henholdsvis og vasket med PSS-opløsning (140 mM NaCl, 5 mM KCI, 5 mM glucose, 1 mM CaClz

2, 1 mM MgCl

2, 20 mM Tris, pH 7,5) i 3 gange. Celler blev inkuberet med NH

4CL /NMDG (N-methyl-D-glucamin) opløsning (100 mM NMDG, 40 mM NH

4CL, 5 mM KCI, 5 mM glucose, 1 mM CaCI

2, 1 mM MgCl

2, 20 mM Tris, pH 7,3) i 20 minutter og vasket ved ammonium fri opløsning (140 mM NMDG, 5 mM KCI, 5 mM glucose, 1 mM CaCI

2, 1 mM MgCl

2, 20 mM Tris, pH 7,4), hurtigt at inducere intracellulær forsuring [5]. Membrandepolarisering blev opnået ved at fylde høj K

+ opløsning (145 mM KCI, 5 mM glucose, 1 mM CaCI

2, 1 mM MgCl

2, 20 mM Tris, pH 7,5). Intracellulær pH ​​ændrer syre-loaded celler blev detekteret ved fluorescerende probe BCECF ved excitationsbølgelængder på 490 nm og 440 nm og en emissionsbølgelængde på 525 nm under membranen depolariserende tilstand ved hjælp RF-5301PC Spectrofluorophotometer (Shimadzu, Japan).

målinger af intracellulær pH ​​

intracellulært pH blev målt ved anvendelse af pH-følsomme fluorescerende probe BCECF-AM. Celler dyrket i monolagene inkuberet med 3,0 uM BCECF-AM (Molecular Probe) i bicarbonat-frit DMEM-medium ved 37 ° C i 30 minutter. Efter påsætning blev cellerne vasket tre gange med HEPES-buffer til fjernelse af ekstracellulære farvestof, og bringes til at forblive i den samme buffer. The HEPES buffer indeholdt 140 mM NaCI, 5 mM KCI, 1 mM magnesiumsulfat

4, 1 mM CaCI

2, 1 mM NaH

2PO

4, 5,5 mM glucose og 20 mM HEPES, pH 7.4. Den fluorescens ved excitationsbølgelængder på 490 nm og 440 nm blev optaget ved en emission bølgelængde på 525 nm med RF-5301PC Spectrofluorophotometer (Shimadzu, Japan). Kalibrering af fluorescens versus pH blev udført ved ligevægt af ekstern og intern pH med nigericin (10 uM) i en høj K

+ buffer med en række pH fra 5.5 til 8,0. Den høje K

+ buffer indeholdt 145 mM KCI, 5 mM glucose, 1 mM CaCI

2, 1 mM MgCl

2, og 20 mM HEPES (eller MES). De relative fluorescensforhold værdier blev plottet mod tilsvarende pH

i-værdier, som tillod bestemmelse af ukendte pH

i.

Statistisk analyse

Alle statistikker blev udført ved hjælp SPSS16.0 software. Måling data blev repræsenteret som middelværdi ± SD. Sammenligning af middelværdien mellem grupperne blev udført ved

t

test.

P

værdier 0,05 blev anset for signifikante. Overlevelse analyse blev vurderet ved hjælp Kaplan-Meier-metoden og overlevelsesraten blev sammenlignet med log-rank test.

Resultater

Clinicopathologic fund

Clinicopathologic profiler fra de 139 sager udvalgt til dette undersøgelsen blev revideret i tabel 1. Den gennemsnitlige alder af patienterne var 62,4 år (range, 36-76), herunder 68 mænd og 71 kvinder. Placeringen af ​​deres kræftformer var 29 venstre-sidet og 43 højresidig kolon, og 47 rektum tilfælde hhv. Blandt de 139 resektion sager, den primære tumor størrelse varierede som følger: 5 cm i 72 sager, og ≥5 cm i 67 tilfælde. Tyve af 139 tumorer udviste ringe cytologisk differentiering. Tumoren omfang var begrænset (T1 eller T2) i 45 sager og avanceret (T3 eller T4) i 94 tilfælde. Tumormetastase til lymfeknuderne blev observeret i 59 ud af 139 tilfælde.

Forøget ekspression af HV1 i colorektal cancer

HV1 udtrykt i immunceller er associeret med “respiratorisk burst” [3], [ ,,,0],4], men dens funktion i tumorigenese er ikke blevet identificeret. For at undersøge HV1 til brug som en potentiel biomarkør og terapeutisk mål for kolorektal cancer, HV1 udtryk i 139 kolorektal cancer væv og parrede normale væv, 10 normal kolorektal, 20 kolorektal adenom og 18 hyperplastiske polyp væv, blev detekteret ved anvendelse immunhistokemi med en anti-HV1 polyklonalt antistof, der blev genereret i huset. For at undersøge specificiteten af ​​antistoffet, blev 293 T-celler transficeret med pHv1-EGFP ekspressionsplasmid. Og ekspressionen af ​​HV1-EGFP blev påvist ved immunocytokemi og western blotting med antistoffet, og EGFP fluorescens. Resultaterne viste, at antistoffet specifikt genkender HV1 og EGFP er en markør for HV1 ekspression (fig. 1A og B).

A blev 293 T-celler transficeret med pHv1-EGFP plasmid og observeret af en Leica TCS SP5 omdrejningspunkt mikroskopi. a, observation af EGFP fluorescens. HV1-EGFP fluorescens er repræsenteret i grøn. B, anti-HV1 immunfluorescens (TRITC bølgelængder) (rød). c, at DAPI-farvet visualisere kerner (blå). d, billede fusionerede er sammensat af EGFP fluorescens, anti-HV1 immunfluorescens, og DAPI-farvet. B, 293 T-celler blev transficeret med pcDNA3.1-vektor og pcDNA-HV1 plasmidet hhv. Og HV1 blev detekteret ved western blotting. C, HV1 udtrykkes i kolorektale kræft væv. en (100 ×) og b (500 ×), c (100 ×) og d (500 ×), normal kolorektale væv; e (100 ×) og f (500 ×), adenom væv; g (100 ×) og h (500 ×), i (100 ×) og j (500 ×), k (100 ×) og l (500 ×), kolorektal cancer væv. I normale kolorektale væv, hyperplastiske polypper og kolorektal adenom væv, farvningen var negativ eller svagt positiv. I tumorvæv, iagttoges intens immunreaktivitet til HV1. HV1 er hovedsageligt observeret i plasmamembranen (h, j og l) (som angivet ved pilespidser). Den HV1 er farvet i brunt, mens baggrunden kerner er i blåt.

Som vist i fig. 1C og tabel 2, HV1 farvning primært moderat eller stærk positiv i kolorektal cancer væv, men ikke i normal kolorektal og hyperplastiske polyp væv. HV1 blev hovedsageligt observeret i plasmamembranen af ​​tumorceller i colorektale væv, som vist i fig. 1C (h, j og l) (som angivet ved pilespidser). I kolorektale adenom væv, farvningen var negative eller svagt positive (Fig 1C, e og f,. Tabel 2). HV1 i kolorektale cancer væv var signifikant udtrykt sammenlignet med i normal kolorektal, hyperplastiske polypper og adenom væv, hvilket tyder på, at HV1 kan være involveret i kolorektal tumorigenese. Samlet, 106 af de 139 (76,3%) patienter viste høj ekspression HV1 i tumorvæv (IRS end 3), mens 33 (23,7%) af tilfældene viste lav ekspression (IRS 0-3). Generelt HV1 densitet var signifikant højere i cancervæv end i adenom væv (7,20 ± 3,25 versus 2,20 ± 2,12) (tabel 2).

High HV1 ekspression er associeret med en dårlig prognose

korrelationer mellem HV1 udtryk og clinicopathologic karakteristika er sammenfattet i tabel 3. Der var signifikante sammenhænge med dybden af ​​tumor klassifikation (

P

= 0,007), alder (

P

= 0,021) , tumorstørrelse (

P

= 0,000), lymfeknude status (

P

= 0,000), klinisk fase (

P

= 0,000) og p53 status (

P

= 0,014) hos patienter, der havde høj HV1 udtryk i forhold til patienter, som havde lav HV1 udtryk. Der var ingen signifikant sammenhæng mellem HV1 udtryk og de øvrige kliniske funktioner, såsom køn, differentiering og Ki-67-ekspression. Desuden korrelationerne mellem ekspressionsniveauerne af p53, Ki-67, TopoII, GST-π og P-gp og clinicopathologic karakteristika blev vist i tabel 4. p53 status relateret til tumor klassifikation (

P

= 0,011 ), Ki-67 til differentiering (

P

= 0,010), TopoII til differentiering (

P

= 0,010), og GST-π til tumorstørrelse (

P

= 0,007) og differentiering (

P

= 0,000). Desværre fik P-gp viser ikke statistisk signifikans med clinicopathologic parametre.

Kaplan-Meier overlevelseskurver viste, at patienter, som havde høj HV1 udtryk var mere tilbøjelige til at have en kortere samlet overlevelse (

P

= 0,008, fig. 2A) og tilbagefald overlevelse (

P

= 0,008, fig. 2B) sammenlignet med patienter, som havde lav HV1 udtryk, hvilket tyder på, at HV1 overekspression kan være forbundet med en dårlig klinisk prognose. Patienter, som havde høj HV1 udtryk havde en dårlig gentagelse overlevelse (

P

= 0,008) sammenlignet med patienter, som havde lav HV1 udtryk (univariat analyse) (tabel 5). Samlet overlevelse undersøgt af Cox univariat analyse viste også, at høj ekspression af HV1 var signifikant associeret med kortere overlevelse (

P

= 0,008). Univariate Cox regression analyser viste, at HV1 ekspressionsniveauet blev signifikant associeret med recidiv-fri og samlet overlevelse, mens andre kliniske karakteristika mistet deres prædiktive betydning. Desuden analyser multivariat Cox regression viste, at høj ekspression af HV1 var uafhængig risikofaktor for samlet overlevelse (relativ risiko [RR] = 0,443,

P

= 0,015) og tilbagefald overlevelse (RR = 0,427,

P

= 0,026) (tabel 6). Patienter, som havde høj ekspression af HV1 var tilbøjelige til at have en tidlig tilbagefald sammenlignet med patienter, der havde lavt udtryk for HV1 (37,4 ± 3,0 vs 47,2 ± 10,7,

P

0,008). (Tabel 5)

de patienter med lav udtryk har længere samlet og sygdomsfri overlevelse end patienter med høj ekspression. Vejviser

Fordeling af HV1 i humane kolorektale cellelinjer

for at undersøge, om HV1 også udtrykkes i humane kolorektale cancer cellelinjer, blev ekspressionen af ​​HV1 i humane kolorektale cancer cellelinjer, SW620, HT29, LS174T, Colo205 og SW480, påvist ved immunocytokemi og real time RT-PCR. Som vist i fig. 3, ekspressionsniveauerne af HV1 blandt disse kolorektale cancercellelinjer har signifikant forskel. HV1 er udtrykt på et højt niveau i SW620, HT29, LS174T, og Colo205 celler, men ikke i SW480 celler. Lokaliseringen af ​​HV1 i SW620-celler blev bestemt ved en konfokal mikroskopi. Som vist i fig. 3C, HV1 er højt udtrykt i SW620-celler, som er lokaliseret i både intracellulære steder og plasmamembranen (som angivet ved pile), hvorimod HV1 er næppe udtrykkes i SW480-celler. Det resultat, at HV1 ekspression er højere i SW620-celler end i SW480-celler er identisk med resultaterne fra immuncytokemi (fig. 3A) og real time RT-PCR (fig. 3B).

A, HT29 (a , 200 ×), LS174T (b, 200 ×), Colo205 (c, 200 ×), SW480 (d, 200 ×), SW620 (e, 200 ×) og SW620 (f, 500 ×) påvist ved immuncytokemi. B, mRNA ekspressionsniveauer af HV1 i SW620, HT29, LS174T, Colo205 og SW480 celler anslået ved kvantitativ realtids-PCR. Værdier er middel ± SD (

n

= 3). *

P

0,05 sammenlignet med SW620 celler. C, SW620 (a, b og c) og SW480 (d, e og f) celler dyrket på dækglas ved konfluens i en seks-brønds vævskulturplade blev farvet med anti-HV1 antistof og observeret af en Leica TCS SP5 konfokal mikroskopi . a og d, anti-HV1 immunfluorescens (FITC, grønne). B og E, DAPI-farvet for at visualisere kerner (blå). c og f, motiver fusionerede er sammensat af anti-HV1 immunofluorescens og DAPI-farvet. HV1 observeres i plasmamembranen og intracellulære sites i de stærkt metastatiske SW620-celler (som angivet ved pile), men ikke i de dårligt metastatiske SW480 celler. D, ekspression af HV1 i HT29, SW620 og SW480 celler, blev detekteret ved western blotting. Nedregulering af HV1 udtryk blev udført af siRNA målrettet HV1 (HT29-si, SW620-si og SW480-si).

Hæmning af HV1 aktivitet nedsætter invasion og migration i stærkt metastatiske kolorektal cancer celler

invasion og migration er to fremtrædende kendetegn ved tumor malignitet. For at evaluere bidrag HV1 til invasive og vandrende potentiale i kolorektal cancer celler, vi udførte invasion og migration assays. Først undersøgte vi kinetikken af ​​vandrende evne SW620, SW480 og HT29-celler. Fig. 4A, B og C viste migrationen kinetikken for SW620 (fig. 4A), SW480 (fig. 4B) og HT29 (fig. 4C) celler. En såret monolag af SW620-celler tilladt for sårlukning efter 48 timer (fig. 4A, a, b, c, d og e). SW620 og HT29 (fig. 4C, a, b, c, d og e) celler lukket såret dramatisk hurtigere end SW480 celler (fig. 4B, a, b, c, d og e). For at nedregulering af HV1 ekspression og inhibering af HV1 aktivitet, siRNA targeting HV1 og en slutkoncentration på 100 uM ZnC

2 [1], [2] blev anvendt henholdsvis. De effektivitetsgevinster af HV1 knock-down med siRNA i SW620, SW480 og HT29-celler blev vurderet ved western blotting, som viste en reduktion i HV1 protein niveauer upon siRNA knockdown i SW620 og HT29-celler (Fig. 3D). Undertrykkelse af HV1 ekspression af siRNA (f, g, h, i og j i fig. 4A, B og C) og HV1 aktivitet efter 100 uM ZnC

2 (k, l, m, n og o i fig. 4A Som vist i fig. Som vist i fig. Som vist i fig.