PLoS ONE: Integreret Exon Level Expression Analyse af driverindstillinger Gener forklare deres rolle i kolorektal Cancer

Abstrakt

Integreret analyse af genomiske og transkriptom niveauændringer rummer lovende for en bedre forståelse af kolorektal cancer (CRC) biologi. Der er et relevant behov for at forklare den funktionelle virkning af ændringer genom niveau ved at integrere de oplysninger afskriften niveau. Brug høj opløsning cytogenetik array, vi havde tidligere identificeret driver gener ved ‘Genomisk Identifikation af væsentlige mål i Cancer (transportcenter) “analyse af parrede tumor-normal prøver fra patienter med tarmkræft. I dette studie analyserer vi disse driver gener på tre niveauer ved hjælp af exon array-data – gen, exon og netværk. Genniveau analyse afslørede en lille delmængde at opleve differentiel ekspression. Disse resultater blev forstærket ved at udføre separate differential udtryk analyser (SAM og LIMMA). ATP8B1 viste sig at være den hidtil ukendte gen associeret med CRC, der viser ændringer på cytogenetiske, gen- og exon niveauer. Splice indeks på 29 exoner svarende til 13 gener viste sig at ændres væsentligt i tumorprøver. Driver-gener blev anvendt til konstruktion af regulatoriske netværk for tumor og normale grupper. Der var omrokeringer i transkriptionsfaktor gener tyder tilstedeværelse af lovgivningsmæssige switching. Den regulerende mønster af AHR genet viste sig at have den mest betydningsfulde ændring. Vores resultater integrere data med fokus på føreren gener resulterer i højt beriget nye molekyler, der har brug yderligere undersøgelser for at fastslå deres rolle i CRC

Henvisning:. Aziz MA, Periyasamy S, Al Yousef Z, AlAbdulkarim I, Al Otaibi M , Alfahed A, et al. (2014) Integreret Exon Level Expression Analyse af driverindstillinger Gener forklare deres rolle i tyktarmskræft. PLoS ONE 9 (10): e110134. doi: 10,1371 /journal.pone.0110134

Redaktør: Osman El-Maarri, University of Bonn, Institut for eksperimentel hæmatologi og transfusion medicin, Tyskland

Modtaget: Februar 20, 2014 Accepteret: September 16, 2014; Udgivet 21. oktober, 2014

Copyright: © 2014 Aziz et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev finansieret af kong Abdullah International Medical Research center gennem forskningsbevilling RC10 /083 tildelt MAA. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

der er et væld af oplysninger på omik niveau, der associerer cytogenetik og genekspression skifter fører til kolorektal cancer (CRC). Integrationen af ​​genekspression og kopiantal (CN) data til identifikation DNA KN ændringer, der inducerer ændringer i ekspressionsniveauerne af de tilhørende gener er en almindelig opgave i cancerpatienter undersøgelser [1] – [3]. Den centrale dogme for molekylær biologi er således blevet behandlet på to vigtige niveauer. Der har været mange rapporter, der beviser ændringer på genomet niveau i form af kopi nummer aberration [4], enkelt nukleotid polymorfier, tab af heterozygositet der forsøger at forstå de molekylære begivenheder, der er forbundet med kolorektal cancer. Disse somatiske eller arvelige forandringer har anden mekanisme til at bidrage til indvielse og progression af CRC. Tab og gevinst på afgørende kromosomale regioner, der fører til sletning eller forstærkning af kræftrelaterede gener er meget veletableret. Den funktionelle betydning af disse molekylære begivenheder er blevet målt under anvendelse af forskellige værktøjer og algoritmer. Gener er omfattet af somatiske kopi-nummer ændringer (SCNAs), især spille centrale roller i onkogenese og kræftbehandling [5]. Flere værktøjer er blevet stillet til rådighed for at vurdere potentialet i gener, der bliver berørt af SCNAs i forårsager tyktarmskræft. ‘Genomisk Identifikation af væsentlige mål i kræft «(transportcenter) værktøj har med succes været anvendt til at identificere’ Driver SCNAs ‘baseret på frekvens og amplitude af observerede hændelser [6], [7]. Det andet aspekt af ændringer sker i tumorceller er på transkriptionsniveauet. Differentiel ekspression analyse er blevet udført for at finde ud vigtige gener spiller en rolle i at forårsage kolorektal cancer. Der kan være flere mekanismer, hvormed de SCNA påvirkede gener udøver deres effekt på funktionsniveau. Amplificeringer og deletioner i genomiske region er afspejlet i de transkriptniveauer og kunne påvises ved at udføre udtryk microarray baserede undersøgelser. Ved at anvende exon arrays, opnår vi ekstra dimension af begivenheder sker på exon niveau, hvilket kan føre til alternativ splejsning resulterer i forskellige gen-isoformer. Alternativ splejsning er et afgørende skridt i dannelsen af ​​protein mangfoldighed og observeres sin fejlagtig regulering i mange mennesketyper kræft [8].

søgen efter at udforske forholdet mellem kopi nummer ændringer og ekspressionsniveauet af berørte gener /exoner har modtaget begrænset succes på grund af en række årsager [9]. Teknologiske forbedringer i array design for cytogenetik samt transcriptomics har forbedret nøjagtighed og præcision af de data, der genereres. Ved at kombinere dette med bedre analytiske teknikker og algoritmer, muligheder for at finde målgener ansvarlig for at forårsage kolorektal cancer har yderligere øget.

seneste årtier har set en søgen efter at finde nye gener, der kan tjene som terapeutiske mål eller biomarkører. Men gener eller proteiner ikke fungere alene, men interagerer med hinanden til dannelse af netværk eller veje for at udføre biologiske funktioner [10]. Netværk tilgange til at finde biomarkører tættere repræsenterer

in vivo

molekylærbiologi, hvor en forstyrrelse i et gen kan påvirke mange nedstrøms gener. Kræft er således med rette blevet behandlet som en systembiologi sygdom [11] i modsætning til sygdomme forårsaget af ændringer i nogle gener eller mutationer. Rekonstruktion gen regulerende net hos raske og syge væv er derfor afgørende for at forstå kræft fænotyper og udarbejde terapi [12].

Med tilgængeligheden af ​​værktøjer og teknikker til at indfange de molekylære ændringer sker på forskellige stadier af det centrale dogme med øget præcision og nøjagtighed, vi endnu at udvikle en integreret omfattende billede, der kunne hjælpe os med at finde bedre mål for tarmkræft. I den foreliggende undersøgelse, vi sigter mod at integrere information fra cytogenetisk analyse med exon niveau udtryk data ved hjælp af parrede normal-tumor prøver fra patienter med tarmkræft. Et sæt af driver gener foreslået af transportcenter analyse (betegnes som ‘driver gener’ fra nu og fremefter) blev forespurgt på gen, exon og netværk niveau. Både DNA og RNA til cytogenetik og transkriptomisk undersøgelser, henholdsvis blev ekstraheret fra det samme væv i en enkelt arbejdsgang at minimere variation. Denne undersøgelse giver evidens for at forklare forskellige mulige mekanismer, hvorved SCNA ramte chauffør gener kan udøve deres funktionelle virkninger. En undergruppe af chauffør gener viste sig at vise ændringer gen niveau i udtryk. De fleste af disse gener oplyste også ændringerne exon niveau resulterer i dannelsen af ​​forskellige isoformer. Netværk af transportcenter gener viste et klart skift i transkriptionsfaktorer (TF) regulering. ATP8B1 genet blev fundet at have nye forening med colorectal cancer ved cytogenetisk, gen og exon niveau.

Materialer og metoder

Undersøgelsen er godkendt af den etiske komité og Institutional Review Board (IRB) for Kong Abdullah International medicinsk Research center efter behørig gennemgang af de etiske aspekter af forslaget. De nødvendige proceduremæssige og etiske samtykkeerklæringer blev underskrevet af hver patient forud for prøvetagning.

Prøvetagning og RNA-ekstraktion

Prøvetagning blev udført som tidligere [13] beskrevet. Type og stadium af alle patientprøver er tilvejebragt i tabel S1. Undersøgelsen blev godkendt af institutionel gennemgang bord efter en retfærdig rettergang. Patienterne blev givet samtykke, og de poster vedligeholdes på en godkendt måde. RNA blev ekstraheret fra det samme stykke væv, der blev anvendt til at ekstrahere DNA til cytogenetiske undersøgelser i en enkelt arbejdsgang. Maceherey Nagel trio prep kit (Tyskland) blev anvendt til at ekstrahere DNA og RNA i den samme protokol. Kvalitet og kvantitet blev kontrolleret ved hjælp NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, USA).

Exon microarray

GeneChip Menneskelig Exon 1.0 ST Arrays sammen med WT Terminal Mærkning og Controls Kit og hybridisering, Vask, og Stain kit blev opnået fra Affymetrix USA. Ambion WT Expression Kit blev opnået ved Ambion, USA. 31 Tumor og 29 normale prøver fra 32 patienter blev behandlet. Dataene blev ekstraheret ved hjælp af Expression Console-softwaren fra Affymetrix, USA. Kvalitetskontrol blev udført ved hjælp af Principal Component Analysis (PCA) og Integromics biomarkør suite (TIBCO Spotfire). Alle data er deponeret i GEO-database med et stammesamlingsnummer GSE50421.

Dataanalyse

Før der udføres nogen gen /exon-niveau analyse, principal komponent analyse (PCA) blev udført for at identificere outliers. Data fra 4 normale prøver og 7 tumorprøver blev efterfølgende fjernet.

Dataanalyse specifikt med chauffør gener

Gene niveau analyse.

Til kontrol ekspressionsniveauer af 144 driver gen liste genereret af transportcenter analyse (13) anvendte vi to forskellige software – Expression konsol og AltAnalyze [14]. To forskellige software blev brugt til at bekræfte vores resultater ved hjælp af uafhængige metoder. Signalgivere estimater var afledt af CEL filer af 60 prøver (29 normale og 31 tumor) under anvendelse Robust Multi-Array Gennemsnit (RMA) til normalisering af data. De centrale exon niveau probe sæt blev brugt til at sammenfatte genekspressionsniveauer.

Den samme liste over 144 driver gener med udtryk værdier beregnet ved hjælp af “Altanalyze« blev brugt til følgeslutning baseret (GENIE3) vej /netværksanalyse.

Exon niveau ekspression analyse.

Altanalyze program blev anvendt til at evaluere alternativ splejsning i førerens gener. Den rå data blev filtreret til fjernelse probesæt, der blev anset for at være ikke-udtrykte. En splejsning score for filtrerede exoner blev beregnet ved hjælp af splejsning index metode og exon /intron /splejsning anmærkning blev tildelt til disse resultater. En splejsning indeks p-værdi afskæring på 0,05 blev anvendt til at filtrere alternative exon resultater. AltExonViewer – en del af Altanalyze og DomainGraph – en Cytoscape plugin blev brugt til at visualisere splejse indeksværdier og alternativt splejsede exoner. Den splejsning (SI) blev beregnet som beskrevet i [15]. Kort fortalt SI er log

2 forhold af normaliserede intensiteter af tumor og normale prøver. I vores analyse “prøve 1” i tælleren var normal og “prøve 2 ‘i nævneren var tumor.

Kausal netværksanalyse.

For netværksanalyse, viden og inferens tilgange blev brugt . For inferens fremgangsmåder, GENIE3 [16], [17] blev anvendt til at generere regulatoriske netværk genet for tumor og normale prøver. For at generere netværket blev driver gener klassificeret som TF gener og målgener. Selvom 1000 interaktioner udledes for hver af gruppen, en interaktion score 0,1 blev valgt som en cut-off værdi. Ved hjælp af denne information de regulerende netværk blev uafhængigt udledes til tumor og normale prøver ved hjælp Cytoscape.

Dataanalyse med hele probeset

Integromics Biomarkør Discovery Suite.

For at finde forskelligt udtrykte gener i vores datasæt, uden forudgående bias, data fra CEL filer blev analyseret ved hjælp af Integromics software (TIBCO Spotfire, USA) rørledning til Affymetrix exon 1.0 ST arrays. Fraktil normalisering blev udført efter fjernelse af outliers hjælp PCA. Begge Betydning Analyse af microarrays (SAM) og lineære modeller for microarray data (LIMMA) analyser blev udført med en cut-off på 0,01 for justeret p-værdi og fold ændring af 1 eller -1. To forskellige endnu gratis metoder blev brugt til at gøre vores resultater mere selvsikker. Gene ontologi berigelse blev udført på en liste over 760 differentielt udtrykte gener opnået fra LIMMA analyse.

Opfindsomhed pathway Analysis.

Liste over 760 gener fra SAM /LIMMA analyse gøres ved hjælp Integromics blev brugt til udføre “kerne” og “biomarkør ‘analyser. Core analyse blev udført som beskrevet før [13]. For biomarkør analyse følgende filtre er anvendt: Overvej kun molekyler, hvor (arter = Menneskelige) og (væv /cellelinjer = KM-12 ELLER HCT-116 ELLER RKO ELLER tyktarmskræft cellelinjer ikke er anført Colo205 ELLER HT29 ELLER HCC-2998 OR HCT-15 ELLER SW-480 eller andre Colon cancer cellelinjer eller væv og primære celler ikke andet er angivet eller SW-620) oG (sygdomme = cancer) oG ((biomarkør applikationer = Alle biomarkør Applications) og (biomarkør sygdomme = tyktarmskræft OR koloncarcinom ELLER kolon neoplasme ELLER kolorektal adenom ELLER kolorektal cancer ELLER kolorektal karcinom))

resultater

analysen strategi fører til følgende resultater er illustreret i figur 1a .. b

A) er kategoriseret i fire hele analyser stadier fra “data Generation ’til’ Network analyser”. B) Analyse strategi ved hjælp af forskellige programmer vises i dette diagram. Der er tre elementer i analysen – Gene, Exon og netværk håndteres af forskellige programmer. Gene niveau analyser udføres med ‘Affymetrix, Expression /Transkriptomet analyse konsol “og” Tibco Spotfire «. Exon-niveau analyse foretages af ‘AltAnalyze «og» Affymetrix elværktøj’. Netværk analyser beskæftiget ‘GENIE3’, ‘IPA “og” Cytoscape «. ‘Nexus Copy Number’ er et program, der bruges i tidligere undersøgelser med tiden generere en liste over 144 driver gener.

En lille delmængde af gener identificeret ved transportcenter viser en væsentlig ændring i udtrykket niveau.

Vi studerede ekspressionsmønstre af driver gener på gen-niveau ved hjælp AltAnalyze og Expression Konsol software. Disse analyser produceret gratis resultater og gav en liste med 20 gener, der viste sig at have en betydelig fold ændring på mere end to og en p-værdi 0,01 [Tabel 1]. 9 gener oplevet en nedregulering. BCAS1 med højeste transportcenter score på 5,323 var blandt de mest markant nedreguleret gener. 11 gener viste en opregulering med IL6 og INHBA viser den højeste fold forandringer [Figur 2a (AltAnalyze), 2b (Expression Console)]. Fold ændre værdier af alle 144 driver gener er givet i tabel S2.

To forskellige algoritmer blev anvendt til at måle ekspressionsniveauer værdier fra Exon array-data til at understøtte resultaterne. AltAnalyze (1a) og Expression Console (1b) viser gratis resultater med maksimal ændringer observeret i BCAS1, INHBA, IL6 og MUC4 generne.

Tre markant ned regulerede gener (BCAS1, ABP1 og AGR3 ) findes i amplificerede områder af genomet henviser opreguleret HTRA1 blev fundet primært i områder af tab. Disse gener oplevet en ændring i deres transkriptionsfaktor i tumor og normale prøver [Tabel 2].

Differentiel ekspression analyse under anvendelse tumor-normal parrede prøve data i exon arrays fra 32 patienter blev udført. Efter at have fjernet outliers hjælp PCA [Figur 3], 25 normale og 24 tumor prøver blev fundet egnede til yderligere analyser. Vi beskæftigede ikke-parametrisk (SAM) og parametriske (LIMMA) metoder og fundet gratis resultater. 6242 gener blev differentielt udtrykt med korrigeret p-værdi på 0,01. 760 gener viste sig at være forskelligt reguleret (fold forandring 1 eller -1), hvoraf 15 gener var fælles med chauffør gener fra transportcenter analyse [Figur 4a-c og figur S1]. BCAS1, AURKA, ATP8B1, IL6 og INHBA var de differentielt regulerede gener fundet at være blandt topscorerne i listen over driver gener.

60 prøver fra 32 patienter blev udsat for PCA og outliers blev fjernet. 4 normale og 7 tumor prøver blev fjernet fra den endelige analyse.

(a) Venn-diagram af fælles gener blandt transportcenter, SAM og LIMMA analyser. Alle gener blev kommenteret og sammenlignet under anvendelse IPA ‘sammenligne’ funktion. 43 gener fra Integromics analyser blev ikke kortlagt af IPA.15 gener er udbredt blandt alle tre analyser. (B) arkiveret lodret fold ændring søjlediagram af LIMMA analyse. I alt 6242 gener blev have justeret p-værdi 0,01, hvoraf 759 viste signifikant fold ændring ( -1 eller 1). (C) Volcano plot viser meget betydelige gener (pink = nedreguleret, appelsin = opreguleret) i form af p-værdi og fold forandring.

Væsentlige ændringer i isoform udtryk udstillet af gener identificeret ved transportcenter analyse .

Exon-niveau analyse af 144 driver gener blev udført. 29 exons tilhører 13 gener viste sig at have væsentlige ændringer i isoform udtryk som afspejles i deres splejsning index score [Tabel 3]. Mens exon E25-1 af MUC4 og E3-2 af PTP4A3 udviste høje negative SI-værdier, exon E2-2 af IL6 og E21-2 af ADAM12 udviste høje positive SI-værdier. Negative SI værdier angiver exons er beriget i tumorprøver og springes over eller undertrykt i normale prøver og vice versa for positive SI-værdier. For MUC4 gen, exons E25-1, E2-2, E2-1, I4-6 og I3-6 der negative SI værdier og exon E8-1 indspillet en positiv SI-værdi. Exon E2-2 og E4-3 af IL6 indspillet positive SI værdier. [Figur 5 ai-ii bi-ii og figur S2]. Exon i MYLK og ANK3 viste signifikant ændring i splejsning mønster, men viste ikke en signifikant fold ændring i genekspression værdi. Microarray Påvisning af alternativ splejsning (MIDAS) p-værdi intervallet 0,01-0,04 blev observeret i de filtrerede resultater.

Exon ekspression (i) og splice indeks (ii) værdier blev kortlagt til både tumor- og normale prøver til tyve ni exoner påvirker tretten gener. Exon 25-1 of MUC4 genet (a) viser størst negativ splejsning indeksværdi (a ii) henviser exon 2-2 af IL6 (b) viste største værdi af 2,44 (b ii). Exon udtryk og splejse indeksværdier for hvile 27 exons leveres som supplerende figur 1.

årsagsnet analyse viser tænder i transkriptionsfaktorer i tumorprøver.

Causal Network analyse displays skifte i transkriptionsfaktorer i tumorprøver. Den væsentligste påvirkning af TF gener i tumor og normale prøver blev afspejlet i ændringen i antallet af rettet kanter [Tabel 4]. CHAF1A, AHR, PRPF4B, ZNF200, SMAD2, RUVBL1, Smad4, TSHZ1, CTCFL og CEBPE var blandt de øverste indflydelsesrige. Den lovgivningsmæssige hierarki mellem disse grupper ændret sig med hensyn til TF’er. Mens RUVBL1 omdannet til en mester regulator i tumorer, har TSHZ1 mistet sin evne til at mestre regulere andre gener i tumorer [Figur 6a]. Betydelig omlejring i modulopbygning er også observeret mellem disse to grupper. Flere målgener fungere som moduler i tumorer som observeret i moduler, der reguleres af AHR, CHAF1A og PRPF4B. Der er endvidere væsentlig regulerende krydstale blandt generne i den normale gruppe [Figur 6b]. Mens tumorer har mistet skalafrie egenskaber i sin lovgivningsmæssige interaktion, normal gruppe udviser omtrentlige skalafrie ud graders distributioner, der betyder potentialet i TF til at regulere væld af målgener. De tumorer viser ikke denne type regulering, der indikerer envejs foder frem regulerende funktion.

En hierarkisk netværk topologi bruges til at visualisere grader af interaktion mellem transkriptionsfaktor gener og målgener. (A) Den udledte netværk for tumor gruppe viser RUVBL1 som master regulator. (B) udledte netværk for normal gruppe viser TSHZ1as mester regulator.

Funktionel analyse af differentielt udtrykte gener bekræfter deres rolle i tyktarmskræft og afsløre vigtige veje og biomarkører.

Gene ontologi berigelse af 760 differentielt udtrykte gener opnået fra SAM /LIMMA analyser viste celledeling, mitose og celleadhæsion at være de mest betydningsfulde biologiske processer påvirket [figur S3]. Opfindsomhed pathway analyse af 760 gener viste kræft og gastrointestinal sygdom blandt de øverste funktioner efterfulgt af cellevækst bevægelse og spredning [Figur 7a]. NF-kB signalering, cellecyklus G

2 /M DNA beskadigelse checkpoint regulering, kolorektal cancer metastaser var blandt de bedste scoring veje efterfulgt af agranulocyte vedhæftning [figur 7b]. TGFB1 var blandt de øverste opstrøms regulatorer. Netværk analyse tyder MYC, MMP og IL6 gener som vigtige knudepunkter [Fig 7c-e]. Biomarkør analyse afslører 28 molekyler er relevante for tarmkræft [Tabel 5]. INHBA, CLDN7 og MUC4 var kvalificeret som biomarkører og er fælles med transportcenter, SAM og LIMMA analyserer resultater.

Core-analyse under anvendelse IPA blev udført ved anvendelse sæt af 760 gener, der blev differentielt udtrykt i tumorprøver. Vigtige biologiske funktioner (a) veje (b) og netværk (ce) blev afsløret ved denne analyse.

Diskussion

I dette studie vi forsøger at forstå transskription niveau ændringer i driver gener ramt af SCNAs i kolorektal cancer. Vi forespørges disse gener fra tre perspektiver ved hjælp af gen /exon /netværk niveau analyseværktøjer. Vores integrerede analyse på genomiske /transkriptom niveauer resulterede i at finde gener af høj prioritet, der kan eksperimentelt studeres at etablere deres rolle i tyktarmskræft. Funktionel betydning af differentielt udtrykte gener bekræftede resultatet af vores analyser.

På grund af den manglende adgang til høj opløsning cytogenetiske arrays store størrelse af kromosomale regioner var impliceret i forårsager tyktarmskræft gennem kopital ændringer. De kommercielle SNP genotype-arrays fokusere på varianter, der er til stede i 5% eller mere af befolkningen, og de har et begrænset antal CNV prober. Derfor er sub mikroskopiske strukturelle varianter dårligt fanget af tilgængelige SNP genotypebestemmelse arrays, der var designet til at evaluere SNPs. Den nylige indførelse af Affymetrix CytoScan HD Array (CNV målrettet array), som er baseret på den validerede genom-Wide Menneskelig SNP Array 6.0 og indeholder mere end 2,6 millioner markører for kopi nummer varianter og ca. 750.000 SNP’er, har gjort det muligt påvisning af kopital aberrationer med høj opløsning i hele genomet [18]. Data fra denne platform blev brugt til at få en liste over driver gener, som således kunne anses for at være mest præcis og nøjagtig. Tidligere resultater fra forskellige grupper fører ofte til en høj grad af uoverensstemmelse med et overlap på 5% i visse tilfælde. Transportcenter analyse var i stand til at løse dette problem og skelne mellem passager- og driver mutationer med en høj grad af præcision og nøjagtighed [6]. Korrelationen mellem ekspression og CN data er meget kompleks [19] og er i høj grad påvirket af den type platform, der anvendes til at indsamle de data samt de strategier analyse. Vores analyse til mindskelse af de forstyrrende faktorer. Vi ekstraherede DNA /RNA fra det samme stykke væv i en enkelt protokol [20]. Vi brugte matchet parret tumor-normal kontrol, som er nok den bedste måde at gøre en sammenlignende undersøgelse [21]. Adskillige metoder er blevet anvendt til kræft-gen prioritering af integrativ analyse [22], [23]. Vi ansat en modificeret fremgangsmåde i to trin ved at filtrere kræft gener ved hjælp transportcenter og derefter udført exon udtryk analyse.

Gene niveau.

Effekten af ​​kromosomale ændringer er ikke altid direkte. Global forstærkning på genomisk niveau ville resultere i højere udtryk for udvalgte gener [9]. Vores genniveau analyse viste kun 20 af 144 driver gener at opleve væsentlig ændring på transkriptionsniveauet. 5 af disse gener var opført blandt de bedste scoring driver gener. Vores resultater korrelerer fokale amplifikationer med øget ekspressionsniveauer og er blevet rapporteret tidligere bruger vifte CGH (aCGH) for FGFR2, Gnas og AURKA gener [24]. Med en gennemsnitlig amplikonstørrelse på 4,56 Mb, kunne det være vildledende at indberette alle berørte gener /ikke-kodende regioner være forbundet med CRC. FAM46C, EGFR2 og IL6 gener fra vores analyse er også blevet opført i den opdaterede kræft gen folketælling [5], [25]. BCAS1 gen, der scorede højest i transportcenter analyse blev tidligere rapporteret at gennemgå alternativ splejsning og nedregulering [26], som er i overensstemmelse med vores resultater. Opregulering af human SLC7A11 mRNA i stromale fibroblastceller fra levermetastaser er associeret med metastatisk kolorektal cancer i human [27]. PTP4A3 rapporteret at være signifikant opreguleret i denne undersøgelse er for nylig blevet impliceret i colon tumorigenese [28]. ATP8B1 er det gen, der endnu ikke er blevet rapporteret at have nogen sammenhæng med kolorektal cancer og ville være et vigtigt molekyle for yderligere undersøgelser.

Vores differentiel ekspression analyse af tumorvæv og normalt exon array-datasæt ved hjælp af to uafhængige værktøjer (SAM og LIMMA) viste et overlap på 15 gener med føreren gener. Analyse af 44.000 sonder resulterer i differentielt udtrykte gener giver en fordomsfri tilgang og giver yderligere tillid til listen over overlappende gener. Både LIMMA og SAM tilgange genereret samme resultater på det funktionelle niveau som det fremgår af Ingenuity Pathway Analysis (IPA).

ABP1, AGR3 og BCAS1 viste nedregulering trods forstærkning på genomet niveau. Dette understøttes af tidligere undersøgelser for BCAS1in MCF7 cellelinje [29]. Vi observerede, at indflydelsen af ​​Smad4 transskriptionsfaktor blev tabt i tumorceller og kan være ansvarlig for denne observation. Lignende ændringer i transkriptionsfaktorer blev observeret for to andre gener, der angiver skift opførsel som beskrevet nedenfor.

Exon niveau.

Exon niveau analyse til måling af genekspression ændres, er udfordrende, men givende. Selv de forbedrede algoritmer har begrænsninger i at yde absolutte kvantificering af afskriften niveauer. Tidligere metoder har fundet exon niveau data til at være mere informative om arten og omfanget af udskrifter [30]. Nu med den viden, at mere end 90% af alle gener undergår alternativ splejsning for at frembringe mere end én transkript til et gen, er potentialet i exon niveau data realiseres mere end nogensinde [31] – [33]. Gene centreret tilgang til udførelse integreret analyse under anvendelse aCGH og exon-array data har givet mere af bekræftende resultater og mangler anvendelse af fulde potentiale i hele genomet arrays [34]. FGFR2 genet blev vist at blive amplificeret og opreguleret som er vildledende på grund af den afkortede form af FGFR2. Wt FGFR2 genet blev ikke målt, og dermed kunne ikke sammenlignes med vores undersøgelse [34].

Exon niveau studier i kolorektal cancer har været få og udføre flere begrænsninger i form af analyse af data. Mange af disse undersøgelser sammenlignet tumor og normal fra forskellige kilder [35]. Vores resultater viser en delmængde af differentielt udtrykte gener at opleve ændring i splejsningsmønster. 29 exoner tilhører 13 gener viste signifikant splejsning (SI) og midas p-værdier. Begge værdier er stærke indikatorer til at måle alternativ splejsning. MUC4 er meget kendt for at undergå alternativ splejsning og forårsage kræft [36], men det alternativ splejsning af IL6 er hidtil ukendt i association med CRC. ADAM12 der scorede en høj SI-værdi har været impliceret tidligere i lungekræft [37]. 5 gener (ACTN1, CALD1, SLC3A2, CTTN og fn1) tidligere rapporteret som forskelligt splejset [38] er blevet fundet i den vores undersøgelse samt, som brugte en anden analysestrategi.

ANK3 er kendt for at anvende alternative transskription starte steder i kolorektal cancer [8] og kunne også være den mekanisme for andet gen MYLK som vi ikke kunne se en betydelig ændring i gen-niveau ekspression.

Netværk niveau.

Veje analyse har blevet brugt til at måle relevansen af ​​de ramt af CNAs gener ved at skabe netværk mellem dem [1]. Men disse net begrænsede i deres brugbar fortolkning grund af fraværet af retningsbestemthed. Vores kausale netværksanalyse giver flere nyttige oplysninger om de involverede i disse netværk gener. Vi observerede en signifikant forskel i antallet af målgener mellem tumor og normal. I tilfælde af gener, der findes i det amplificerede region, men blev nedreguleret observerede vi et tab af transkriptionsfaktoren regulering, hvorimod i opreguleret genet findes i den deleterede region der var en switch i transskriptionsfaktoren. Fra listen over føreren gener vi valgte transkriptionsfaktorer og studerede deres adfærdsændring i tumorprøver. AHR er etableret som et tumorsuppressorgen i colon og andre kræftformer [39]. Denne undersøgelse forklarer yderligere styrkede rolle AHR af det øgede antal udgående (mål) gener i tumor. Vores undersøgelse dokumenterer, at TSHZ1 mister sin rolle som master regulator i normale celler, mens RUVBL1 antager, at rollen. Disse giver interessante muligheder for mekanistiske studier af netværk /veje ramt i CRC. Det er blevet forudset ved hjælp af integrerede undersøgelser, at mange forskellige genomiske ændringer potentielt dys-regulerer de samme veje i komplekse sygdomme [40]. Yderligere undersøgelser af de lovgivningsmæssige ændringer niveau i denne undersøgelse vil være i stand til at etablere dette koncept i CRC.

Funktionel rolle differentielt udtrykte gener og identifikation af MYC, MMP og IL6 som vigtige knudepunkter i de berørte netværk giver kundeemner, der skal valideres for at etablere deres tilknytning til CRC. Biomarkører, især MUC4 vil være et vigtigt molekyle for at studere mekanistisk og etablere deres anvendelse i kliniske undersøgelser. Denne undersøgelse giver rigdom af analyserede data og en beriget liste af gener, der kan tjene som potentielle spor til at forstå biologi kolorektal cancer.

Støtte oplysninger

figur S1.

Betydningen af ​​microarray analyse. SAM analyse blev udført ved hjælp Integromics biomarkør opdagelse suiter på alle prøver. Resultaterne var gratis til LIMMA analyse som afspejles i antallet af differentielt udtrykte gener

doi:. 10,1371 /journal.pone.0110134.s001

(TIF)

Figur S2.

Splice indeks og exon udtryk grunde til resterende 11 gener. Splice indeks og exon udtryk værdier af alle 13 gener, der blev fundet signifikant blandt de driver gener blev plottet. Sammenligning af ‘Normal’ og ‘Tumor “prøver er afbildet for at observere ændringen i splejse indeks samt udtrykket mønster på exon niveau

doi:. 10,1371 /journal.pone.0110134.s002

(DOCX)

Figur S3.

biologiske processer berigelse diagram for differentielt udtrykte gener. Denne bar plot viser de differentielt udtrykte gener (som fås fra Integromics) er beriget i tre funktioner nemlig, celledeling, mitose og celle vedhæftning

doi:.. 10,1371 /journal.pone.0110134.s003

(PNG)

tabel S1.

typer og stadier af alle patientprøver anvendt i undersøgelsen

doi:. 10,1371 /journal.pone.0110134.s004

(DOCX)

tabel S2.