PLoS ONE: Den Mu opioidreceptor Fremmer Opioid og vækstfaktor-proliferation, migration og Epithelial Mesenchymale Transition (EMT) i Human Lung Cancer

Abstrakt

Nyere epidemiologiske studier indebærer forskelle i kræft tilbagefald baseret på bedøvende regimer hæve muligheden for, at mu opioid receptor (MOR) kan påvirke kræft progression. Baseret på vores tidligere observationer, at overekspression af MOR i humane ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) -celler steg tumorvækst og metastase, denne undersøgelse undersøgt, om MOR regulerer vækstfaktorreceptor signalering og epithelial mesenkymale overgang (EMT) i humane NSCLC-celler. Vi udnyttede specifikke siRNA, shRNA, kemiske inhibitorer og overekspression vektorer i humane H358 NSCLC-celler, der enten var ubehandlede eller behandlet med forskellige koncentrationer af DAMGO, morfin, fentanyl, EGF eller IGF. Cellefunktion assays, immunoblot og immunopræcipitationsanalyser blev derefter udført. Vores resultater tyder MOR regulerer opioid og vækstfaktor-induceret EGF-receptor signalering (Src, Gab-1, PI3K, Akt og STAT3-aktivering), som er afgørende for efterfølgende menneskelige NSCLC celleproliferation og migration. Desuden humane NSCLC celler behandlet med opioider, vækstfaktorer eller MOR overekspression udviste en stigning i sneglen, slug og vimentin og mindske ZO-1 og claudin-1 proteinniveauer, resultater er i overensstemmelse med en EMT fænotype. Endvidere blev disse virkninger vendt med lyddæmpning (shRNA) eller kemisk hæmning af MOR, Src, Gab-1, PI3K, Akt og STAT3 (p 0,05). Vores data tyder på en mulig direkte virkning af MOR på opioid og vækstfaktor-signalering og deraf følgende spredning, migration og EMT overgang under lungekræft progression. En sådan effekt giver en plausibel forklaring på de epidemiologiske fund

Henvisning:. Lennon FE, Mirzapoiazova T, Mambetsariev B, Poroyko VA, Salgia R, Moss J, et al. (2014) Den Mu opioidreceptor Fremmer Opioid og vækstfaktor-proliferation, migration og Epithelial Mesenchymale Transition (EMT) i Human Lung Cancer. PLoS ONE 9 (3): e91577. doi: 10,1371 /journal.pone.0091577

Redaktør: Olivier de Wever, Ghent Universitet, Belgien

Modtaget: September 16, 2013; Accepteret: 13 februar 2014; Udgivet: Marts 24, 2014

Copyright: © 2014 Lennon et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Support var leveres fra institutionelle og /eller afdelinger kilder og National Institutes of Health indrømmer CTSA UL1 TR000430. De finansieringskilder havde ingen rolle i undersøgelsen design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Methylnaltrexon blev udviklet på University of Chicago og licenseret til Progenics Pharmaceuticals, efterfølgende sub -licensed til Salix Pharmaceuticals. Dr. Moss var en betalt konsulent for Progenics Pharmaceuticals og i øjeblikket er en betalt konsulent for Salix Pharmaceuticals. Han modtager royalties gennem University of Chicago. Der er ingen patent (er) eller patentansøgninger vedrørende materiale relevant for denne artikel. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

rolle anæstesi og analgesi i tilbagefald og metastatisk forekomst af maligniteter har for nylig modtaget betydelig opmærksomhed [1], [2], [3], [4]. Retrospektive undersøgelser har vist en formindsket forekomst af kræft tilbagefald efter regional anæstesi med lavere doser af opioider efter operationen for bryst-, prostata-, tyktarmskræft og modermærkekræft, selv om andre undersøgelser har undladt at påvise signifikante forskelle [5], [6], [7] , [8]. Nogle hypoteser til at forklare disse forskelle i tilbagefald satser omfatter immun undertrykkende effekter og direkte effekter på tumorcellevækst [9], [10], [11]. Vores forskning har fokuseret på mu opioid receptor (MOR) og dens rolle i direkte regulering af cellulære ændringer, der fører til tumorvækst og metastase [4], [12], [13].

Effektive terapeutiske strategier for lungekræft , den førende årsag til kræft-associerede dødelighed på verdensplan, er yderst begrænsede eksemplificerer behovet for tidlig diagnosticering og nye terapeutiske interventioner [14], [15]. Vi har tidligere rapporteret, at MOR er opreguleret i flere typer af humane ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) [12]. Endvidere har vi vist, at overekspression af MOR i humane NSCLC øger primær tumorvækst og metastase i xenograftmodeller [13]. Men de nøjagtige cellulære ændringer, der reguleres af MOR i NSCLC er ufuldstændigt defineret, [4]. For kræftceller til at vokse og metastaserer, der er behov for et tab af celle-celle-adhæsion (kendetegnet ved en reduktion af epitelial celleadhæsionsproteiner herunder tight junction proteiner, ZO-1 og claudin-1), efterfulgt af køb af mesenkymale karakteristika, herunder et tab af baso-apikal polarisering, cytoskeletal remodeling og øget celle motilitet (karakteriseret ved stigninger i specifikke cytoskeletale proteiner (dvs. vimentin) og transkriptionsfaktorer (dvs. Slug og Snail) [16], [17], [18], [19] . Denne orkestreret onkogene proces benævnes epitelial mesenkymale overgang (EMT) [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22].

vækst faktorreceptorer, herunder epidermal vækstfaktor receptor (EGFR), er ofte overudtrykkes og /eller muteret i NSCLC og regulere onkogene processer, herunder tumorcelleproliferation, migration og EMT overgang [23], [24], [25], [26] , [27]. Adskillige behandlingsformer rettet mod EGFR i NSCLC eksisterer herunder tyrosinkinasehæmmere (gefitinib, erlotinib) og monoklonale antistoffer (Cetuximabs) [28], [29], [30], [31]. Men den samlede overlevelse sats for NSCLC fortsat lav [32], [33], [34]. For nylig, Fujioka et al., Har vist, at morfin kan stimulere EGFR signalveje herunder serin /threonin-kinaser Akt og MAP-kinase i NSCLC antyder en rolle for MOR inhibering som en potentiel terapeutisk strategi til NSCLC [35].

Baseret på den nylige interesse af virkningerne af anæstesi og analgesi regimer på tilbagefald og metastatiske potentiale af forskellige kræftformer [1], [2], [3], [4], vores tidligere offentliggjorte data, der angiver MOR opreguleres i lunge væv fra patienter med NSCLC [12], overekspression af MOR fremmer tumorvækst og metastase i humane NSCLC xenograftmodeller [13] samt data fra Fujioka et al., viser MOR regulering af EGF-induceret signalering begivenheder i NSCLC [35], dette studie undersøgte de funktionelle effekter af MOR i de fundamentale onkogene processer opioid og vækstfaktor-induceret human lunge celle migration, spredning og epitelial mesenkymale overgang (EMT) [16], [17], [18], [19], [ ,,,0],20]. Da der i øjeblikket meget få oplysninger om opioid og /eller MOR regulering af EMT og de molekylære mekanismer, der integrerer kræft proliferation, migration og EMT, dette studie undersøgte de detaljerede molekylære mekanismer for disse begivenheder, som kan have potentiel klinisk anvendelighed.

Metoder

Cell Kultur og reagenser

Den humane NSCLC celle H358 blev opnået fra ATCC (Walkersville, MD) og dyrket i Roswell Park Memorial Institute komplet medium (Cambrex, East Rutherford, NJ) ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO2, 95% luft, med passager 6-10 anvendes til eksperimenter. Medmindre andet er angivet, blev reagenser fremskaffet fra Sigma (St. Louis, MO). Reagenser til SDS-PAGE-elektroforese blev indkøbt fra Bio-Rad (Richmond, CA) og Immobilon-P overførselsmembran blev indkøbt fra Millipore (Millipore Corp., Bedford, MA). Kanin-anti-MOR-antistof blev købt hos GeneTex (San Antonio, TX). Kanin anti-EGFR, kanin anti-phosphotyrosin-EGFR (pY

845, pY

992, pY

1045, pY

1068), kanin anti-GRB-2, kanin anti-Gab-1 , kanin-anti-phosphotyrosin-Gab-1 (pY

307, py

627), kanin-anti-Src, kanin-anti-phosphotyrosin-Src (pY

416), kanin-anti-p85 PI3 kinase, kanin anti-p55 PI3 kinase, kanin-anti-phosphotyrosin-p85 /p55 PI3 kinase (pY

458, py

199), kanin-anti-STAT3, kanin-anti-phosphotyrosin-STAT3 (pY

705), kanin anti-vimentin, kanin-anti-ZO-1, kanin-anti-claudin-1, kanin-anti-sneglen og kanin-anti-Slug antistoffer blev indkøbt fra cellesignalering Technologies (Danvers, MA). Muse anti-β-actin-antistof blev købt hos Sigma (St. Louis, MO). Sekundær peberrod peroxidase-mærkede antistoffer blev indkøbt fra Amersham Biosciences (Piscataway, NJ). N-methylnaltrexonbromid eller methylnaltrexon blev købt fra Mallinckrodt Specialty Chemicals (Phillipsburg, NJ). PI3 kinase inhibitor LY294002, Akt Inhibitor X, Src familie kinase inhibitor PP2 og STAT3 inhibitoren Stattic blev indkøbt fra EMD Biosciences (Billerica, MA).

immunblotting

Immunoblotting blev udført som vi har tidligere beskrevet. Cellulære materialer fra behandlet eller ubehandlet humane NSCLC-celler blev inkuberet med lyseringsbuffer (50 mM HEPES (pH 7,5), 150 mM NaCl, 20 mM MgCl

2, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 0,4 mM Na

3VO

4, 40 mM NaF, 50 pM okadainsyre, 0,2 mM phenylmethylsulfonylfluorid, 1:250 fortynding af Calbiochem proteaseinhibitor-blanding 3). Prøverne blev derefter kørt på SDS-PAGE i 4-15% polyacrylamidgeler, overført til Immobilon ™ membraner, og fremkaldt med specifikke primære og sekundære antistoffer. Visualisering af immunoreaktive bånd blev opnået under anvendelse forøget kemiluminescens (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). I nogle tilfælde blev der immunoreaktive bånd kvantificeret ved hjælp af computer-assisteret densitometri.

Små interfererende RNA transfektion i Human NSCLC Celler

Stabil Kontrol og enten MOR, Gab-1, eller Src siRNA (Santa Cruz bioteknologi, blev Santa Cruz, CA) transficeret i H358-celler, som vi tidligere har beskrevet [12]. Celler (~ 40% konfluente) blev serum-udsultet i 1 time efterfulgt af inkuberet med siRNA i 6 timer i serumfrie medier. Serumholdigt medium blev derefter tilsat (10% serum slutkoncentration) i 42 timer. Inhibition af protein-ekspression blev bekræftet ved immunoblotanalyse med specifikke antistoffer.

Stabil Kontrol og MOR Lille Hårnål RNA transfektion i Human NSCLC Celler

Stabil Kontrol og MOR shRNA (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) blev stabilt transficeret i H358-celler, som vi tidligere har beskrevet [12]. Celler (~ 40% konfluente) blev serum-udsultet i 1 time efterfulgt af inkuberet med shRNA i 6 timer i serumfrie medier. Serumholdigt medium blev derefter tilsat (10% serum slutkoncentration) i 42 timer og puromycinselektion reagens blev tilsat. Inhibition af protein-ekspression blev bekræftet ved immunoblotanalyse med anti-MOR-antistof (GeneTex, San Antonio, TX).

Stabil Vector Control og MOR1 Overekspression i Human NSCLC Celler

Myc-DDK-mærkede ORF klon af Homo sapiens opioidreceptor, mu 1 (OPRM1), transcript variant MOR-1 (OriGene Technologies Inc., MD) blev amplificeret under anvendelse af Platinum Taq DNA-polymerase high fidelity-enzym (Invitrogen, CA) og efterfølgende klonet ind i en pCR8 /GW /Topo entry-vektoren (Invitrogen, CA) ifølge producentens instruktioner. Plasmid-DNA blev ekstraheret fra udvalgte kloner ved QIAquick plasmid Mini kit (Qiagen, CA). ORF integritet og fragment orientering blev bekræftet ved sekventering. Den MOR1-Myc fusionsproduktet blev derefter overført til pcDNA3.2 /V5 DEST vector (Invitrogen, CA) by LR-reaktion. Den resulterende konstruktion (pcDNA3.2-MOR1-Myc) blev transficeret i H358 celler ved hjælp FuGENE HD ™ som transfektion reagens (Roche Applied Sciences) i henhold til den protokol, som Roche, som vi tidligere har beskrevet. Celler (~ 40% konfluente) blev serum-udsultet i 1 time efterfulgt af inkubering med pcDNA3.2-MOR1-Myc i 6 timer i serumfrie medier. Serumholdigt medium blev derefter tilsat (10% serum slutkoncentration) i 42 timer og neomycin udvælgelse reagens blev tilsat. Overekspression blev bekræftet ved immunoblotanalyse med anti-MOR-antistof (GeneTex, San Antonio, TX).

Menneskelig NSCLC Cell Proliferation Assay

Måling af

in vitro

NSCLC cellevækst blev udført som vi tidligere har beskrevet. Kontrol eller siRNA forbehandlet H358-celler (5 x 10

3 celler /brønd) blev inkuberet med 0,2 ml serumfrit medium indeholdende enten vehikel (kontrol), methylnaltrexon (MNTX, 100 nM), PI3 kinase inhibitoren LY294002 (10 uM), Akt inhibitor X (5 uM), Src familie kinase inhibitor PP2 (100 nM) eller STAT3 inhibitoren Stattic (10 uM) i 72 timer ved 37 ° C i 5% CO2 /95% luft i 96-brønds kultur plader.

in vitro

celleproliferationsassay blev analyseret ved måling stigninger i celleantal ved hjælp af CellTiter96 ™ MTS assay (Promega, Madison, WI) og aflæst ved 492 nm. Hver assay blev oprettet i tre eksemplarer og gentages mindst fem gange.

Menneskelig NSCLC cellemigrationsassay

Måling af

in vitro

NSCLC cellemigration blev udført som vi tidligere har beskrevet. Fireogtyve transwell enheder med 8 uM porestørrelse (Millipore, Billerica, MA) blev anvendt til overvågning

in vitro

cellemigrering som vi har beskrevet tidligere [12]. Kontrol eller siRNA forbehandlet H358-celler (5 x 10

3 celler /brønd) blev inkuberet med 0,2 ml serumfrit medium indeholdende enten vehikel (kontrol), methylnaltrexon (MNTX, 100 nM), PI3 kinase inhibitoren LY294002 (10 uM), Akt inhibitor X (5 uM), blev den Src-familien kinase inhibitor PP2 (100 nM) eller STAT3 inhibitoren Stattic (10 uM) udpladet på det øvre kammer og medier med serum blev tilsat til det nederste kammer. Cellerne fik lov til at migrere gennem porerne i 18 timer. Celler fra den øvre og nedre kammer blev kvantificeret under anvendelse af CellTiter96 ™ MTS assay (Promega, San Luis Obispo, CA) og aflæst ved 492 nm. % Migration blev defineret som den # af celler i det nedre kammer divideret med antallet af celler i både den øvre og nedre kammer. Hver assay blev oprettet i tre eksemplarer og gentages mindst fem gange.

Statistisk analyse

Resultaterne er udtrykt som gennemsnit ± standardafvigelse for tre uafhængige forsøg. Til analyse af data blev eksperimentelle prøver sammenlignet med kontroller ved uparret t-test. For multiple-gruppe sammenligninger, blev anvendt en envejs variansanalyse (ANOVA) og post hoc multiple sammenligninger tests. Forskelle mellem grupper blev betragtet som statistisk signifikant, når

P Drømmeholdet værdi var mindre end 0,05. Alle statistiske analyser blev udført ved anvendelse af GraphPad Prism-programmet (GraphPad Software Inc., USA).

Resultater Salg

Vores resultater i figur 1 viser, inhibering MOR med den perifere MOR antagonist MNTX dæmper EGF- induceret proliferation (figur 1-a) og migration (figur 1-B) af humane H358 NSCLC celler i en dosis-afhængig måde. Disse data tyder på en forbindelse mellem MOR og EGFR i H358 celler. At mekanistisk evaluere rolle MOR om EGF-induceret EGFR dynamik, vi behandlede H358 celler med EGF på forskellige tidspunkter og immunopræcipiteret EGFR at bestemme potentielle MOR forening. Figur 2-A viser, at EGF inducerer en kompleksdannelse mellem EGFR og MOR som topper ved 5 til 15 minutter efter EFG udfordring. Baseret på vores resultater, at en MOR /EGFR-komplekset kan opstå med EGF stimulering af H358 celler, vi næste undersøgt, om MOR kan regulere EGFR fosforylering. Ved hjælp af et panel af anti-phospho-EGFR-antistoffer, figur 2-B viser, at forbehandling af H358 humane NSCLC-celler med den perifere MOR antagonist MNTX ikke svækkede EGF-induceret EGFR tyrosinphosphorylering

Panel A:. Humant H358 ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) -celler blev analyseret for methylnaltrexon (MNTX) inhibering af EGF-medieret proliferation under anvendelse af et MTS proliferation assay. Celler blev væksten i nærvær af 100 ng /ml EGF og /eller 0-250 nM MNTX i 72 timer. MNTX Der er en statistisk signifikant forskel (p 0,05, angivet med en asterisk) mellem kontrol og MNTX (10, 50, 100, 250 nM) behandling med n = 3 pr tilstand og fejlsøjler = standardafvigelse. Se afsnittet Metoder til eksperimentelle detaljer. Panel B: Humant H358 ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) -celler blev analyseret for methylnaltrexon (MNTX) inhibering af migration EGF-medieret ved anvendelse af et transwell assay (8 uM porestørrelse). Cellerne fik lov til at migrere i nærvær af 100 ng /ml EGF og /eller 0-250 nM MNTX i 18 timer. Der er en statistisk signifikant forskel (p 0,05, angivet med en asterisk) mellem kontrol og MNTX (50, 100, 250 nM) behandling med n = 3 pr tilstand og fejlsøjler = standardafvigelse. Se afsnittet Metoder til eksperimentelle detaljer

Panel A:. Humant H358 ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) -celler blev behandlet med nogen (kontrol) eller 100 ng /ml EGF i 5, 15, eller 30 minutter. Cellelysater blev opnået og immunpræcipiteret med anti-EGFR-antistof. Immunoblots blev udført på totale cellelysater (venstre) og immunopræcipiteret materiale (højre) under anvendelse af anti-MOR (a) og anti-EGFR (b) antistoffer. Den mu opioid receptor rekrutteres til EGFR med EGF-stimulering. Panel B: Humant H358 ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) -celler var enten ubehandlede (kontrol) eller behandlet med 100 nM MNTX alene, 10 ng /ml EGF i 5, 15 eller 30 minutter, eller 100 nM MNTX og 10 ng /ml EGF i 5, 15 eller 30 minutter. Cellelysater blev opnået og immunblottet under anvendelse af anti-pY

845 EGFR (a), anti-pY

992 EGFR (b), anti-pY

1045 EGFR (c), anti-pY

1068 EGFR (d), anti-EGFR (e) og anti-actin (e) antistoffer. MNTX hæmmer ikke EGF-induceret EGFR-tyrosinphosphorylering.

Vi undersøgte næste hvorvidt MOR kan regulere EGFR nedstrøms signalmolekyler. Vi undersøgte først adapteren protein, en vækstfaktor-receptor-bundet protein 2 (GRB-2), som indeholder en SH2-domænet og to SH3 domæner og kan direkte binde EGFR [36]. Resultaterne af figur 3-A demonstrerer, ved anvendelse af immunopræcipitation af EGFR og immunoblotting med anti-GRB-2-antistof, at EGF inducerer EGFR /GRB-2 kompleksdannelse som dæmpes ved forbehandling af H358 celler med MNTX. Rekruttering af GRB-2 til EGFR er vigtig for plasmamembranen rekruttering og deraf tyrosinphosphorylering af stilladset protein, Grb2-associeret protein 1 (Gab-1) [37]. Figur 3-B viser, at EGF-stimulering af H358 celler inducerer tyrosinphosphorylering af Gab-1 (Tyr307 og Tyr627), som topper ved -5 minutter og dæmpes ved MOR hæmning med MNTX

Panel A:. Menneskelig H358 ikke -lille celle lungecancer (NSCLC) -celler var enten ubehandlede (kontrol) eller behandlet med 100 nM MNTX (1 time præinkubation), 10 ng /ml EGF i 15 minutter eller 100 nM MNTX og 10 ng /ml EGF. Cellelysater blev opnået og immunpræcipiteret med anti-EGFR-antistof. Immunoblots blev udført på totale cellelysater og immunpræcipiteret materiale ved anvendelse af anti-GRB-2 (a, c) og anti-EGFR (b, d) antistof. MNTX hæmmer EGF-induceret rekruttering af GRB-2 til EGFR. Panel B: Humant H358 ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) -celler var enten ubehandlede (kontrol) eller behandlet med 100 nM MNTX alene, 10 ng /ml EGF i 5, 15 eller 30 minutter, eller 100 nM MNTX og 10 ng /ml EGF i 5, 15 eller 30 minutter. Cellelysater blev opnået og immunblottet under anvendelse af anti-pY

627 Gab-1 (a), anti-pY

307 Gab-1 (b), og anti-actin (c) antistoffer. MNTX dæmper EGF-induceret Gab-1-tyrosinphosphorylering.

Siden tyrosinphosphorylering af Gab-1 ved forskellige tyrosinkinaser herunder Src fremmer binding til signalmolekyler, herunder phosphatidylinositol 3-kinaser (PI3K’er), som genererer PIP3 og aktivere nedstrømseffektorer herunder Akt og STAT3 [37], [38], [39], [40], [41], [42], vi næste undersøgt, om MOR inhibering også kan påvirke Gab-1-binding /effektormolekyler. Figur 4-A viser, at, ligesom Gab-1, EGF udfordring H358 celler inducerer tyrosinphosphorylering af Src (Tyr416), den regulerende PI3K alpha underenheder p85 og p55 (Tyr458 /Tyr199), og transkriptionsfaktoren STAT3 (Tyr705) der topper ved -5 minutter og dæmpes MOR inhibering med MNTX i en statistisk signifikant måde (figur 4B)

Panel a:. Humant H358 ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) -celler var enten ubehandlede (kontrol ) eller behandlet med 100 nM MNTX alene, 10 ng /ml EGF i 5, 15 eller 30 minutter, eller 100 nM MNTX og 10 ng /ml EGF i 5, 15 eller 30 minutter. Cellelysater blev opnået og immunblottet under anvendelse af anti-phospho-Src (pY

416) (a), anti-phospho-p85 /p55 PI3 kinase (pY

458 /pY

199) (b, c) , anti-phospho-STAT3 (pY

705) (d) og anti-actin (e) antistoffer. Panel B: Grafisk kvantificering af immunoreaktiviteten af ​​eksperimenter udført beskrevet i figur 3-B og Panel A med normalisering til den samlede specifikt protein og n = 3 uafhængige eksperimenter pr tilstand. En stjerne (*) angiver en statistisk signifikant forskel (p 0,05) fra kontrol. Fejlsøjlerne = standardafvigelse.

Vi næste undersøgt den mekanisme, hvormed EGF og DAMGO ([D-Ala2, N-MePhe4, Gly-ol] -enkephalin), et syntetisk opioid peptid med specificitet for MOR) inducerer proliferation og migration. Figur 5 illustrerer, at siRNA og /eller kemisk inhibering af MOR, Gab-1, Src, PI3K, Akt og STAT3 markant nedsætte EGF og DAMGO proliferation (figur 5-A) og migration (figur 5-B).

Panel a: Humant H358 ikke-småcellet lungecancer (NSCLC) -celler blev analyseret for EGF og DAMGO-medieret proliferation under anvendelse af et MTS proliferation assay. H358 humane NSCLC-celler var enten ubehandlede (kontrol) eller behandlet med 100 ng /ml epidermal vækstfaktor (EGF) eller 100 nM DAMGO i 72 timer med eller uden forbehandling af celler med den perifere MOR antagonist, methylnaltrexon (MNTX, 100 nM), MOR siRNA, Gab-1 siRNA, Src siRNA, PI3 kinase inhibitoren LY294002 (10 uM), Akt inhibitor X (5 uM), Src familie kinase inhibitor PP2 (100 nM) eller STAT3 inhibitoren Stattic (10 uM). Der er en statistisk signifikant forskel (p 0,05, angivet med en asterisk) mellem kontrol- og behandlingsgrupperne med n = 3 uafhængige forsøg pr tilstand og fejllinjer = standardafvigelse. Se afsnittet Metoder til eksperimentelle detaljer. Panel B: Humant H358 ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) -celler blev analyseret for EGF og DAMGO-medieret migration anvendelse af et transwell assay (8 uM porestørrelse). H358 humane NSCLC-celler var enten ubehandlede (kontrol) eller behandlet med 100 ng /ml epidermal vækstfaktor (EGF) eller 100 nM DAMGO i 18 timer med eller uden forbehandling af celler med den perifere MOR antagonist, methylnaltrexon (MNTX, 100 nM), MOR siRNA, Gab-1 siRNA, Src siRNA, PI3 kinase inhibitoren LY294002 (10 uM), Akt inhibitor X (5 uM), Src familie kinase inhibitor PP2 (100 nM) eller STAT3 inhibitoren Stattic (10 uM). Der er en statistisk signifikant forskel (p 0,05, angivet med en asterisk) mellem kontrol- og behandlingsgrupperne med n = 3 uafhængige forsøg pr tilstand og fejllinjer = standardafvigelse. Se afsnittet Metoder til forsøg detaljer.

Da meget lidt er kendt om MOR regulering af epitelial mesenchymale transformation (EMT), og de molekylære mekanismer, der integrerer kræft proliferation, migration og EMT, vi næste undersøgt, om MOR1 overekspression regulerer lungekræft EMT. I figur 6-A, B, observerede vi, at MOR overekspression i humane H358 NSCLC-celler inducerede en ændring i EMT markørekspression som er konsistent med en epitelial mesenkymale overgang [19]. Da MOR er den vigtigste receptor for visse opioider [4], [43], vi næste vurderet, om opioider kan inducere EMT i humane H358 NSCLC-celler. Figur 6-C viser, at DAMGO, morfin og fentanyl alle inducere EMT i NSCLC på en dosis-afhængig måde

Panel A:. Kontrol (ikke-transficeret) (C), stabil vektor kontrol (VC) og MOR1 overekspression (O /E) H358 cellelinier blev frembragt, cellelysater fremstillet og immunblottet med EMT markører anti-vimentin (a), anti-snail (b), anti-Slug (c), anti-claudin-1 (d), anti-ZO-1 (e), anti-MOR (f) og anti-actin (g) antistoffer. En stigning i vimentin, Sneglen og Slug ekspression og et fald i claudin-1 og ZO-1-ekspression antyder en epitelial mesenkymale overgang. Panel B: Grafisk kvantificering af immunoreaktiviteten af ​​eksperimenter udført beskrevet i panel A med n = 3 uafhængige eksperimenter pr tilstand. En stjerne (*) angiver en statistisk signifikant forskel (p 0,05) fra kontrol med fejllinjer = standardafvigelse. Panel C: H358 humane NSCLC-celler var enten ubehandlede, behandlet med 100 ng /ml epidermal vækstfaktor (EGF), 100 nM DAMGO, morfin eller fentanyl eller 100 ng /ml insulin-vækstfaktor (IGF) i 96 timer, opnåede cellelysater og immunblottet med EMT markører anti-vimentin (a), anti-snail (b), anti-Slug (c), anti-claudin-1 (d), anti-ZO-1 (e), anti-MOR (f) og anti-actin (g) antistoffer. Et fald i vimentin, Sneglen og Slug ekspression og en stigning i claudin-1 og ZO-1-ekspression antyder inhibering af epitelial mesenkymale overgang. Panel D: Kontrol shRNA eller MOR shRNA H358 cellelinier blev frembragt, cellelysater fremstillet og immunblottet med EMT markører anti-vimentin (a), anti-snail (b), anti-Slug (c), anti-claudin-1 (D ), anti-ZO-1 (e), anti-MOR (f) og anti-actin (g) antistoffer. En stigning i vimentin, Sneglen og Slug ekspression og et fald i claudin-1 og ZO-1-ekspression antyder en epitelial mesenkymale overgang.

I betragtning af disse H358 humane NSCLC-celler udtrykker basale niveauer af MOR og svare opioid behandling, vi undersøgte, om tavshed (shRNA) af MOR ville påvirke opioid og vækstfaktor-induceret EMT. Figur 6-D angiver MOR nedregulering inhiberer opioid og EGF /IGF-inducerede ændringer i EMT markør ekspression. Figur 7-A viser, at H358 celler vokser i kolonier med godt afgrænsede kanter og stærke celle-celle sammenvoksninger. I modsætning hertil morfin eller IGF-behandlede H358 celler viser et tab af celle-celle sammenvoksninger og en ændring fra terningformet til en langstrakt fænotype med flere cellulære fremspring synlige. Disse ændringer er i overensstemmelse med en epitelial mesenkymale overgang (EMT)

Panel A:. H358 humane NSCLC-celler var enten ubehandlede (kontrol), behandlet med 100 nm morfin eller 100 ng /ml insulin-vækstfaktor (IGF) til 96 timer og lysfelt billeder blev opnået (20 ×). H358 celler vokser i kolonier med godt afgrænsede kanter og stærke celle-celle sammenvoksninger. I modsætning hertil morfin eller IGF-behandlede H358 celler viser et tab af celle-celle sammenvoksninger og en ændring fra terningformet til en langstrakt fænotype med flere cellulære fremspring synlige. Disse ændringer er i overensstemmelse med en epitelial mesenkymale overgang (EMT). Panel B: H358 humane NSCLC-celler var enten ubehandlede, behandlet med 100 ng /ml epidermal vækstfaktor (EGF), 100 nM DAMGO, morfin eller fentanyl eller 100 ng /ml insulin-vækstfaktor (IGF) i 96 timer med eller uden forbehandling med den perifere MOR antagonist, methylnaltrexon (MNTX, 100 nM), Src familie kinase inhibitor PP2 (100 nM) eller STAT3 inhibitoren Stattic (10 uM). Cellelysater blev derefter opnået og immunblottet med EMT markører anti-vimentin (a, c, e) eller anti-claudin-1 (b, d, f) antistoffer. En stigning i vimentin udtryk og et fald i claudin-1-ekspression antyder en epitelial mesenkymale overgang.

Vi undersøgte dernæst potentielle signaltransduktionsveje proteiner, der potentielt kan regulere opioid og vækstfaktor-induceret EMT. Figur 7-B indikerer forbehandling med den perifere MOR antagonist, methylnaltrexon (MNTX), Src familie kinase inhibitor PP2 eller STAT3 inhibitoren Stattic vende opioid og vækstfaktor-inducerede ændringer i vimentin og claudin-1-ekspression. Desuden Figur 8 viser siRNA og /eller kemisk inhibering af MOR, Gab-1, Src, PI3K, Akt og STAT3 dramatisk inhiberer EMT (som bestemt ved inhibering af opioid og vækstfaktor-inducerede stigning i vimentin udtryk og fald i claudin- 1-ekspression). Både MNTX og MOR-hæmmer naloxon svækket opioid og vækstfaktor-induceret EMT indikation en generel effekt af MOR antagonister på denne proces (figur 7 og 8 og understøttende data, figur S1). Tilsammen vore data tyder MOR spiller en central rolle i de processer af proliferation, migration og epithelial mesenkymale overgang alene og sammen med opioider og vækstfaktorer

Panel A:. Grafisk fremstilling af% kontrol vimentin ekspression. H358 humane NSCLC-celler var enten ubehandlede, behandlet med 100 ng /ml epidermal vækstfaktor (EGF), 100 nM DAMGO, morfin eller fentanyl eller 100 ng /ml insulin-vækstfaktor (IGF) i 96 timer med eller uden forbehandling af celler med perifer MOR antagonist, methylnaltrexon (MNTX, 100 nM), MOR siRNA, Gab-1 siRNA, Src siRNA, PI3 kinase inhibitoren LY294002 (10 uM), Akt inhibitor X (5 uM), Src familie kinase inhibitor PP2 (100 nM ) eller STAT3 inhibitoren Stattic (10 uM). Cellelysater blev derefter opnået og immunoblottedes med EMT markør anti-vimentin antistof. Forsøg blev gentaget tre gange, og immunreaktive bånd blev analyseret ved hjælp af computer-assisteret densitometri. Der er en statistisk signifikant forskel (p 0,05 angivet med asterisk (*)) mellem kontrol- og behandlingsgrupperne med fejllinjer = standardafvigelse. En stigning i vimentin ekspression antyder en epitelial mesenkymale overgang. Panel B: Grafisk repræsentation af% kontrol claudin-1-ekspression. H358 humane NSCLC-celler var enten ubehandlede, behandlet med 100 ng /ml epidermal vækstfaktor (EGF), 100 nM DAMGO, morfin eller fentanyl eller 100 ng /ml insulin-vækstfaktor (IGF) i 96 timer med eller uden forbehandling af celler med perifer MOR antagonist, methylnaltrexon (MNTX, 100 nM), MOR siRNA, Gab-1 siRNA, Src siRNA, PI3 kinase inhibitoren LY294002 (10 uM), Akt inhibitor X (5 uM), Src familie kinase inhibitor PP2 (100 nM ) eller STAT3 inhibitoren Stattic (10 uM). Cellelysater blev derefter opnået og immunoblottedes med EMT markør anti-claudin-1-antistof. Tre uafhængige forsøg pr tilstand blev udført og immunoreaktive bånd blev analyseret ved hjælp af computer-assisteret densitometri. Der er en statistisk signifikant forskel (p 0,05 angivet med asterisk (*)) mellem kontrol- og behandlingsgrupperne med fejllinjer = standardafvigelse. Et fald i claudin-1-ekspression er antydede en epitelial mesenkymale overgang.

Diskussion

NSCLC, som tegner sig for -80% af alle lungekræfttilfælde, er en sygdom med høj dødelighed og få behandlingsmuligheder [44], [45]. Vi har tidligere rapporteret, at MOR er opreguleret i lungevæv fra patienter med NSCLC [12] og at overekspression af MOR fremmer tumorvækst og metastase i humane NSCLC xenograftmodeller [13].