PLoS ONE: Nikotin hæmmer Cisplatin-induceret apoptose via Regulering α5-nAChR /AKT signalering i Human Gastric Cancer Cells

Abstrakt

Gastrisk kræfttilfælde viser en stærk ætiologisk sammenhæng med rygning. Nikotin, hovedkomponenten i tobak, er en overlevelse agonist, inhiberer apoptose induceret af visse kemoterapeutiske midler, men de præcise involverede mekanismer forbliver stort set ukendt. For nylig undersøgelser har indikeret, at α5-nicotinacetylcholinreceptor (α5-nAChR) er stærkt forbundet med risikoen for lungekræft og nikotinafhængighed. Ikke desto mindre har ingen oplysninger været tilgængelig, om nikotin påvirker også udbredelsen af ​​humane gastriske kræftceller gennem regulering af α5-nAChR. For at evaluere hypotesen, at α5-nAChR kan spille en rolle i gastrisk cancer, undersøgte vi dens ekspression i gastrisk cancer væv og cellelinier. Ekspressionen af ​​α5-nAChR steg i gastrisk cancer væv sammenlignet med para-carcinom væv. I betragtning af de resultater, vi fortsatte med at undersøge, om nikotin inhiberer cisplatin-induceret apoptose via regulering α5-nAChR i gastrisk cancercellelinie. Resultaterne viste, at nikotin fremmes signifikant celleproliferation i en dosis og tidsafhængig måde gennem α5-nAChR-aktivering i humane gastriske celler. Endvidere nikotin inhiberede apoptose induceret af cisplatin. Silence af α5-nAChR poleres de beskyttende virkninger af nikotin. Men når co-administration LY294002, en inhibitor af PI3K /AKT-vejen, blev en øget apoptose observeret. Denne virkning korreleret med induktionen af ​​Bcl-2, Bax, Survivin og caspase-3 ved nikotin i gastriske cellelinier. Disse resultater antyder, at udsættelse for nikotin negativt kan påvirke den apoptotiske potentiale kemoterapeutiske lægemidler, og at α5-nAChR /AKT signalering spiller en central rolle i den anti-apoptotiske aktivitet af nikotin induceret af cisplatin

Henvisning:. Jia Y Sun H, Wu H, Zhang H, Zhang X, Xiao D, et al. (2016) Nikotin hæmmer Cisplatin-induceret apoptose via Regulering α5-nAChR /AKT signalering i Human Gastrisk kræftceller. PLoS ONE 11 (2): e0149120. doi: 10,1371 /journal.pone.0149120

Redaktør: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, UNITED STATES

Modtaget: Juni 1, 2015; Accepteret: 15 Januar 2016; Publiceret: 24 feb 2016

Copyright: © 2016 Jia et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. På grund af restriktioner, som Jinan Central Hospital, er tilgængelige efter anmodning data. Interesserede forskere kan kontakte Dr. Xiaoli Ma ([email protected]) for at anmode om adgang til data

Finansiering:. Dette arbejde er støttet af National Natural Science Foundation of China (nr 81.272.588) og Shandong Provincial Natural Science Foundation of China (nr ZR2012HM061and ZR2013CM010)

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft er en af ​​de hyppigste årsager. af kræftdødsfald i verden. Tilsyneladende er både genetiske og miljømæssige faktorer involveret i gastrisk carcinogenese. Tidligere fund har unraveled den stærke sammenhæng mellem cigaretrøg og mavekræft forekomst [1-3], men den detaljerede mekanisme er ikke fuldstændig undersøgt.

Nikotin, en vigtig komponent i cigaretrøg, har vist sig at være involveret i initiering, promotion, og endda progression af flere tumorer, herunder mavekræft. Flere linjer af beviser tyder på, at nikotin udøver sin cellulære funktioner gennem nikotin acetylcholin receptorer (nAChRs). Forskellige epitelceller, ikke kun neuronceller, udtrykkelige nAChRs og strukturen af ​​nAChR’er er en homo- (α7or α9) eller heteropentamer (α2-α10; b2-b4). Undersøgelser har vist, at nikotin stimulerede proliferationen af ​​humane gastriske cancerceller gennem dets interaktion med α7-nAChR [4, 5]. Mens forskellige medlemmer af nAChR familie kan regulere konvergerende signalveje, de ofte har forskellige og endda modsatrettede handlinger. For nylig har genom brede associationsstudier vist, at α5-nAChR er stærkt forbundet med risikoen for lungekræft og nikotinafhængighed [6, 7]. Ikke desto mindre har ingen oplysninger været tilgængelig, om nikotin påvirker også udbredelsen af ​​humane gastriske kræftceller gennem regulering af α5-nAChR.

Leveringen af ​​kemoterapeutisk middel cisplatin efter kirurgisk resektion definerer øjeblikket standard behandling for mavekræft [8 -10]. Desværre, erhvervet resistens over for cisplatin er almindelig og unddragelse af celle apoptose er anerkendt som en af ​​de vigtigste mekanismer, der er ansvarlige for cisplatin resistens [11, 12]. Især kunne nikotin hæmme apoptose induceret af cisplatin lungekræft celler [13-15] og oral cancer [16]. Den inhiberende virkning af nikotin på apoptose er blevet tilskrevet dens evne til at aktivere anti-apoptotiske proteiner som Bcl-2 og Survivin, samt inaktivering af proapoptotiske proteiner, såsom Bax og caspase-3, ved at kalde på både PI3K /AKT og PKC /ERK signalveje i cancerceller [13-15]. Denne effekt af nikotin på celleapoptose er også medieret af nAChRs, men udover α5-nAChR, synes at være involveret andre underenheder [17, 18].

Selv om mange af disse mekanismer er blevet observeret i lungekræft [19-21], er der ingen tegn på anti-apoptotisk virkning, og den mekanisme, der udøves af nikotin på mavens kræftceller. Formålet med den foreliggende undersøgelse var at undersøge nikotin inhiberer cisplatin-induceret apoptose via regulering α5-nAChR i gastrisk cancercellelinie. Desuden foreslår vi inddragelse af pro-overlevelse faktorer, såsom Bcl-2 og Survivin, aktiveret af AKT veje, henholdsvis.

Materialer og metoder

Etik Statement

undersøgelsen protokol den blev godkendt af Medical Ethics and human Clinical Trial Komité Jinan Central Hospital. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter.

Vævsprøver, Cell kultur og narkotikabehandling

Halvtreds formalinfikserede, paraffinindlejrede prøver indeholdende 40 eksemplarer af mavekræft og 10 para-karcinom væv blev retrospektivt og tilfældigt udvalgt fra filerne i Jinan Central Hospital, efter at protokollen blev godkendt af den lokale videnskabsetiske komité. Ifølge referat af rygning (eller ikke) i tilfælde historie af patienterne, 32 tilfælde havde ingen rygning indtagelse historie, 8 havde rygning indtagelse historie. Alle prøver blev evalueret for diagnose af to erfarne patologer til diagnose.

De humane gastrisk cancer cellelinjer MKN28, SGC7901, BGC823, MGC803, AGS, HGC27, og MKN45 blev opnået fra Cell Bank of Shanghai, Institute for Biokemi og Cellebiologi, Chinese Academy of Sciences. Celler blev dyrket i DMEM (Invitrogen) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS; Invitrogen), 1% antibiotika ved 37 ° C i 5% CO2 befugtet luft. I alle eksperimenter blev 60-70% sammenflydende celler vasket og inkuberet i serumfrit medium i 24 timer før behandling med nikotin, cisplatin og LY294002 (Sigma, St. Louis, MO) i den angivne tid.

Immunhistokemi

Immunohistokemisk farvning under anvendelse af streptavidin-peroxidase-metoden (SP metode) blev udført på 4 um snit af paraffinindlejrede prøver til påvisning α5-nAChR-ekspression i gastrisk cancer og para-carcinom væv. Kort fortalt, efter afparaffinering og hydratisering blev objektglassene behandlet med endogen peroxidase i 0,3% H

2O

2 i 30 minutter og blokeret i 2 timer ved stuetemperatur med 1,5% blokerende serum i phosphatbufret saltvand (PBS ). Snittene blev derefter inkuberet med anti-α5-nAChR-antistof (Abcam, Inc. Cambridge, MA) (1: 100 fortynding) ved 4 ° C natten over, vasket med PBS og inkuberet med sekundært anti-muse-biotinyleret antistof (KIT-5010 , Max Vision, Maixin.Bio, Kina) (1: 2000) i PBS i 30 minutter ved 37 ° C. Antistoffet binding blev påvist under anvendelse af streptavidin-biotin-peroxidase-kompleks /HRP (Code K0377, Dako) med 3, 3- diaminobenzidin i 3 min som et kromogent substrat. Objektglassene blev derefter let modfarvet med hæmatoxylin. Som en negativ kontrol blev dobbelte snit farvet uden eksponering til de primære antistoffer. Resultaterne blev observeret under et mikroskop.

kvantitativ real-time RT-PCR

Totalt RNA blev isoleret under anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. Femogtyve nanogram total RNA per prøve blev revers transkriberet ved hjælp af revers transkriptionsreaktion Kit (Takara Code: DRR061S) ifølge producentens instruktioner. Kvantitativ real-time PCR blev udført analyseret på Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System til bestemmelse af de relative mængder af α5-nAChR og β-actin (intern kontrol) mRNA’er udtrykt. SYBR Green Supermix blev anvendt til alle real-time PCR-reaktioner. PCR-primere anvendt i denne undersøgelse, er som følger: α5-nAChR Forward: GAAACTGAGAGTGGTAGTGGACCAA, Reverse: GGGCTATGAATTTCC AATCTTCAAC; glyceraldehyd 3-phosphatdehydrogenase (GAPDH) fremad, 5′-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3 ‘og revers, 5′-AGTCCTTCCACG ATACCAAAGT-3’. De kvantitative real-time PCR parametre var 95 ° C i 10 sekunder som en pre-denaturere trin efterfulgt af 40 PCR-cykler af 95 ° C i 5 s, 60 ° C i 30 s og 72 ° C i 10 min. Alle prøver blev udført tredobbelt i hvert forsøg. Den relative mængde mRNA blev beregnet ved hjælp af sammenlignende CT metode, efter normalisering til p-actin mRNA-niveauer.

Western blotting-analyse

Cellepellets blev homogeniseret i ekstraktionsbuffer (50 mmol /L Tris-HCI , pH 6,8, 0,1% SDS, 150 pmol /l NaCl, 100 mg /l phenylmethylsulfonylfluorid, 1 mg /l aprotinin, 1% NP-40 og 0,5% natriumorthovanadat), inkuberet ved 4 ° C i 30 minutter og centrifugeret i 20 minutter ved 12000 g /min. Totalt protein i cellelysatet blev målt med anvendelse af Bio-Rad kolorimetrisk kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Til Western blot-analyse blev samlet protein separeret på 10% SDS-PAGE og overført til nitrocellulosemembraner (0,45 um, Millipore, Billerica, MA, USA), som blev inkuberet i 24 timer ved 4 ° C med antistofferne for α5-nAChR (1: 500, ab41173 eller ab166718), AKT (1: 500, Epitomics Cat no: 1085-1), P-AKT (1: 500, Epitomics Cat no: 2118-1), Caspase-3 (1: 500, Epitomics Cat no: 1087-1), Bcl-2 (1: 500, Epitomics Cat no: 1017-1), survivin (1: 500, Epitomics Cat no: 2463-1) og GAPDH (1: 1000; ab37168), derefter peberrodsperoxidase-konjugeret anti-muse /kanin-IgG-antistof (Santa Cruz Biotechnology) efter en sidste vask. Signaler blev påvist med anvendelse af et forøget kemiluminescens (Amersham Pharmacia, Buckinghamshire, UK). GAPDH niveau var en intern standard

RNA-interferens

En dobbelt streng siRNA oligonukleotid rettet mod CHRNA5, som koder α5-nAChR, (forstand:. 5′-CCCGCAAACUACAAAAGUUTT-3 ‘, antisense: 5’ -AACUUUUCUAGUUUGCCGGTG-3 ‘) blev syntetiseret ved Shanghai Genepharma Co. Ltd. (Kina). Et par negativ kontrol siRNA blev også designet med sekvenser der er forskellige fra siRNA-CHRNA5 og ikke homologe med nogen sekvenser, som findes i genbank (sense: 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ‘, antisense: 5′-ACGUGACACGUUCGGAGA-3’). Cellerne blev udpladet i seks-brønds plader. Når cellerne nåede 30-50% konfluens, blev de siRNAs tilsat til en slutkoncentration på 50 nM med lipofectamin 2000 (Invitrogen) ifølge producentens anvisninger.

Cell Levedygtighed Assay

Cellelevedygtighed var bestemt ved CCK8 assay (Dojindo, Tokyo, Japan). Kort fortalt celler udpladet i plader med 96 brønde (1500 celler /brønd) blev behandlet med nikotin i de angivne doser. Den celleproliferationsassay blev udført ved tilsætning af 10 pi CCK8 opløsning til hver brønd, efterfulgt af inkubation ved 37 ° C i 2 timer. Absorbansen blev målt ved en bølgelængde på 450 nm ved hjælp af en mikropladelæser (Synergy 2 Multi-mode Microplate Reader, BioTek, Winooski, VT, USA).

Annexin V /7-AAD farvning

BGC823 celler blev dyrket ved sammenflydning i 6-brønds vævskulturplader (Falcon, Becton Dickinson Labware) i et komplet medium. Derefter blev mediet erstattet med frisk komplet medium eller ved serumfrit medium; Cellerne blev derefter stimuleret med 100 uM nikotin alene eller i kombination med 20 mM cisplatin i 24 timer baseret på vores tidligere data, trypsineret og vasket to gange med PBS. Cellerne blev farvet med PE-mærket annexin V /7-AAD (7-aminoactinomycine-D) i henhold til producentens anvisninger (annexin V /7-AAD kit, Becton, Dickinson and Company). Kort fortalt blev en vasket cellepellet resuspenderes i 500 pi bindingsbuffer. Derefter blev 5 pi Annexin-V-PE og 5 pi 7-AAD tilsat. Flowcytometrisk analyse blev udført umiddelbart efter supravital farvning. Dataindsamling og -analyse blev udført i et Becton Dickinson FACSCalibur flowcytometer hjælp CellQuest software. Cellerne i tidlige stadier af apoptose var AnnexinV positive og 7-AAD negative, mens cellerne i de sene stadier af apoptose var både AnnexinV og 7-AAD positive.

Hoechst 33342 farvning

Celler blev podet i 12-brønds vævskulturplader og behandlet med de angivne koncentrationer af nikotin og cisplatin. Ved afslutningen af ​​hver inkubation blev celler fikseret med 4% paraformaldehyd i 20 minutter, vasket med PBS og derefter inkuberet med Hoechst 33342 (1 ug /ml) i 10 minutter. Efter vask med PBS blev cellerne observeret ved anvendelse af et fluorescerende mikroskop (Olympus, Japan). Mindst 400 celler fra 12 tilfældigt udvalgte felter pr skål blev talt, og hver behandling blev udført tre gange.

Statistik analyse

Resultatet af immunohistokemi blev analyseret ved anvendelse af χ

2 prøve. Alle resultater blev præsenteret som gennemsnit ± S.D. fra tredobbelte eksperimenter udført på en parallel måde, medmindre andet er angivet. Betydningen af ​​forskellen mellem kontrolgrupper og nikotin behandlingsgrupper blev bestemt ved en to-halet t-test. Forskelle blev betragtet signifikant ved P 0,05 eller P 0.01.

Resultater

a5-nAChR udtryk i gastrisk cancer vævsprøver og cellelinier

udtryk for α5-nAChR blev opdaget og lokaliseret i paraffinindstøbt menneskelig gastrisk væv sektioner. α5-nAChR var primært lokaliseret på membranen af ​​tumorcellerne, selv om nogle cytoplasma farvning blev også observeret (Fig 1A). Ekspression af α5-nAChR var højere i mavekræft væv (77,5%, 31/40) end at der i para-carcinom væv (20%, 2/10). Resultaterne viste en tendens til, at den positive sats for α5-nAChR udtryk øget hos patienter med nikotin indtagelse historie (87,5%, 7/8) sammenlignet med patienter uden nikotin indtag historie (75,0%, 24/32).

A: Angivelse af α5-nAChR i gastrisk para-karcinom væv (Venstre) og cancer væv (højre). (IHC 200 ×); B: Protein udtryk for α5-nAChR i gastrisk cancer cellelinier (N87, MKN28, MGC803, BGC823, HGC27, SGC7901, MKN45, AGS); C:. Ekspressionen af ​​α5-nAChR-mRNA i de ovennævnte celler i (A) blev analyseret ved RT-PCR, og normaliseret med den for GAPDH

α5-nAChR-mRNA og protein kunne påvises i en panel af gastriske cancercellelinier. De cellelinjer udtrykte forskellige niveauer af α5-nAChR protein, hvor cellelinjer med en højere udtryk var BGC823, AGS og SGC7901 normaliseret til den i GAPDH (Fig 1B). Niveauerne af α5-nAChR-mRNA-ekspression påvist ved RT-PCR korrelerede med niveauerne af proteinekspression (fig 1C). BGC823 udtrykker højere niveauer af α5-nAChR end andre cellelinjer. For yderligere funktionelle eksperimenter blev BGC823 cellelinje valgt på grund af sin højere udtryk (velegnet til induktion af nikotin eller dæmpning af siRNA).

Nikotin forfremmet mavekræft proliferation gennem α5-nAChR

Til bestemme, om nikotin kan regulere proliferationen af ​​gastriske celler undersøgte vi effekten af ​​nikotin med forskellige koncentrationer på cellelevedygtighed i BGC823 af en CCK8 analyse (figur 2A). BGC823 blev udsat for nikotin (0, 1, 10, 100, 500, 1000 uM) i 24, 48 og 72 timer, hhv. Som vist i figur 2A, nikotin fremmes celleproliferation i en tidsafhængig og koncentrationsafhængig forhold. Nikotin signifikant stimuleret celleproliferation ved lavere koncentration (1, 10, 100, 500 uM) og tid (24-72 timer), men en mærkbar nedgang i celleantal blev observeret i nikotin-behandlede kulturer ved højere koncentration (1000 pM) og tid (72 h). Undersøgelser viste niveauer af nikotin i kroppen varierer meget blandt individer, selv når rygning samme antal identiske cigaretter [22-24] .Den koncentration af nikotin (100 uM) anvendes i den foreliggende undersøgelse efterlignede den daglige indtagelse af cigaretter i moderate rygere [ ,,,0],25, 26]. Koncentrationen af ​​nikotin (100 uM) svarer til koncentrationen i spyt i ryger, der indtag 25 cigaretter /dag [27]. For yderligere funktionelle eksperimenter blev koncentrationen af ​​nikotin (100 uM) valgt til at behandle gastriske celler i 24 timer

A:. BGC823 blev udsat for nikotin (0, 1, 10, 100, 500, 1000 um) i 24 , 48, og 72 timer hhv. Nikotin fremmes celleproliferation i en tidsafhængig og koncentrationsafhængig forhold; B: Behandling af nikotin i en dosis af nikotin (0, 1, 10, 100, 500, 1000 um) i 24 timer fremmet ekspressionen af ​​α5-nAChR-protein på en dosis-afhængig måde; C: Celler blev transficeret med α5-nAChR specifik siRNA (si-α5) og derefter behandlet med nikotin på 100 uM i 24 timer. α5-nAChR udtryk var signifikant faldt sammenlignet med røræg uspecifik kontrol siRNA (si-NC) og Nic (Nikotin) + si-NC-gruppe; D: Ved sammenligning med den si-NC, transfektion med si-α5 betydeligt hæmmet celledeling. * P 0,05 over den ubehandlede kontrol; Hvert eksperiment blev udført tre gange.

For at bestemme om nikotin-medieret fremme af celleproliferation i gastriske celler medieres gennem α5-nAChR signalering, analyserede vi effekten af ​​nikotin på ekspressionen af ​​α5- nAChR protein i BGC823 celler ved Western blot. Som vist i fig 2B, behandling af nikotin i en dosis af nikotin (0, 1, 10, 100, 500, 1000 uM) i 24 timer fremmet ekspressionen af ​​α5-nAChR-protein på en dosis-afhængig måde. For yderligere at bekræfte involveringen af ​​α5-nAChR-signalvejen i nikotin-medieret fremme af gastrisk cancer celleproliferation, blokerede vi α5-nAChR-proteinekspression ved transfektion BC823 celler med en α5-nAChR-specifik siRNA (si-α5-nAChR) ( fig 2C) og evalueret dens virkninger på nikotin-medieret fremme af celledeling ved CCK assay (fig 2D). Ved sammenligning med den krypterede uspecifik kontrol siRNA (si-NC), transfektion med si-α5-nAChR inhiberede celleproliferation. Desuden si-α5-nAChR transfektion signifikant reducerede nikotin-medieret fremme af celleproliferation i BGC823 celler (Fig 2D).

Nikotin hæmning af cisplatin-induceret apoptose

For yderligere at karakterisere apoptose virkninger af nikotin kombineret med cisplatin på BGC823 blev cisplatin anvendt til at inducere apoptose i BGC823 celler. Cellerne blev behandlet med 20 mM cisplatin [28]. Som vist i fig 3A, blev de apoptotiske celler afrundet i form og deres kerner udviste en fragmenteret morfologi og danner apoptotiske legemer. I modsætning hertil var cellerne co-behandlet med nikotin og cisplatin viste kun lidt nuklear fragmentering og få apoptotiske legemer

A:. Cisplatin inducerede celler apoptose sammenlignet med kontrollen. I modsætning hertil var cellerne co-behandlet med 100 pM nikotin og 20 mM cisplatin viste kun lidt nuklear fragmentering og få apoptotiske legemer ved fluorescensmikroskopi (200 X); B: Cisplatin-induceret apoptose blev analyseret ved AnnexinV /7-AAD-farvning. Flowcytometri plots viste, at forholdet mellem de samlede apoptotiske celler blev nedsat, når de udsættes for 20 mM cisplatin kombineret med 100 uM nikotin.

Cisplatin-induceret apoptose blev yderligere analyseret ved AnnexinV /7-AAD-farvning. Flowcytometri plots viste, at andelene af de samlede apoptotiske celler (AnnexinV + /7-AAD-) faldt from43.2 ± 2,32% to29.9 ± 1,26%, når de udsættes for cisplatin kombineret med 100 uM nikotin (Fig 3B). Disse resultater antydede, at nikotin kan undertrykke apoptose induceret af cisplatin.

α5-nAChR /AKT signalvej involveret i anti-apoptotiske virkninger af nikotin i cisplatin-induceret apoptose af BGC823 celler

For at bestemme rolle AKT i mediering af virkningerne af nikotin i disse celler, vi fastslået, om nikotin inducerer aktivering af AKT i BGC823 celler. I fig 4A, 20 mM cisplatin kraftigt undertrykt aktivitet af AKT (bane 2), men nikotin forøget AKT ekspression (bane 3) i nærvær af cisplatin. Det foreslået, at AKT blev aktiveret efter udsættelse for 100 uM nikotin i BGC823 celler som rapporteret i forskellige papirer [29, 30]. Nedreguleringen af ​​α5-nAChR-ekspression faldt P-AKT ekspression (bane 4). Behandling med 10 mM LY294002, en phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) /AKT pathway inhibitor, faldt de anti-apoptotiske virkninger af nikotin i BGC823 celler (bane 5). Derudover behandling med LY294002 kombineret med si-CHRNA5 transfektion signifikant undertrykt nikotin inducerede P-AKT proteinniveauer (bane 6). Disse data antyder, at α5-nAChR /AKT baner spiller en kritisk rolle ved mediering af virkningerne af nicotin og kemoterapi i gastriske cancerceller

A:. P-AKT blev aktiveret efter udsættelse for 100 pM nikotin i BGC823 celler (bane 2 og lane3). Cisplatin kraftigt undertrykt aktivitet af P-AKT (bane 1 og bane 2), men nikotin også induceret P-AKT i nærvær af cisplatin (bane 2 og bane 3). Nedregulering af α5-nAChR-ekspression faldt niveauet af P-AKT (bane 4 og bane 5). Behandling med LY294002 nedregulerede P-AKT ekspression (bane 3 og bane 5). Kombination LY294002 med si-CHRNA5 transfektion undertrykt nikotin induceret P-AKT protein niveauer (bane 3 og bane 6) betydeligt; * P 0,05; B: Cisplatin inducerede en stigning i caspase-3 og Bax-aktivering i BGC823 celler en formindskelse i Bcl-2 og survivin udtryk, hvorimod nikotin blokeret cisplatin induceret Bcl-2, Bax, caspase-3 og survivin udtryk; Med tavshed α5-nAChR-co-administreres LY294002, blev en forøget apoptose observeret med induktion af Bcl-2, Bax, Survivin og caspase-3 ved nikotin i BGC823 celler. * P 0,05; C: Vurdering af apoptose ved AnnexinV /7-AAD farvning i hver gruppe. BGC823 celler blev forbehandlet med 100 uM nikotin og cisplatin i 24 timer, og /eller si-α5-nAChR for 48 timer, og /eller AKT-inhibitor LY294002 for 24 timer, og høstet.

Vi yderligere undersøgt virkningerne af nikotin på cisplatin-induceret caspase-3 aktivering i BGC823 celler ved Western blot-assay. Som vist i fig 4B, cisplatin inducerede en stigning i caspase-3-aktivering, hvorimod nikotin blokeret cisplatin-induceret caspase-3 aktivering i BGC823 celler. Endvidere eksponering af BGC823 celler til cisplatin forårsagede ekspressionen af ​​apoptotiske protein Bax steg mens prosurvival protein Bcl-2 og Survivin faldet, hvilket blev inhiberet ved behandling med nikotin.

mellemtiden, som vist i fig 4C anti-apoptotisk effekt af nikotin var tydeligvis blokeret af si-α5-nAChR i BGC823 celler. Flowcytometri plots viste, at andelen af ​​de samlede apoptotiske celler (AnnexinV + /7-AAD-) steg fra 18,5 ± 0,92% til 34,9 ± 1,74% efter si-5 behandling sammenlignet med si-NC-gruppe. Tilsætning af AKT-inhibitor LY294002 med si-α5-nAChR væsentligt fremmet apoptotiske effekt af cisplatin fra 31,5 ± 1,57% til 61,2 ± 3,06% sammenlignet med LY294002 gruppe. Disse resultater indikerer, at nikotin spiller en vigtig rolle i forebyggelsen af ​​cisplatin-induceret apoptose via α5-nAChR /AKT signalvej.

Discussion

Denne undersøgelse er den første til at påvise en vital rolle α5-nAChR i nikotin anti-apoptose af cisplatin i humane gastriske cancerceller. Analysen af ​​kliniske prøver indikerede, at α5-nAChR-ekspression er generelt højere i tumorceller sammenlignet med para-carcinomceller. Resultaterne viste en tendens til, at den positive sats for α5-nAChR udtryk var højere hos patienter med nikotin indtag historie end patienter uden nikotin indtagelse historie. In vitro resultater viste, at nikotin opreguleret ekspression af α5-nAChR-protein og hæmmede cisplatin-induceret apoptose ved at regulere α5-nAChR /AKT signalvejen i gastriske cancerceller. Nikotin forhindrede cisplatin-induceret aktivering af caspase-3 og Bax, og opreguleret ekspression af anti-apoptotiske proteiner, Bcl-2 og Survivin. Endvidere aktivering af AKT viste sig at spille en rolle ved mediering cisplatin-induceret apoptose, samt anti-apoptotiske virkninger af nikotin i BGC823 celler. Det kan være interessant at være opmærksom på forholdet mellem cigaretrøg (anden rygning) og gastrisk kræfttilfælde.

Tidligere resultater har unraveled den stærke sammenhæng mellem cigaretrøg og gastrisk kræft [31, 32]. Nikotin har vist sig at forøge proliferation og migrering af gastriske cancerceller ved at inducere cyclooxgenase-2 (COX-2), prostaglandin E2, VEGF, p-adrenoceptorer, proteinkinase C [26, 33, 34]. Disse virkninger synes at være medieret gennem homopentameric a7-nAChR’er [35]. Imidlertid har nyere undersøgelser vist, en uventet effekt af de heteropentameric a5-nAChRs på nikotin indtag [36-38]. Vores tidligere værker rapporterede, at nikotin /α5-nAChR-pathway er kritisk for levedygtighed lungekræft celle [21, 39]. Ikke desto mindre har ingen oplysninger været tilgængelig, om nikotin påvirker også udbredelsen af ​​humane gastriske kræftceller gennem regulering af α5-nAChR. Her, studerede vi rollen som α5-nAChR i human gastrisk cancer. Vores resultater viste, at ekspression af α5-nAChR var højere i gastrisk cancer væv sammenlignet med para-carcinom væv, hvilket antydede, at α5-nAChR kan spille en rolle i gastrisk carcinogenese. Endvidere nikotin fremmet α5-nAChR-proteinekspression og blokerer aktiveringen af ​​α5-nAChR af siRNA svækkede nikotin-induceret gastrisk cancer celleproliferation. Det foreslået, at α5-nAChR er en af ​​de store molekyler til medierer celleproliferation stimuleret af nikotin i gastriske cancerceller.

Den nuværende standard kemoterapi for mavecancer er cisplatin, men succesraten med denne behandling er dårlig. Virkningen af ​​cisplatin afhænger af evnen til at inducere DNA-beskadigelse [40, 41]. Derfor hvordan kræftceller reagerer på cisplatin-induceret apoptose spiller en kritisk rolle i cisplatin følsomhed. Nylige rapporter viser, at nikotin hæmmer cisplatin-induceret apoptose i lungekræft celler, kræft i mundhulen, RAW264.7 og EL4 celler [13, 16, 18], hvilket kan tyde på, at nikotin har evnen til ikke blot at fremme udviklingen af ​​kræft ved at aktivere celle vækst veje , men også for at reducere effekten af ​​kemoterapeutiske stoffer ved at stimulere overlevelse veje. Efter aftale med de tidligere resultater, resultater fra den foreliggende undersøgelse viste, at samtidig behandling af cellerne med cisplatin og nikotin, en signifikant aktivering af caspase-3 blev observeret, hvilket indikerer, at nikotin er i stand til at bestemme en inhibering af den apoptotiske potentiale cisplatin i mavekræft.

De signalveje, der regulerer celle processer, herunder celleproliferation, cellecyklusprogression og celle apoptose, har stor indflydelse på at beslutte cellulære respons på cisplatin. Tidligere undersøgelser har vist, at aktivering af AKT pathway kan føre til resistens over for cisplatin [42, 43]. En overekspression af serin phosphoryleret AKT er blevet detekteret i en lang række humane cancere, herunder mavecancer [44, 45]. Som rapporteret i forskellige papirer, nikotin ved binding til nAChR fører til nedstrøms aktivering af tumorfremmende proteiner, herunder aktivering af AKT pathways [46-48]. Udsættelse for nikotin kan have negativ indflydelse på den apoptotiske potentiale cisplatin i humane orale kræftceller, og AKT-vejen var nødvendig for nikotin-funktion [16]. Imidlertid AKT pathway af nikotinsyre nedstrøms signalering og anti-apoptotiske virkninger af nikotin i gastriske cancerceller var ukendte. Derfor undersøgte vi, om P-AKT kan forklare den antagoniserende virkning af nikotin på cytotoksiciteten af ​​cisplatin. Vi fandt, at co-behandlet med siRNA-α5-nAChR og LY294002, en PI3K /AKT pathway inhibitor, øget cisplatin-induceret apoptose og svækkede virkningerne af nikotin i BGC823 celler. Flere undersøgelser fremhævet nikotin aktiveret AKT signaleringsveje er i modulering af celleproliferation og overlevelse gennem aktivering af prosurvival protein Bcl-2 og Survivin [15, 49, 50]. Vores forskning viste også, at rollen af ​​nikotin på celle apoptose induceret af cisplatin gennem α5-nAChR /AKT bekræftes af induktion af Survivin og Bcl-2, som endelige effektorer af de ovennævnte veje.

Sammenfattende demonstrerede vi at nikotin aktiveret α5-nAChR /AKT-signalering og er involveret i modstanden af ​​cisplatin i mavekræft. Disse resultater giver ny indsigt i de mulige molekylære mekanismer af nikotin inhibering af cisplatin-induceret apoptose i humane gastriske cancerceller (Fig 5). Nikotin til stede i cigaretrøg kan forstyrre mavekræft farmakologisk behandling ved at hæmme kemoterapeutiske lægemiddel-induceret apoptose. Strategier rettet mod at forstå nikotin-medieret signalering kan fremme udviklingen af ​​bedre behandlinger i mavekræft.

Nikotin kan interagere med α5-nAChR på overfladen af ​​gastrisk kræftceller, så aktivere AKT signalvejen og opregulere Survivin og Bd-2 udtryk for at forhindre cisplatin-induceret apoptose.

Støtte Information

S1 fig. Ekspression af α5-nAChR og α7-nAChR uden eller med α5-siRNA behandling

doi:. 10,1371 /journal.pone.0149120.s001

(TIF)

S2 Fig. Nedregulering af α5-nAChR udtryk faldt niveauet af P-AKT

doi:. 10,1371 /journal.pone.0149120.s002

(TIF)

S3 Fig. Ekspression af α5-nAChR i BGC823 celler uden eller med si-α5-nAChR behandling

doi:. 10,1371 /journal.pone.0149120.s003

(TIF)

S4 Fig. Nikotin forfremmet BGC823 celledeling gennem α5-nAChR og α7-nAChR

doi:. 10,1371 /journal.pone.0149120.s004

(TIF)

S5 Fig. Nikotin forfremmet SGC7901 celledeling gennem α5-nAChR

doi:. 10,1371 /journal.pone.0149120.s005

(TIF)

S6 Fig. Nikotin hæmning af cisplatin-induceret apoptose af SCG7901

doi:. 10,1371 /journal.pone.0149120.s006

(TIF)