PLoS ONE: Proton-Sensing kræft i æggestokkene G-protein-koblede receptorer 1 på dendritiske celler er nødvendig for Airway Svar i en murin Astma Model

Abstrakt

Ovariecancer G-protein-koblede receptorer 1 (OGR1) stimulering af ekstracellulære protoner forårsager aktivering af G-proteiner og efterfølgende cellulære funktioner. Men de fysiologiske og patofysiologiske roller OGR1 i luftvejsresponser stort set ukendt. I den foreliggende undersøgelse viser vi, at OGR1-deficiente mus er resistente over for de kardinalpunkter ved astma, herunder luftvejs eosinofili, luftvejshyperreaktivitet (AHR), og bægercelle metaplasi, i association med en bemærkelsesværdig inhibering af Th2 cytokin og IgE-produktion, i en ovalbumin (OVA) -induceret astma model. Intratracheal overførsel til vildtypemus af OVA-primede knoglemarvafledte dendritiske celler (DC’er) fra OGR1-manglende mus udviklede lavere AHR og eosinofili efter OVA inhalation sammenlignet med overførslen af ​​de fra vildtypemus. Migration af OVA-pulserede DCs at peribronchial lymfeknuder blev også hæmmet af OGR1 mangel i vedtagelsen eksperimenter. Tilstedeværelsen af ​​funktionelle OGR1 i udviklingslandene blev bekræftet af ekspression af OGR1 mRNA og OGR1-sensitive Ca

2+ respons. OVA-induceret ekspression af CCR7, en moden DC kemokinreceptor, og migration reaktion på CCR7 ligander i et in vitro Transwell assay blev svækket ved OGR1 mangel. Vi konkluderer, at OGR1 på DC’er er kritisk for migration til afdrypning lymfeknuder, som igen, stimulerer Th2 fænotype forandring og efterfølgende induktion af betændelse i luftvejene og AHR

Henvisning:. Aoki H, Mogi C, Hisada T, Nakakura T, Kamide Y, Ichimonji I, et al. (2013) Proton-Sensing kræft i æggestokkene G-protein-koblede receptorer 1 på dendritiske celler er nødvendig for Airway respons i en Murine Astma Model. PLoS ONE 8 (11): e79985. doi: 10,1371 /journal.pone.0079985

Redaktør: Bernhard Ryffel, franske Nationale Center for Videnskabelig Forskning, Frankrig

Modtaget: August 20, 2013; Accepteret: 7 oktober 2013; Udgivet: 11. november 2013 |

Copyright: © 2013 Aoki et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Grant-in-Støtte til videnskabelig forskning (B) (til FO), Grant-in-Støtte til Udfordrende sonderende forskning (til FO), Grant-in-Støtte til videnskabelig forskning (C) (til TI og CM), og Grant-in-Aid for Unge Forskere (B) (til HA) fra Japan Society for fremme af Science (JSP’er). Dette arbejde blev også støttet delvist af den fælles forskningsprogram af Institut for Molekylær og Cellulær forordning, Gunma Universitet (12023) (til TN). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Allergisk astma er en Th2-lymfocyt-medieret inflammatorisk luftvejssygdom kendetegnet ved eosinofili, forhøjet slimproduktion ved slimceller, og luftvejshyperreaktivitet (AHR) [1,2]. Disse astmatiske reaktioner medieres af Th2-cytokiner, herunder IL-4, IL-5 og IL-13; IL-5 spiller en vigtig rolle i differentiering, rekruttering og aktivering af eosinofiler og IL-4 og IL-13, anses for at være involveret i kørsel af IgE syntese fra B-celler, bæger celle metaplasi og AHR. Makrofager og neutrofiler også ophobes i den inflammatoriske læsion. Dendritiske celler (DC’er) er antigenpræsenterende celler og spiller en central rolle i adaptive og medfødte immunrespons. Ved antigen eksponering ved epithelet, DC’er vandrer til drænende lymfeknuder og har vist sig at være nødvendig til induktion af Th2 responser på mange antigener ved at stimulere naive T-celler under sensibilisering samt fastholde adaptive Th2-celle respons [1,2].

Det er velkendt, at astma er associeret med luftvejene forsuring og nåede pH 5,2 under strenge astmatiske tilstande [3-5], på grund af ophobning af inflammatoriske celler i peribronchial og perivaskulære rum, hvor stimulering af glykolyse og respiratorisk burst kan forårsage produktion af lactat og protoner [6]. Under en sådan alvorlig sur pH, proton-sensing capsaicin-følsomme TRPV1 kanal og /eller syre-sensing ionkanaler i sensoriske nerver er blevet foreslået at være involveret i initiering og udvikling af astmatiske symptomer [4,7].

Nylige undersøgelser har vist, at OGR1-familie G-proteinkoblede receptorer (GPCR’er), herunder OGR1, G-protein-koblet receptor4 (GPR4), og T-celledød associerede gen 8 (TDAG8), som tidligere var foreslået som receptorer for lysolipider, såsom sphingosylphosphorylcholine (SPC), fornemmer ekstracellulær forsuring gennem histidinrest [8-10], hvilket resulterer i stimulering af en række intracellulære signalveje via heterotrimere G-proteiner [11-13]. OGR1 kobles med phospholipase C og Ca

2 + signalveje og medierer en række sure pH-inducerede aktioner i luftvejenes glatte muskelceller [14-16] og andre celletyper [17,18]. Desuden OGR1 har vist sig at blive udtrykt i epitelceller [19], makrofager [20], og neutrofiler [21]. Således er OGR1 potentielt involveret i patogenesen af ​​astmatiske reaktioner. Imidlertid roller OGR1 i induktionen af ​​kardinalpunkter responser i luftvejsinflammation er endnu ikke blevet rapporteret, in vivo. I den foreliggende undersøgelse viser vi, at OGR1-deficiente mus er resistente over for luftvejene eosinofil inflammation og AHR i forhold til vildtype (WT) mus i det mindste delvist gennem ændringen i DC migration aktivitet.

Materialer og metoder

Etik Statement

Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med retningslinjerne i Animal Care og eksperimenter Komité Gunma Universitet og alle dyr blev opdrættet i Institute of Animal Experience Research af Gunma Universitet. Protokollen blev godkendt af Animal Care og eksperimenter Komité Gunma University (Permit nummer: 11-019). Alle operation blev udført under natrium pentobarbital anæstesi, og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse.

Mus

Vi har for nylig genererede OGR1-mangelfulde C57BL /6 mus [22]. Hunmus med en målrettet forstyrrelse af OGR1 (

OGR1

– /-

mus) blev tilbagekrydset i ti generationer over på en BALB /c genetiske baggrund. BALB /c

OGR1

– /-

mus og deres søskende (

OGR1

+ /+

eller WT) blev anvendt ved 5-6 uge af alder. Mus blev huset under specifikke patogenfrie betingelser og vedligeholdes på en OVA-fri diæt.

Sensibilisering og Airway Challenge

OGR1

– /-

OGR1

+ /+ Hotel (eller WT) mus blev tildelt til de følgende to grupper: PBS /PBS gruppe eller kontrolgruppen, intraperitoneal sensibilisering med PBS og luftveje udfordring med PBS, og OVA sensibilisering /udfordring gruppe, intraperitoneal sensibilisering med OVA og luftveje udfordring med OVA. Sensibilisering og udsættelse for OVA blev udført som beskrevet [23]. Kort fortalt blev mus sensibiliseret ved injektioner af 10 ug OVA (Grade V) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), sammen med 1 mg aluminiumhydroxid (Alu-Gel-S; SERVA, Heidelberg, Tyskland) anvendes som en adjuvans i 0,2 ml, på dag 0 og 14. Mus blev efterfølgende udfordret via luftvejene ved eksponering inhalation til aerosoler af OVA (1% i PBS) i 20 minutter på dag 28, 29, og 30. på dag 32, luftvejsresponser blev evalueret.

AHR

AHR blev målt ved både indirekte noninvasive og direkte invasive metoder i mus 48 timer efter den sidste OVA udfordring. Ved indirekte noninvasive metode [24], blev reaktivitet til metakolin vurderet i hele kroppen plethysmografen (Buxco Electronics, Inc., Troy, NY). Kort fortalt blev saltvand eller methacholin givet ved aerosol gennem et indløb af kammeret i 3 min. Aflæsninger blev initieret ved 3 min og fortsat i 10 min. Spidsværdierne af 5-min gennemsnit forbedret pause (Penh) blev bestemt. Penh er defineret som en vurdering af ændringer i form af luftstrømmen mønster ind og ud en hel-krop flow plethysmograph som et dyr ånder. Data er udtrykt som procent ændring fra baseline værdier opnået efter inhalation af saltvand. Der var ingen signifikante forskelle i baseline værdier blandt de forskellige grupper. For invasiv måling af lungemodstand blev mus bedøvet, tracheostomized, og mekanisk ventileret. AHR blev vurderet ved måling af ændringer i lungemodstand (RL) som reaktion på inhaleret methacholin, som tidligere [25] beskrevne. Data er udtrykt som procent ændring fra baseline RL-værdier opnået efter inhalation af saltvand. Der var ingen signifikante forskelle i baseline værdier blandt de forskellige grupper i begge metoder. Salg

bronchoalveolær lavage (BAL)

Mus blev givet en dødelig dosis af pentobarbital (60 mg /kg ip), og lungerne blev udskyllet med 1 ml portioner af Hanks balancerede saltopløsning (HBSS) gennem trakeostomi. Udskylningsvæsken blev centrifugeret (300 x g i 10 minutter ved 4 ° C), og BAL-væsken supernatant blev opbevaret ved -80 ° C før efterfølgende assay. Cellepelleten blev resuspenderet i 1 ml HBSS. Totale celletællinger blev udført ved tilsætning af 50 pi af cellesuspensionen til 50 pi Kimura pletten, og cellerne blev talt i et Neubauer kammer under lysmikroskopi. Differentielle celletællinger blev foretaget på cytospinpræparater fremstillet ved centrifugering ved 500 rpm i 5 min og farvning med May-Grunwald-Giemsa farve. Celler blev identificeret som makrofager, neutrofiler, eosinofiler og lymfocytter i henhold til standard morfologi. Tre hundrede celler blev talt under × 400 forstørrelse, og procentdelen og absolutte antal af hver celletype blev beregnet.

Histologisk Studies

lungesnit fra forskellige eksperimentelle grupper mus blev fremstillet og analyseret som tidligere beskrevet [26]. Kort fortalt blev efterladt lunger fikseret i 4% paraformaldehyd og indlejret i paraffin. Sektionerne (4 um) blev farvet med periodisk syre-Schiff (PAS) til identifikation af mucus-secernerende celler (slimceller) i luftvejene og modfarvet med hæmatoxylin. De farvede slimceller blev optalt i stor kaliber preterminal bronkier mindst tre lungesnit opnået fra hvert dyr. Længden af ​​basal lamina af tilsvarende bronkie blev målt af Image J (National Institutes of Health). Dataene blev udtrykt som middelværdien af ​​PAS positive slimceller i bronkie pr millimeter af basalmembranen. Graden af ​​peribronchial og perivaskulær betændelse (Inflammation score) blev evalueret på en subjektiv skala fra 0 til 3, som beskrevet [27]. Tre uafhængige blindede efterforskere gradueres betændelse score. En værdi på 0 fik når ingen inflammation var påviselig, blev en værdi på 1 tildeles til lejlighedsvis infiltration med inflammatoriske celler, blev en værdi på 2 tildelt til de fleste bronkier eller fartøjer omgivet af et tyndt lag (en til fem celler tykt) af inflammatorisk celler og en værdi på 3 blev givet, når de fleste bronkier eller fartøjer blev omgivet af en (mere end fem celler tyk) af inflammatoriske celler tykt lag.

Generation of Bone Marrow-Afledt DCs (BMDCs)

DCs blev genereret fra knoglemarvsceller af WT eller

OGR1

– /-

mus ifølge fremgangsmåden beskrevet tidligere [28]. Kort fortalt blev knoglemarvsceller opnået fra lårben og skinneben af ​​mus anbragt i RPMI 1640 medium (pH 7,4) indeholdende 10% FBS med rekombinant muse GM-CSF (10 ng /ml; R R Men vi bemærket, at effekten af ​​OVA puls på ekspressionen af ​​CCR7 er svækket. Vi brugte derfor kommercielt tilgængelige RPMI 1640 medium uden yderligere buffer agenter i in vitro eksperimenter med undtagelse af på kort sigt Ca

2+ respons som vist nedenfor. Når mediet pH blev ændret, blev HCl eller NaOH tilsat til dyrkningsmediet.

Adoption Eksperimenter med BMDCs

Dette blev udført som beskrevet [30]. Kort fortalt blev BMDCs fremstillet af WT eller OGR1-defekte mus sensibiliseret med OVA eller dets køretøj (PBS) 24 timer inden vedtagelsen eksperimenter. OVA-pulserede BMDCs (1 x 10

6 celler i 40 pi PBS) blev inddryppet ind i WT-mus gennem luftrøret. Ti dage senere blev mus udsat for aerosoliseret OVA (1% i PBS) i 20 min /dag i tre på hinanden følgende dage; 48 timer efter den sidste udfordring blev AHR vurderet og BAL-væsken blev opnået. Således vedtaget eksperimentet lov til at konstatere væsentlige astmatiske reaktioner på 14 dage, hvilket er meget kortere end den tid (32 dage), der kræves til påvisning af luftvejsresponser ved regelmæssig in vivo OVA sensibilisering /udfordring protokol. Dette kan skyldes in vitro effektiv sensibilisering af DC’er med OVA i jævn- adoption eksperimenter.

BMDC Migration Assay in vivo

For at undersøge fordelingen af ​​injiceret BMDCs, celler blev fremstillet fra WT eller OGR1-deficiente mus og pulset med PBS eller OVA som beskrevet ovenfor. Cellerne blev mærket med 10 ug /ml carboxyfluorescein-diacetat succinimidylester (CFSE) (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) i 10 minutter ved 37 ° C i RPMI 1640 indeholdende 0,5% BSA (fraktion V) (Sigma-Aldrich) . Fire grupper af mærkede celler (PBS-behandlede WT DC, PBS-behandlede OGR1-mangelfuld DC, OVA-behandlede WT DC, og OVA-behandlet OGR-1 mangelfuld DC) blev indpodet intratrakealt i 3 naive WT mus per hver gruppe. De peribronchial lymfeknuder fra 3 mus blev opsamlet for hver gruppe og CFSE

+ DC’er migrerer i peribronchial lymfeknuder i 96 timer blev analyseret ved flowcytometri, som tidligere [30] beskrevne. Lignende eksperimenter blev udført 3 gange. Migration aktivitet blev udtrykt som en procentdel af CFSE

+ udviklingslandene (CFSE

+ CD11 c

+) pr totale celler anvendt.

DC migration aktivitet blev yderligere evalueret af en trædepudeassayet, hvori OVA-pulserede BMDCs blev mærket med CFSE som beskrevet og celler blev injiceret subkutant i trædepuden af ​​WT mus. Migreringen af ​​cellerne ind popliteale lymfeknuder blev analyseret ved flowcytometri 24 timer efter injektionen af ​​cellerne. Salg

Måling af cytokiner og IgE

Cytokinniveauer i BAL-væsken blev målt ved Bio-Plex Suspension Array System (Nippon Bio-Rad Laboratories, Tokyo, Japan) for IFN-γ, IL 4, og IL-5 og ved ELISA kit (eBioscience, San Diego, CA) for IL-13, ifølge producentens instruktioner. Plasmaniveauer af OVA-specifikke IgE blev målt ved DS muse IgE ELISA (OVA) kit (DS Pharma Biomedical, Osaka, Japan), som tidligere beskrevet [23].

Måling af mRNA’er

Total RNA blev isoleret og revers-transkriberet under anvendelse af tilfældig priming og Multiscribe revers transkriptase (Applied Biosystems, Foster City, CA). MRNA’erne blev målt ved en kvantitativ real-time TaqMan PCR med Mx3000P Real-time PCR System (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) under anvendelse af specifikke prober til OGR1 (Mm01335272), TDAG8 (Mm00433695), GPR4 (Mm00558777), G2A (Mm00490809 ), CCR7 (Mm01301785), og GAPDH (4352932E), som tidligere beskrevet [14].

Måling af Intracellulær Ca

2+ Koncentration

De ikke-pulserede BMDCs blev høstet fra 10-cm retter med 4 mM EDTA /PBS og mærket med fura2 /AM. Intracellulær Ca

2+ koncentration ([Ca

2 +]

i) blev målt i cellesuspensionen under forsigtig omrøring betingelse i HEPES-bufret medium baseret på ændringen i fura-2-fluorescens som tidligere beskrevet [14 ]. The HEPES-bufret medium bestod af 20 mM HEPES (pH 7,4), 134 mM NaCl, 4,7 mM KCI, 1,2 mM KH

2PO

4, 1,2 mM MgSO

4, 2 mM CaCl

2 , 2,5 mM NaHCO

3, 5 mM glucose og 0,1% BSA. PH af mediet blev indstillet ved tilsætning af en passende mængde af HCI.

flowcytometri

BMDCs blev farvet med PE-konjugeret monoklonale antistoffer (mAb’er) fortyndet i PBS indeholdende 1% BSA ( FACS-buffer). PE-konjugeret Ab’er, herunder anti-CD11c og anti-CCR7, og isotypekontrol blev opnået fra BD Biosciences, San Diego, CA. Efter inkubation med Abs i 10 min ved 4 ° C blev celler vasket to gange med FACS buffer og analyseret ved ®FACScan flowcytometer bruge CellQuest software (Becton Dickinson, Mountain View, CA).

In vitro Migration Assay

På dag 7, WT eller

OGR1

– /-

BMDCs blev inkuberet med eller uden OVA (100 ug /ml), som beskrevet ovenfor. Efter 24 timer blev dyrkede celler høstet og resuspenderet i RPMI 1640-medium ved pH 7,4 med 0,1% BSA. Celler (4 x 10

5) blev tilsat på toppen af ​​en Transwell kultur insert med en 8 mm diameter og 5-um porestørrelse chemotaxicell (Kurabo, Osaka, Japan). De testmidler blev tilsat til nedre rum af plader med 24 brønde. Antallet af celler migreret til det nedre kammer inden 2,5 timer blev bestemt ved fluorescens ændres med CyQUANT GR Dye (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) efter lyse af cellerne.

Statistisk analyse

Alle forsøg blev udført to eller tre gange. Resultaterne af flere observationer er vist som middelværdien + SEM eller som repræsentative resultater fra mere end tre forskellige batcher af celler, medmindre andet er angivet. In vivo eksperimenter, vi sædvanligvis fire til seks mus pr gruppe i hvert eksperiment og udført to eller tre gange den samme eksperimenter. Til præsentationen af ​​resultaterne af in vivo-undersøgelse, vi normalt kombineret alle resultaterne, medmindre andet er angivet. Alle statistiske beregninger blev udført med GraphPad Prism 5 (La Jolla, Californien). ANOVA blev anvendt til bestemmelse af niveauerne af forskellen mellem alle grupper. Sammenligninger for alle par blev udført ved uparret Student

t

test. En værdi på

s

0,05 blev betragtet som signifikant. Salg

Resultater

Generering af OGR1

– /- BALB /c mus

For at forstå den rolle OGR1 i astmatiker luftvejsinflammation, vi skabt OGR1-mangel BALB /c-mus. OGR1 mRNA-ekspression observeres i lunger fra WT mus, selvom ekspressionsniveauerne er ikke så høj som fra andre proton-sensing GPCR’er (figur 1). I bronkial astma model blev mus sensibiliseret ved intraperitoneal injektion af OVA i alun adjuvans to gange og udfordret med OVA aerosol tre gange (se figur 2A), hvilket resulterer i 2,5 gange stigning i OGR1 mRNA-ekspression i lungerne (figur 1). En sådan signifikant stigning i mRNA-ekspression blev ikke observeret i andre proton-sensing GPCR’er. Som forventet blev OGR1 mRNA-ekspression helt tabt, mens andre OGR1 familien GPCR mRNA-ekspression var uændret, i lungerne af

OGR1

– /-.

Mus uanset den OVA behandling (figur 1)

WT og

OGR1

– /-

mus blev sensibiliseret ved OVA /alun og udfordret af OVA. Til nonsensitized mus, blev PBS injiceres og indåndes. Lunge-mRNA ekspression af OGR1 og andre proton-sensing GPCR’er blev målt 48 timer efter sidste antigeneksponering. Resultaterne er middelværdi + SEM af 9 bestemmelser fra tre separate forsøg. * Effekten af ​​OVA-priming (WT-PBS vs WT-OVA) var betydelig.

§The udtryk for OGR1 mRNA var målbart.

(A) OVA sensibilisering og udfordring protokol. WT og

OGR1

– /- Restaurant mus blev sensibiliseret ved i.p. injektion af OVA /alun og udfordret af OVA aerosol (trekant). Til nonsensitized mus, blev PBS injiceres og inhaleres (cirkel). AHR til inhaleret methacholin blev vurderet ved ændringer i noninvasiv Penh (B) og dynamiske modstand (C) 48 timer efter den sidste antigeneksponering. Dataene er middelværdi + SEM af

n

= 13-16 per gruppe. *

s

0,05 (WT-OVA vs. OGR1

– /- OVA).

OGR1 Mangel Dæmper AHR og Airway Betændelse i OVA-sensibiliserede mus

De patofysiologiske roller OGR1 i bronkial astma blev karakteriseret ved hjælp af OVA astma model (figur 2A). Vi først vurderet en stigning i forøget pause (Penh) ved anvendelse barometrisk hele kroppen plethysmografi som et indeks for luftvejene sammentrækning som svar på stigende doser af methacholin (figur 2B). Inhaleret aerosoliseret methacholin vides at inducere bronkokonstriktion. OVA overfølsomhed /udfordring klart øget Penh reaktion på metakolin i WT mus; blev imidlertid AHR til OVA overfølsomhed /udfordring betydeligt svækket i OGR1-deficiente mus til niveauet af den for mus sensibiliseret og udfordret med PBS alene (figur 2B). Da målingen af ​​Penh som AHR er kontroversiel [31-33], målte vi lungemodstand med en direkte invasiv metode samt. Konsekvent med resultaterne af Penh, OVA overfølsomhed /udfordring forøgede lungemodstand som reaktion på methacholin i WT mus og OGR1 mangel svækkede OVA-inducerede stigning i lungeresistens til niveauet af den for kontrolmus sensibiliseret og udfordret med PBS (figur 2C ).

OVA overfølsomhed /udfordring forårsagede tæt peribronchial og perivaskulær akkumulering af inflammatoriske celler samt metaplasi og slim overproduktion af luftvejs vægge i WT mus (figur 3A og B). Disse forandringer minimale i OGR1-deficiente mus med OVA sensibilisering /challenge (figur 3A). Graden af ​​bægercelle metaplasi og slim overproduktion blev vurderet ved PAS-farvning, der blev kvantificeret som PAS-farvede celletal pr længde basale lamina (mm) (figur 3C). Stimuleret PAS farvning af OVA overfølsomhed /udfordring var signifikant hæmmet af OGR1 mangel. Som for peribronchial og perivaskulær betændelse, blev graden af ​​akkumuleringen af ​​inflammatoriske celler vurderet som inflammation score (figur 3D og E), som viste, at OGR1-mangel signifikant hæmmet OVA sensibilisering /challenge-inducerede inflammatorisk celle akkumulation. Disse resultater antyder, OGR1 er involveret i bæger cellehyperplasi og peribronchial og perivaskulær betændelse.

Mus blev sensibiliseret og udfordret af OVA eller PBS som beskrevet i figur 2. (A) Histologisk analyse af lungesnit blev udført 48 timer efter den sidste antigeneksponering. De hematoxylin og PAS-farvede snit viste er repræsentative for tre lungesnit per mus fra 5 til 6 mus i hver gruppe. Scale bar, 200 pm. (B) Den højere forstørrelse billede af pladsen i WT-OVA vises. (C) Flammernes cellehyperplasi blev kvantificeret som en PAS-farvning celleantal (C), og graden af ​​peribronchial inflammation (D) og perivaskulær betændelse (E) blev evalueret på en subjektiv skala fra 0 til 3 som inflammatorisk score, i at bruge samme sektioner som dem, der anvendes i (A). Kolonnen design specificerer hver gruppe i (D) og (E) er de samme som i (C). Virkninger af OGR1 mangel (WT-OVA vs. OGR1

– /- OVA) var signifikant (*

s

0,05) i hele tal

Vi analyserede. numre og population af cellerne til stede i BAL væsker (Figur 4A og B). De øgede totale celletal i mus med OVA overfølsomhed /udfordring blev væsentligt reduceret i OGR1-defekte mus i forhold til WT mus. Differential celletal afslørede fremtrædende rekrutteringen af ​​eosinofiler i BAL væsker i WT mus med OVA overfølsomhed /udfordring, som bemærkelsesværdigt blev reduceret i OGR1-mangel mus med de samme behandlinger. Indholdet af lymfocytter i BAL væsker blev også signifikant reduceret med OGR1 mangel. Der var ingen signifikant virkning af OGR1 mangel på antallet af makrofager og neutrofiler.

Mus blev sensibiliseret og udfordret af OVA eller PBS som beskrevet i figur 2. BAL væske blev analyseret 48 timer efter den sidste antigeneksponering for total celletælling og profil af celletyper. Repræsentative billeder af inflammatoriske celler (A) og forskellen celletal (B) i BAL væsker. Pilespidser og pile repræsenterer makrofager og eosinofiler, hhv. Scale bar, 200 pm. Mac, makrofag; Lym, lymfocyt; Eos, eosinofiler; og Neu, neutrofiler. Dataene er middelværdi + SEM af

n

= 10-12 per gruppe. De samme BAL væsker blev anvendt til at måle IL-4, IL-5, IL-13, og IFN-γ (C). Dataene er middelværdi + SEM af

n

= 10-12 per gruppe. Plasma blev opsamlet til måling af OVA-specifikke IgE-niveauer efter BAL væskeansamling (D). Dataene er middelværdi + SEM af

n

= 6-15 pr gruppe. Kolonnen design specificerer hver gruppe i (C) og (D) er den samme som i (B). Virkningerne af OGR1 mangel (WT-OVA vs. OGR1

– /- OVA) var signifikant (*

s

0,05) i hele tal

Til. vurdere mekanismerne ved reduceret AHR, eosinofili, og bægercelle metaplasi blev Th1 /Th2-cytokiner i BAL fluider målt ved ELISA (figur 4C). OVA sensibilisering /udfordring inducerede signifikante stigninger i Th2-cytokiner, herunder IL-4, IL-5 og IL-13, og Th1 cytokin IFN-γ i WT mus. Th2 cytokin-indhold i BAL fluider var signifikant lavere i OGR1-defekte mus end i WT mus. På den anden side blev OVA sensibilisering /challenge-inducerede stigning i IFN-γ produktion påvirkes ikke af OGR1 mangel (figur 4C). Plasmakoncentrationen af ​​IgE specifikke for OVA blev også hæmmet af OGR1 mangel i OVA sensibilisering /udfordrede mus (figur 4D).

DCs Express Funktionel OGR1

De in vivo resultater er beskrevet ovenfor antyder, at OGR1 spiller en rolle i processen eller opstrøms proces med induktion af Th2-respons i patogenesen af ​​luftvejene astma. Vi spekulere, at DC-funktioner reguleres af OGR1. Der har ikke været nogen tidligere rapport vedrørende OGR1 udtryk og dets funktioner i udviklingslandene. Da antistoffer specifikke for OGR1 ikke var til rådighed, blev det OGR1 ekspressionsniveauet vurderet ved mRNA måling (figur 5A). Vi bekræftede OGR1 mRNA-ekspression vurderet ved real-time TaqMan PCR i umodne BMDCs af WT mus. Interessant nok blev mRNA-ekspression af OGR1 lidt, men signifikant forøget med OVA sensibilisering (figur 5A). Som forventet blev OGR1 mRNA-ekspression helt tabt i udviklingslandene uanset OVA overfølsomhed i

OGR1

– /-

mus (figur 5A). Vi målte også ekspressionen af ​​mRNA’er for andre proton-sensing GPCR’er i DC’er. I modsætning til lunge prøver (figur 1), GPR4 ekspression var meget lav i DC’er uanset OVA puls (fig S1). På den anden side, i lighed med OGR1, TDAG8 og G2A mRNA-ekspression blev øget betydeligt ved OVA sensibilisering (fig S1).

DC’er udtrykker OGR1 mRNA og funktionel OGR1 aktivitet. Ekspression af OGR1 mRNA i DC’er og dens forøgelse af OVA-priming (A). Ekspressionen af ​​OGR1 mRNA blev vurderet ved kvantitativ real-time TaqMan PCR. Data er gennemsnit ± SEM af 9 bestemmelser fra tre separate forsøg. Effekt af OVA-priming (WT-PBS vs WT-OVA) var signifikant (*

s

0,05).

§The udtryk for OGR1 mRNA var målbart. Forsuring inducerer [Ca

2 +]

jeg øge gennem OGR1 /G

q /11-protein i udviklingslandene (B og C). DCs blev fremstillet af WT og

OGR1

– /-

mus og inkuberes at overvåge [Ca

2 +]

jeg evalueret af ændringen i Fura-2 fluorescens. Cellerne blev præinkuberet i suspension ved pH 7,4 og ved pilen, blev HCI (endelig pH på 7,0) eller ATP (100 uM) tilsat. For at evaluere rollen af ​​G

q /11-protein, blev cellesuspensionen behandlet med YM-254.890 (100 nM) (eller DMSO som bærestof). Et repræsentativt spor af [Ca

2 +]

jeg ændre blev vist (B). Net [Ca

2 +]

jeg ændre (peak værdi – basal værdi) blev evalueret (C). Basal værdi af [Ca

2 +]

Jeg ved pH 7,4 var 125 ± 12 nM og værdien var ikke mærkbart påvirket af OGR1 mangel. Data er gennemsnit ± SEM af 8 bestemmelser fra fire separate forsøg. Effekt af OGR1 mangel (WT vs OGR1

– /-) var signifikant (*

s

0,05).

For yderligere at bekræfte den funktionelle OGR1 udtryk i udviklingslandene, Ca

2+ respons på ekstracellulære protoner blev undersøgt, fordi OGR1 er kendt for at blive koblet med G

q /11 protein /phospholipase C /Ca

2+ signalveje i forskellige typer af celler [8,13-19]. Forsuring af det ekstracellulære medium til pH 7,0 klart forøget den intracellulære Ca

2+ koncentration ([Ca

2 +]

i), som blev næsten fuldstændig inhiberet af OGR1 mangel og YM-254.890, en specifik inhibitor for G

Q /11-proteiner (figur 5B og C). Den [Ca

2 +]

i respons til ATP, en ligand for G

q /11 protein-koblede P2Y-type purinerge receptorer, blev ikke påvirket af OGR1 mangel (figur 5B og C). Således

OGR1

– /-

mus viste ikke en generel fejl i G

q /11 protein signalering. Betragtet sammen, disse resultater tyder på, at udviklingslandene udtrykker funktionelt OGR1 kobling til G

q /11 proteiner.

Intratrakeal Overførsel af OGR1-mangel DCs Udvikler Lavere AHR og eosinofili sammenlignet med WT DC’er

For at vurdere den kritiske rolle OGR1 på DC’er i patogenesen af ​​astma, adoptiv OVA-pulserede DC blev udført transfer eksperimenter. De OVA-pulserede eller ikke-pulserede DC’er blev intratrachealt overført til WT-mus, som blev fulgt af OVA inhalation 10 dage efter DC administration (figur 6A). AHR målt som stigninger i Penh til inhaleret methacholin var signifikant højere i intratracheal overførsel af OVA-pulserede DC’er end ikke-pulserede DC’er når DC’er blev fremstillet fra WT mus (figur 6B). I modsætning hertil mus modtager OVA-pulserede OGR1-mangelfuld DCs udviklet lavere stigninger i Penh sammenlignet med dem, der har modtaget OVA-pulserede WT DCs.

(A) Protokol af DC vedtagelse eksperiment. OVA eller PBS-pulserede BMDCs blev fremstillet af WT og

OGR1

– /-

mus og administreres intratrakealt til WT mus. Ti dage senere blev mus udfordret med OVA inhalation i 20 minutter på tre på hinanden følgende dage. Otteogfyrre timer efter den sidste OVA-udfordring blev AHR til methacholin målt som Penh aktiviteter (B). Efter måling af luftvejs lydhørhed, blev BAL væsker indsamlet og analyseret til tælling af totale celler og differentierede celler (C). Dataene er middelværdi + SEM af

n

= 10-12 per gruppe.

#

s

0,05 (DC (WT) -PBS vs DC (WT) -OVA) og *

s

0,05 (DC (WT) -OVA vs DC (

– /-) – OVA)

Vi målte også antallet og typer af inflammatoriske celler i BAL væsker mus overført med udviklingslandene. (figur 6C). Antallet af eosinofiler og lymfocytter i BAL væsker hos mus, der modtog OVA-pulserede OGR1-deficient DC’er var signifikant lavere end de mus, der modtog OVA-pulserede WT DC’er. Disse resultater indikerer, at ændringen af ​​DC-funktioner kan forklare, i det mindste delvist, den reducerede AHR og luftvejsinflammation i

OGR1

– /- Salg mus.

Støtte Information

Figur S1.