PLoS ONE: Karakterisering af Tab af SUMO Pathway Funktion på kræftceller og Tumor Proliferation

Abstrakt

SUMOylation er en post-translationel ubiquitin-lignende protein modifikation vej, der regulerer vigtige cellulære processer, herunder kromosom struktur, kinetochore funktion , kromosom adskillelse, nukleare og sub-nukleare organisation, transskription og DNA-skader reparation. Der er stigende tegn på, at SUMO vej er dysreguleret i kræft, øge muligheden for, at modulation af denne vej kan have terapeutisk potentiale. For at undersøge betydningen af ​​SUMO pathway i forbindelse med cancer celleproliferation og tumorvækst, vi anvendte lentivirus-baserede korte hårnåle RNA’er (shRNA) til knockdown SUMO pathway-gener i humane cancerceller. shRNAs for SAE2 og UBC9 reducerede SUMO konjugation aktivitet og hæmmede proliferation af humane cancerceller. For at uddybe disse observationer, genereret vi doxycyclin inducerbare betingede shRNA cellelinjer til SAE2 at opnå akut og reversible SAE2 knockdown. Betinget SAE2 knockdown i U2OS og HCT116 celler bremset cellevækst

in vitro

, og SAE2 knockdown induceret flere terminal udfald herunder apoptose, endoreduplikation og ældning. Flerkernede celler blev senescent og farves positivt for ældning markering, SA-β Gal, og vises forhøjede niveauer af p53 og p21. I et forsøg på at forklare disse fænotyper, vi bekræftet, at tab af SUMO vej aktivitet fører til et tab af SUMOylated topoisomerase IIα og fremkomsten af ​​kromatin broer, som kan forringe ordentlig cytokinese og føre til multinukleation. Desuden knockdown af SAE2 inducerer forstyrrelse af PML nukleare organer, som yderligere kan fremme apoptose eller ældning. I en

in vivo

HCT116 xenograft tumor model, betinget SAE2 knockdown stærkt forringet tumorvækst. Disse data viser, at SUMO vej er nødvendig for kræft celledeling

in vitro

og tumorvækst

in vivo

, implicerer den SUMO vej som en potentiel kræft terapeutisk target.

citation: Han X, Riceberg J, Pulukuri SM, Grossman S, Shinde V, Shah P, et al. (2015) Karakterisering af Tab af SUMO Pathway Funktion på kræftceller og Tumor spredning. PLoS ONE 10 (4): e0123882. doi: 10,1371 /journal.pone.0123882

Academic Redaktør: Carl G. Maki, Rush University Medical Center, UNITED STATES

Modtaget: November 24, 2014 Accepteret: 23 februar 2015; Udgivet: April 10, 2015

Copyright: © 2015 Han et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Takeda Pharmaceuticals International Co forudsat fuldstændig finansiel støtte til undersøgelsen design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, forberedelse af manuskriptet, og lønninger til forfattere XH, JR, SP, SG, VS, PS, JB, LD, JN, og NB, i den periode, blev udført. De specifikke roller disse forfattere er formuleret i »forfatter bidrag« sektion

Konkurrerende interesser:. Takeda Pharmaceuticals International Co forudsat fuldstændig finansiel støtte til undersøgelsen design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, udarbejdelse af manuskriptet og lønninger til forfatterne XH, JR, SP, SG, VS, PS, JB, LD, JN, og NB, i den tid, hvor undersøgelser blev udført. Der er ingen patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

SUMOylation er en evolutionært bevaret ubiquitin-lignende protein modifikation proces, der regulerer et bredt sæt af biologiske processer [1, 2]. SUMO (små ubiquitin-relaterede modifier) ​​proteiner er ~ 10 kD ubiquitin-lignende proteiner der er kovalent forbundet til substratet lysinrester via en enzymatisk kaskade analog med protein ubiquitinering. Det menneskelige genom koder fire SUMO familie proteiner: SUMO1-SUMO4. SUMO1-SUMO3 er ubikvitært udtrykt i alle vævstyper, mens SUMO4 hovedsageligt udtrykkes i nyren, lymfeknude og milt [1]. De modne former af SUMO2 og SUMO3 er 97% identiske og kun andel ~ 50% sekvenshomologi med SUMO1. SUMO1 er konjugeret til at målrette proteiner som monomer, mens SUMO2 og SUMO3 kan danne poly SUMO kæder som følge af acceptor lysinrester til stede ved N-terminalen. Funktionen af ​​SUMO4 er mindre klar som tyder på, at det ikke er behandlet til en moden, konjugerbart formular ligesom de andre SUMO isoformer [1, 2].

SUMOylation er en dynamisk og reversibel protein modifikation. Nascent SUMO forstadier proteolytisk bearbejdet af SUMO-specifikke isopeptidases (sentrin-specifikke proteaser; SENPs) for at afsløre en C-terminal glycinrest. Disse modne SUMO proteiner aktiveres af E1 heterodimeren SAE1 (AOS1) -SAE2 (SUMO aktiverende enzym 2 eller UBA2) i en ATP-afhængig reaktion, der fremmer thioester bindingsdannelse mellem SUMO c-terminal glycin og et cystein i SAE2. SUMO overføres derefter til den katalytiske cysteinrest af sålen E2-enzym UBC9 (også kendt som UBE2I). Endelig SUMO E3 ligaser, herunder Pias familie proteiner, RanBP2 og Polycomb gruppemedlem Pc2 [1], letter dannelsen af ​​en isopeptidbinding mellem SUMO Ubl og et mål lysinrest på underlaget. Den kanoniske SUMO-modifikation side indeholder den konsensus-motivet ΨKxE (hvor x refererer til enhver aminosyre, Ψ er en alifatisk forgrenet aminosyre). SUMOylation er en dynamisk proces, der i sidste ende vendes ved SUMO proteaser, eller SENPs, som tillader genbrug af SUMO proteiner til efterfølgende konjugering cyklusser [2]. Svarende til ubiquitin interagerende domæner med tilknytning til ubiquitinreaktionsvejen, har SUMO interagerende motiver (SIMS) blevet identificeret, som fremmer protein SUMOylation eller forbedre SUMO afhængige protein-protein-interaktioner. Kanoniske SIMs er generelt karakteriseret ved en kort strækning af hydrofobe rester med en konsensussekvens og /eller phosphorylerede serinrester [3]. Den potentielle biologiske nytte af flere SUMO Ubls kombineret med forekomsten af ​​SIM kan bidrage til at forklare den store mangfoldighed af biologiske processer, hvor SUMOylation er involveret.

De biologiske konsekvenser af SUMOylation omfatter ændringer i subcellulære lokalisering, ændret protein- protein-interaktion, ændret aktivitet og substrat stabilitet [1, 2]. Talrige SUMO mål er blevet identificeret gennem celle- og biokemiske undersøgelser, og mange af disse substrater er involveret i vigtige cellulære processer og strukturer, herunder cellecyklus, kromosom struktur og segregation, ribosomale biogenese, nucleocytoplasmic transport, sub-nukleare struktur, DNA-reparation, og genekspression [4-8]. Adskillige transkriptionsfaktorer, såsom KAP1, Sp3, p300, c-Jun og c-Myb, er blevet rapporteret som SUMO substrater, hvorved SUMOylation kunne fremme både transkriptionel aktivering og repression [6, 7, 9]. Desuden er SUMO involveret i nuklear transport via SUMOylation afhængige kerneporen lokalisering af RanGAP1, som muliggør opretholdelse af RAN GTP forløb, der er vigtigt for aktiv kerneimport og eksport [4]. Inden kernen, er SUMOylation også rapporteret at spille vigtige roller i PML nukleare krop (NB) dannelse og rekruttering af PML forbundet proteiner, herunder Daxx og SP100 [10, 11].

Af særlig interesse fra en cancer perspektiv er den betydelige beviser, at SUMOylation er vigtig for en lang række processer er kritiske for mitose. I

S

.

cerevisiae

, cohesin er SUMOylated, og SUMOylation er nødvendig for søsterkromatid samhørighed [12]. Den mitotiske kinase Aurora B, topoisomerase IIα, og talrige centromere og kinetochore proteiner er også rapporteret SUMO substrater [13]. Blastocyster isoleret fra mus Ubc9 knockout embryoner vise hypocondensed kromatin og kromosom segregation defekter [14]. Lignende effekter på kromosom adskillelse er også blevet observeret i genetiske undersøgelser i

S

.

cerevisiae

, zebrafisk og Drosophila, hvilket tyder på en evolutionært bevaret rolle for SUMO i mitose. Interessant, studier i Drosophila indikerer, at delende celler er særligt følsomme over for tabet af SUMO vej funktion i forhold til ikke-delende, differentierede celler [15].

Der er nye forbindelser mellem protein SUMOylation og kræft. I genom-dækkende RNAi skærme, flere SUMO pathway komponenter scoret som essentielle gener for celleproliferation [16]. Begge

UBC9

og

SENP1

er nødvendige for mus embryonale udvikling [14, 17]. Desuden SUMO E1 enzym (SAE1 /2), blev identificeret som syntetisk letal med c-myc i et genom-dækkende RNAi skærmen, og SAE2 er påkrævet for vækst af Myc-afhængig brystkræft hos mus [18]. I overensstemmelse med dette resultat, en nylig undersøgelse viste tab af SUMOylation inducerede hurtig regression af Myc-drevne lymfom [19]. Forhøjede niveauer af UBC9 er blevet observeret i flere maligniteter og er forbundet med dårligere patient resultat; herunder lunge-, tyktarms-, prostata, ovariecancer, brystcancer og melanom [20-24]. Desuden forhøjede niveauer af SUMO E1, SAE, er også rapporteret at være forbundet med dårligere resultat ved brystcancer. Disse resultater berettiger yderligere evaluering af SUMOylation pathway enzymer som potentiel onkologi terapeutiske mål.

Validering potentiale til at finde små molekyler modulatorer af SUMO vej, hæmmere af SAE og UBC9 [25-28] er blevet rapporteret selv om ingen er i øjeblikket i klinisk udvikling. Men en inhibitor af et beslægtet E1 enzym, kan NEDD8 aktiverende enzym (NAE), er i klinisk udvikling [29, 30]. Denne inhibitor, MLN4924 (pevonedistat), binder til adenylat bindingssted NAE-NEDD8 thioester og udnytter et substrat assisteret mekanisme for inhibering, hvorved NAE katalyserer dannelsen af ​​en NEDD8-MLN4924 addukt, der fungerer som en kraftig inhibitor af enzymet. SAE viste sig at være stand til at danne SUMO sammensatte addukter med en ikke specifik E1 inhibitor (forbindelse 1), hvilket viser biokemisk bevis for konceptet, at SAE kan målrettes på denne måde [31].

I betragtning af den spirende forhold mellem protein SUMOylation og kræft, vi søgte at karakterisere effekten af ​​tab af SUMO vej funktion i kræft celledeling og tumorvækst. Vi anvendte stabile og betingede shRNA systemer til at knockdown SUMO E1 og E2 enzymer, SAE2 og UBC9, i menneskelige kræftceller og SAE2 i xenograft tumormodeller. SUMO vej knockdown resulterede i flere terminal udfald herunder ældning og apoptose, hvilket førte til kraftig spredning anholdelse og celledød i dyrkede kræftceller. At studere potentielle mekanismer, bekræftede vi tabet af TopoIIα SUMOylation og afbrydelse af PML bemyndigede organer i HCT116. Derudover vores data tyder tab af SUMOylation forsinket tumor progression i xenograftmodeller, hvilket tyder på SUMO vej er en potentiel onkologi mål.

Materialer og metoder

Cell Kultur og reagenser

HCT116, U2OS og Hela-celler blev opnået fra American Type Culture Collection. HCT-116 og U2OS celler blev dyrket i McCoys 5A-medium suppleret med varmeinaktiveret 10% føtalt bovint serum. Hela-celler blev dyrket i DMEM medium suppleret med varmeinaktiveret 10% føtalt bovint serum. p300-celler blev opnået fra Dr. Ron Hay og dyrket i DMEM medium suppleret med varmeinaktiveret 10% føtalt bovint serum, 0,5 mg /ml G418 (Geneticin) og 0,5 mg /ml zeocin. Salg

Alle cellelinierne blev inficeret til at udtrykke en ikke-målrettet shRNA, SAE2 shRNA eller UBC9 shRNA hjælp pakkede lentivirale partikler (Sigma Mission shRNA bibliotek klon #: SAE2 SH1: TRCN0000007470; SAE2 SH2: TRCN0000007472; Ubc9 SH1: TRCN0000007205; Ubc9 SH2: TRCN0000007206; Ubc9 SH3: TRCN0000011077). Inficerede celler blev selekteret ved puromycin i 2 dage, venstre restituere i 24 timer og derefter anvendt til western blot og en række vækstassays. p300-celler blev lyseret til at måle ildflueluciferaseaktivitet med Steady-Glo Luciferase Assay System (Promega).

HCT116 og U2OS celler blev manipuleret til at indeholde en vektor, som udtrykker en Tet-inducerbar promotor ikke-targeting shRNA eller en hårnål målretning human SAE2. For disse celler er shRNA var en 22-mer stem-loop klonet under kontrol af en Tet-inducerbar promotor og sendt ind i pTRIPZ vektoren (Open Biosystems). De konstruerede linier blev dannet ved stabil transduktion med emballerede lentivirale partikler. Inficerede celler blev selekteret ved puromycin i 2 dage, venstre restituere i 24 timer og derefter behandlet med 1 ug /ml doxycyclin (Sigma). SH1: TATTCCTACTTTCAATACAGCA; SH2: TTCAATTTGGACATCTGGTGCT; SH3: TTGACTTTGTACTTCAGCCCAG; SH4:. TTTACATCTAGAACCTGCTGGT

Western analyse

Helcellelysater eller tumorceller ekstrakter blev fraktioneret ved ikke-reducerende SDS-PAGE og immunblottet med antistoffer til SAE2 (for cellelysater: polyklonalt kanin-antistof genereret af Millennium , antistof blev valideret på cellelinjer overekspression SAE2, for tumorekstrakt: epitomics T0083, kanin), Ubc9 (epitomics 2426-1, kanin), SUMO1 (epitomics S2227, kanin), SUMO2 /3 (cellesignalering Technologies 4971, kanin), RanGAP1 (Abcam ab2081, ged), p53 (cellesignalering Technologies 9282, kanin), p21 (Santa Cruz sc-397, kanin), kløvet caspase 3 (Cell signaling Technologies 9661, kanin), TopoIIα (cellesignalering Technologies 12286, kanin) . Alle primære antistoffer blev anvendt 1: 1000 fortynding. Sekundære HRP-mærkede antistoffer til gede-IgG (Millipore, 1: 2000 fortynding) blev anvendt til RanGAP1 primært antistof og blots blev fremkaldt med ECL-reagens (Amersham). For andre primære antistoffer, det sekundære antistof var Alexa-680-mærket antistof til kanin /mus IgG (Invitrogen, 1: 5000 fortynding) og blots blev afbildet under anvendelse af Li-Cor Odyssey Infrarød Imaging system. Tubulin (Sigma) blev slettet for en lastning kontrol.

Immunofluorescens og nuklear billeddannelse

HCT-116 celler blev dyrket på poly-D-lysin-coatede dækglas (BD Biosciences) med medium + eller-Doxycyclin og inkuberet i 5 dage. For PML-farvning blev celler fikseret med 2% paraformaldehyd i PBS i 3 minutter, permeabiliseret med 0,5% Triton X-100 i PBS i 10 min, derefter fikseret igen med 4% paraformaldehyd i PBS i 5 minutter og vasket i PBS. For Daxx farvning blev cellerne permeabiliseret med 0,5% Triton X-100 i PBS i 2,5 min først, derefter fikseret med 4% paraformaldehyd i PBS i 10 minutter og vasket i PBS. For immunfluorescensfarvning blev celler behandlet med blokerende reagens (Roche) i 1 time ved stuetemperatur og farvet med primære antistoffer: PML (Santa Cruz sc-966), Daxx (Santa Cruz sc-7152) i blokerende reagens natten over ved 4 grader. Celler blev vasket med PBS og farvet med Alexa 488-konjugeret gede-anti-muse-IgG (1: 2000; Invitrogen) eller Alexa 488-konjugeret gede anti-kanin IgG (1: 2000; Invitrogen) i blokerende reagens i 1 time ved stuetemperatur . Celler blev vasket med PBS, farvet med Hoechst 33342 (1: 10.000, Invitrogen) i 5 minutter og vasket i PBS. Dækglassene blev monteret på objektglas med Vectashield (Vector Laboratories). Fluorescens mærkede celler blev visualiseret ved hjælp af et Nikon TE 300 fluorescerende mikroskop og billeder blev taget med et digitalt kamera (Hamamatsu).

spredning og cellecyklus analyse

Efter udvælgelsen udpladedes i seks- brønds plader (2000 celler /brønd) med medium + eller-Doxycyclin og inkuberet i 12 dage. Cellerne blev fikseret under anvendelse af 4% para-formaldehyd og derefter farvet med en 0,5% krystalviolet opløsning at identificere tilstedeværelsen af ​​cellekolonier.

HCT116 celler, der huser tet-inducerbare hårnåle blev behandlet med doxycyclin i 6 dage og opsamlede celler blev fikseret i 70% ethanol natten over ved 4 ° C. Fikserede celler blev centrifugeret for at fjerne ethanol, og pelleterne blev resuspenderet i propidiumiodid og RNase A i PBS i 1 time på is beskyttet mod lys. Celle-cyklus fordelinger blev bestemt ved anvendelse af flowcytometri (FACS Calibur, Becton Dickinson) og analyseret under anvendelse Winlist software (Verity).

SA-β-Gal-farvning blev udført under anvendelse senescens detektion kit (Abcam) ifølge instruktionerne fremstillingsdatoen.

U2OS Celler behandlet med doxycyclin 7 dage blev mærket med BrdU i 0,5 timer, og G1, S og G2 /M-populationer blev målt ved BrdU APC flow kit (BD Biosciences). Repræsentant data blev vist fra uafhængige forsøg.

Tumor xenograft eksperimenter

Denne undersøgelse blev godkendt af Takeda Oncology Company Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) (protokol 09 til 011). 8 uger gammel kvinde NCR nu /nu-mus (Taconic Farm Inc.) blev anvendt i alle in vivo studier. Alle dyr gennemgik en akklimatisering periode på mindst 3 dage før de anvendes til eventuelle eksperimentelle formål (4 mus opstaldet per bur). For alle procedurer udført ved denne undersøgelse blev dyrene bedøvet ved anvendelse af en induktion af en blanding 4-5% isoflorane /oxygen i en boks kammer og derefter holdt ved 1-2% isoflorane /oxygen. Korrekt dyr sedation blev bekræftet ved tå klemme. For tumorvækst progression studier blev mus podet med 2 × 10

6 HCT116 eller HT29 celler, der huser ikke-targeting eller SAE2 shRNAs subkutant i højre flanke, og tumorvækst blev overvåget med caliper måling (for hver gruppe, i alt 4 -6 mus blev anvendt). Når gennemsnittet tumorvolumen nåede ca. 200 mm

3, Dyrene blev behandlet med bestrålede 0,0625% Doxycyclin Diet (Lab Diet) uafbrudt, hvilket billede 1-6 mg Dox pr mus /pr dag. RFP fluorescerende billeddannelse blev udført på bedøvede dyr under anvendelse af en Xenogen imager før og efter Doxycyclin kost startet. Under undersøgelsen blev alle dyr som opfyldte følgende kriterier fjernet fra undersøgelsen og eutaniseret: 1. Vægttab: The legemsvægt af alle dyr blev overvåget gennem hele undersøgelsen og dyr blev aflivet, hvis de incurred 15% vægttab mellem observationer. 2. Tumor størrelse: Hvis tumor volumen nåede 10% af kropsvægten, tumor større end 2 cm forstyrrer spise, drikke, vandladning, afføring eller til fods. 3. Ulceration /nekrose af tumorstedet. 4. Lammelse: Tab af funktion i enten forbens eller baglemmer. 5. Andre kriterier, der vil indlede daglig overvågning og eutanasi, hvis ikke lydhøre over for palliativ behandling omfatter: Dehydrering, hypotermi, unormal vejrtrækning, lavt aktivitetsniveau, indlysende smerte, og generel dårlig huld. Ved afslutningen af ​​undersøgelsen blev alle dyr aflivet med CO2-kvælning efterfulgt af torakotomi for at bekræfte døden.

Resultater

lentivirus baseret SUMO pathwaygen-knockdown inhiberer cancercelleproliferation

in vitro

for at bekræfte, at SUMO vej er nødvendig for kræftcellen overlevelse, vi anvendte en lentivirus baseret shRNA systemet stabilt knockdown SUMO pathway gener i menneskelige kræftceller. To uafhængige shRNAs rettet SAE2 (SUMO E1) eller UBC9 (SUMO E2) smittet i U2OS celler (Fig 1A). Ved immunoblotting, SAE2 shRNAs (SH1 og SH2) effektivt reduceret SAE2 proteinniveauet og dermed nedreguleret UBC9-SUMO thioester niveauer (Fig 1A), hvilket indikerer SUMO E1 hæmning funktionelt forringet SUMO E2 aktivering. Tilsvarende to UBC9 shRNA (SH1 og SH2) reducerede både den samlede UBC9 og UBC9 SUMO thioester niveauer (Fig 1A). I overensstemmelse med de reducerede SUMO E1- og E2-niveauer, vi observerede reducerede niveauer af SUMO2 /3 konjugerede proteiner (Fig 1A, nederste panel), hvilket antyder SAE2 og UBC9 shRNAs er funktionelt inhibering SUMOylation i cellerne.

(A) SAE2 eller UBC9 knockdown reduceret SUMO pathway aktivitet. U2OS celler blev stabilt inficeret med lentivirus udtrykker shRNAs, vælges med puromycin og immunoblottedes for angivne proteiner. SH1 og SH2 er to shRNAs for hvert gen. (B) SAE2 eller UBC9 knockdown de-fortrængt en SUMO-undertrykkende reporter. Stabile U2OS celler, der huser en SUMO-undertrykkende luciferase reporter (p300 celler) smittet med angivet shRNAs. Luciferaseaktivitet blev målt på dag 5 efter puromycinselektion. (C) SAE2 eller UBC9 knockdown reduceret UBC9 thioester niveau i p300 reporter celler. (D) SUMO inhibering undertrykt kolonidannelse. Celler blev udpladet i 6-brønds plader og farves for krystalviolet efter 12 dage.

For at kvantitativt måle SUMOylation hæmning i SAE2 eller UBC9 knockdown i celler, vi anvendte en celle-baseret reporter assay til at måle SUMO aktivitet. Vi spændte stabile U2OS celler med en SUMO undertrykkende luciferase reporter [5]. Cellerne udtrykte en GAL4-p300 N-terminal fusion protein (herefter benævnt som GAL4-p300N) og rummede et GAL4-bindingssted foran promotoren for et luciferasegenet. P300 N-terminalen indeholder to kendte SUMOylation sites. Når SUMOylated, GAL4-p300N rekrutterer transkriptionelle repressorer til GAL4 hjemmeside, som hæmmer luciferase transskription. De-SUMOylation af GAL4-p300N de-undertrykker luciferase reporter. Som vist i figur 1B, SAE2 shRNAs og UBC9 shRNAs øget luciferase signal i forhold til en kontrolgruppe shRNA. Samstemmende, blev SAE2 og UBC9 protein niveauer effektivt reduceret i disse celler (Fig 1c) bekræfter, at SAE2 og UBC9 knockdown funktionelt reduceret SUMOylation aktivitet.

For at undersøge virkningen af ​​SUMO hæmning på celleproliferation, vi belagte U2OS celler, der udtrykker SAE2 eller UBC9 shRNAs og udførte en 2D kolonidannelse assay. Som vist i figur 1D, SAE2 og UBC9 shRNAs (SH1 og SH2) kraftigt blokeret kolonidannelse

in vitro

. Vi målte også cellevækst ved befolkning fordobling assay. I overensstemmelse med figur 1D, SAE2 knockdown resulterede i langsommere cellepopulation fordobling (S1A Fig). Lignende resultater blev observeret i HCT116 og Hela-celler (data ikke vist). Disse data bekræfter, at SUMOylation er nødvendig for kræft celleproliferation.

Betinget SAE2 knockdown dæmper SUMO pathway aktivitet

Når voksende U2OS celler med SAE2 shRNAs, bemærkede vi, at celler, der overlevede efter flere passager viste en meget lavere SAE2 knockdown sammenlignet med tidlige passage-celler, hvilket indikerer, at SUMO shRNAs negativt blev udvalgt i dette prolifererende cellepopulation. For at opnå akut og regulerbar SAE2 knockdown, genereret vi fire miR30-baserede SAE2 shRNAs (SH1-SH4) [32] med en RFP (rødt fluorescerende protein) reporter under kontrol af den TRE promotoren. Lentivirusvektoren har også en rtTA transaktivator til dannelse af et tet-on shRNA system, der er inducerbar med doxycyclin (Dox) [32]. U2OS celler blev inficeret med den betingede SAE2 shRNAs og behandlet med Dox i 5 dage. Som vist i figur 2A (øverste panel) efter Dox behandling, betinget SAE2 shRNAs effektivt reduceret SAE2 og SAE2-thioster niveauer mens en kontrol shRNA (c) påvirkede ikke niveauet for uladede og thioester SAE2. Ved immunoblotting for UBC9, viste vi, at betinget SAE2 knockdown reducerede niveauer af UBC9-SUMO thioestere (Fig 2A, midterste panel). Gennem overvågning af RFP reporter co-udtrykt fra TRE promoteren, vi har registreret RFP induktion efter Dox behandling i 36 timer (S2 Fig), hvilket indikerer en effektiv induktion af tet-på shRNA systemet.

(A) U2OS celler blev inficeret med Dox inducerbare SAE2 shRNAs (SH1-sh4) eller kontrol shRNA (c). Cellerne blev behandlet med Dox i 5 dage (+) eller ubehandlede (-). Protein-lystes blev immunoblottedes for angivne proteiner. Tubulin tjener som ladningskontrol. (BD) U2OS celler, der udtrykker betinget SAE2 shRNAs blev behandlet med Dox og immunoblottedes med RanGAP1 (B), SUMO1 (C) og SUMO2 /3 (D) antistoffer.

For at undersøge om betinget SAE2 shRNAs undertrykt SUMOylation i celler, målte vi samlede SUMO konjugater samt det kendte SUMO målgenet RanGAP1 [4] i SAE2 knockdown celle. Både SUMO1 og SUMO2 konjugater var faldet betydeligt i SAE2 Knockdown celler på dag 5 med Dox behandling (Fig 2C og 2D, + Dox baner, SH2 og SH3). Hertil kommer, efter akut SAE2 knockdown, blev niveauet for SUMOylated RanGAP1 faldet på 5 dage efter Dox behandling og reduktionen toppede på dag 8 (Fig 2B). Denne observation er i overensstemmelse med rapporterede forlænget halveringstid af SUMO modificeret RanGAP1 [33]. Vi testede også den betingede shRNA systemet i HCT116 celler og observeret lignende akut knockdown af SAE2 og ledsaget SUMOylation hæmning (S3 Fig). Vores resultater viste, at betingede shRNAs akut kan banke ned SAE2 at dæmpe SUMO pathway aktivitet i kræftceller.

Betinget SAE knockdown induceret apoptose, endoreduplikation og aldring

For at løse, hvordan akut SAE2 Knockdown påvirkninger celledeling

in vitro

, vi udførte en kolonidannelse assay i Dox behandlet HCT116 og U2OS celler, der udtrykker betinget SAE2 shRNAs (fig 3A). I overensstemmelse med stabil knockdown, Dox behandling signifikant blokeret koloni dannelse i tre SAE2 shRNAs grupper (SH2-SH4), men ikke i kontrolgruppen shRNA gruppen (fig 3A og S4A Fig).

(A) HCT116 celler blev inficeret med Dox inducerbare SAE2 shRNAs eller kontrol shRNA (ctrl). Celler blev udpladet i 6-brønds plader i Dox medium (0,5 ug /ml) og farvet for krystalviolet efter 12 dage. (B) Knockdown af SAE inducerer apoptose. Sub G1 population blev analyseret ved FACS med og uden Dox behandling. Fejlsøjler betegner s.d. (C) SAE2 knockdown induceret cellulære ældning. Celler blev farvet for SA-β-Gal-aktivitet efter 9 dage Dox behandling. (D) PI-farvning og FACS-analyse af HCT116 celler efter SAE2 knockdown. Sub G1 og mutil-kerneholdige cellepopulation blev angivet.

For at udforske de potentielle fænotyper, der fremmer SAE2 knockdown-medieret vækst anholdelse, vi analyseret apoptose og cellecyklus markører i SAE2 Knockdown celler. Ved PI farvning og flowcytometri, observerede vi øget sub-G1 celle population i HCT116 celler efter betinget SAE2 knockdown (Fig 3B), hvilket tyder på nogle celler undergår apoptose. Ved BrdU-inkorporering assay observerede vi en nedsat procentdel af celler i S-fase i SAE2 knockdown U2OS celler (s4b Fig). Foruden apoptose og reduceret cellevækst, startende fra 6 dage efter kontinuerlig Dox behandling, SAE2 knockdown HCT116-celler viste også en multi-nukleeret fænotype med forstørret og fladtrykte morfologi, som er almindeligt forekommende i senescentceller. Denne cellepopulation farvedes positive for SA-β-Gal-aktivitet (fig 3C), hvilket indikerer, at disse celler har indledt en senescens program. Desuden flowcytometrisk analyse af DNA-indhold i Dox nukleare behandlede celler viste øget 8N DNA-indhold fra HCT116 celler, der huser SAE2 shRNAs, hvilket antyder, at forringet SUMOylation fører til Endofordobling (fig 3D). Disse resultater tyder på, at reduceret SUMOylation fører til en mitotisk defekt forringet cytokinese, som sandsynligvis bidrager til observerede apoptose og ældning.

SAE2 shRNA fænotype er reddet af en ikke-silencible cDNA

For at udelukke off-target effekter af RNAi, vi udførte en rednings eksperiment med siRNA refraktær cDNA-konstruktioner. Celler, der udtrykker tet-på shSAE2 blev inficeret med tom vektor, ikke-silencible vildtype SAE2 (SAE2

wt), eller en ikke-silencible inaktiv SAE2 C173A mutant cDNA (SAE2

mut). Uden Dox behandling, de SUMO konjugerede niveauer er ens inden for disse inficerede cellelinjer, undersøgt ved western blot (S5 Fig). Efter 6 dage kontinuerlig Dox behandling, sammenlignet med vektor kontrol, SAE2

WT delvist reddet nedregulering af SAE2-SUMO og UBC9-SUMO thioester niveauer og delvist restaureret SUMO2 /3 konjugater i shSAE2 udtrykkende celler. I modsætning hertil udtrykte inaktive SAE2

mut undladt at redde SAE2-SUMO thioester, den Ubc9-SUMO thioester og SUMO konjugater (Fig 4A). Som yderligere bekræftelse på, at den ikke-silencible SAE2 funktionelt kan redde SUMO pathway aktivitet, vi udførte den samme sub-G1 apoptose assay og SA-β-Gal farvning. Vildtype SAE2, men ikke C- A-enzym dødt SAE2 mutant, delvist reddet shSAE2 induceret multinukleation og senescens, og tilhørende celledød (Fig 4B og 4C). Disse data understøtter, at de mitotiske mangler og apoptose fænotyper af SAE2 shRNA sandsynligvis er forårsaget af på target svækkelse af SUMO pathway aktivitet.

(A) HCT116 celler, der udtrykker tet-på inducerbare shSAE2 (C = ctrl shRNA, 2 = SH2, 4 = sh4) smittet med vektor, ikke-silencible vildtype SAE2 eller ikke-silencible C- Et enzym død SAE2 mutant. Cellerne blev behandlet med Dox i 6 dage. Proteinlysater blev immunoblottedes med viste antistoffer. (B) ikke-silencible vildtype SAE2 redder shSAE2 celledød. Sub G1 population blev analyseret ved FACS. Fejlsøjler betegner s.d. (C) SA- β-Gal farvning af celler, der udtrykker angivne retrovirus kombination.

Hæmning af SUMO sti fører til DNA decatenation defekt og PML NB forstyrrelser

Et centralt spørgsmål er, hvordan tab af SAE2 aktivitet fører til endoreduplikation og apoptose. Efter 5 dages kontinuerlig behandling med doxycyclin, celler, der udtrykker SAE2 shRNAs udviklet abnorm cellekernemorfologi (Fig 5A). Celler ofte udviklet forstørrede kerner og almindeligt vises multi-fligede kerner (Fig 5A), tynde DNA broer, der forbinder to kerner (fig 5A, pil), og mikrokerner (Fig 5A, pilespids). Mitotiske abnormiteter, herunder multipolære spindler blev også observeret (Fig 5B). Disse resultater husker fænotypen observeret med defekt i DNA decatenation, hvor adskillelse svigt af sammenfiltrede kromosomer kan generere DNA broer, som fører til unormal mitose, nedsat cytokinese og kan reducere proliferation og levedygtighed [34]. Tidligere undersøgelser har rapporteret, at topoisomerase IIα (TopoIIα) er en SUMO substrat og SUMOylation er vigtig for TopoIIα aktivitet in vitro [35-37]. Western blots i HCT116 celler, der udtrykker kontrol eller SAE2 shRNA afsløret endogent SUMOylated TopoIIα arter, og knockdown af SAE2 hæmmede TopoIIα SUMOylation (Fig 5C).

(AB) HCT116 celler, der udtrykker tet inducerbart SAE2 shRNA (SH2) eller kontrol shRNA (ctrl) blev behandlet med Dox medium (0,5 ug /ml) i 5 dage. Cellerne blev fikseret og farvet med DAPI for at se kerner morfologi. (C) HCT116 celler, der udtrykker tet inducerbart SAE2 shRNA (SH2) eller kontrol shRNA (ctrl) blev behandlet med Dox i 4 dage og derefter immunoblottedes med TopoIIα antistof. (D-E) immunfluorescens billeder af HCT116 celler, der huser inducerbar shRNA med 5 dages behandling af Dox. Cellerne blev farvet med (D) PML eller (E) Daxx antistoffer. (F) SAE2 knockdown er forbundet med et øget p53-niveauer. U2OS celler, der udtrykker betinget SAE2 shRNAs blev behandlet med Dox og immunoblottedes med p53 og p21 antistoffer.

Da SUMOylation er involveret i mange cellulære processer, og vi observerede tegn på både apoptose og degeneration, vi undersøgte effekterne af SUMO vej værdiforringelse på PML nukleare organer. PML nukleare organer er nukleare matrix arrangørerne, der regulerer vigtige processer som apoptose og ældning.