PLoS ONE: Den C-terminale fragment af prostataspecifikt antigen, en 2331 Da peptid, som en ny Urinary patognomonisk Biomarkør Kandidat til Diagnosticering prostatakræft

Abstrakt

Baggrund og mål

Prostatakræft (PCA) er en af ​​de mest almindelige kræftformer og hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald blandt mænd. Masse screening er udført siden 1990’erne ved hjælp af prostata-specifikt antigen (PSA) niveauer i serum som en PCa biomarkør. Selv om PSA er en fremragende organspecifik markering, er det ikke en cancer-specifik markør. Derfor er formålet med denne undersøgelse var at opdage nye biomarkører til diagnosticering af PSA.

Materialer og metoder

Vi fokuserede på urinprøver bortfalder efter prostata massage (digital rektal undersøgelse [DRE]) og gennemført en peptidomic analyse af disse prøver ved anvendelse af matrix-assisteret laser desorption /ionisering time-of-flight massespektrometri (MALDI-TOF /MS

n). Urinary biomaterialer blev koncentreret og afsaltet ved anvendelse af CM-Sepharose før analyserne udføres af MALDI-TOF /MS

n følgende: 1) forskellen analyser af massespektre; 2) bestemmelse af aminosyresekvenser; og 3) kvantitative analyser ved anvendelse af en stabil isotop-mærkede interne standard.

Resultater Salg

Multivariate analyse af MALDI-TOF /MS massespektre af urin ekstrakter afslørede en 2331 Da peptid i urinprøver efter DRE. Dette peptid blev identificeret som et C-terminalt PSA fragment sammensat af 19 aminosyrerester. Desuden kvantitativ analyse af forholdet mellem isotopmærkede syntetiske og intakte peptider under anvendelse MALDI-TOF /MS viste, at dette peptid kan være en ny patognomonisk biomarkør kandidat, der kan differentiere PCA patienter fra ikke-cancerpatienter.

Konklusion

resultaterne af den foreliggende undersøgelse viser, at 2331 Da peptidfragment af PSA kan blive en ny patognomonisk biomarkør til diagnosticering af PSA. En yderligere undersøgelse storstilet i øjeblikket på at vurdere muligheden for at anvende dette peptid i tidlig påvisning af PCa

Henvisning:. Nakayama K, Inoue T, Sekiya S, Terada N, Miyazaki Y, Goto T, et al. (2014) C-terminal Fragment af prostataspecifikt antigen, en 2331 Da peptid, som en ny Urinary patognomonisk Biomarkør Kandidat til Diagnosticering prostatakræft. PLoS ONE 9 (9): e107234. doi: 10,1371 /journal.pone.0107234

Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Østrig

Modtaget: Juni 12, 2014, Accepteret: August 8, 2014; Udgivet: 18 September, 2014

Copyright: © 2014 Nakayama et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Denne forskning blev ydet af Japan Society for fremme af videnskab gennem “Finansiering Program til verdens førende innovative R dvs. PCA patienter og ikke-cancerpatienter. Den bekræftende diagnose af PCa blev foretaget af en histologisk diagnose fra prostata biopsi prøver eller prostata kirtler fjernet efter kirurgi, når de udføres. Halvtreds prøver blev indsamlet fra PCA patienter, og deres kliniske karakteristika er vist i tabel 1. De kliniske karakteristika for ikke-cancerpatienter blev vist i tabel 2. Alle urinprøver fra ikke-cancer gruppe blev indsamlet før holmium laser enucleation af prostata (HoLEP), transuretral resektion af prostata (TURP), og nålebiopsi af prostata, når de udføres. De diagnoser af ikke-cancerpatienter blev defineret som ikke-malign ved histologiske diagnoser af prostatakirtler fjernes ved HoLEP og TURP og prostata prøver taget ved nålebiopsi, undtagen to tilfælde (nr 14 og 15), der ikke modtog nålebiopsi grund af meget lavt serum PSA og normal DRE. Nitten non-cancer prøver blev indsamlet. Alle histologiske diagnoser blev bekræftet af uro-genital patologer i vores hospital.

Kemikalier og reagenser

Tris [hydroxymethyl] aminomethan (Tris), Triton X-100, og urea var indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Molekylærbiologisk kvalitet 3 – [(cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propansulfonat (CHAPS) blev indkøbt fra Calbiochem (San Diego, CA, USA). Alt vand anvendt i dette eksperiment, bortset fra HPLC-system, blev fremstillet under anvendelse af en Milli-Q-systemet (Millipore, Bedford, MA, USA). Acetonitril (ACN) med og uden 0,1% myresyre (FA), og vand med og uden 0,1% FA for LC-MS Chromasolv blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Alle andre reagenser var af højeste kvalitet kommercielt tilgængelige

urinprøve samling

Urinprøver blev indsamlet som følger:. En urolog udført DRE ved forsigtigt at massere hver side af prostata tre gange, hvilket stimuleret bevægelsen og frigivelse af prostata væske ind i urinrøret. Disse prostata væsker blev indsamlet når emnerne udtømt urin efter massage. Urinprøverne opsamlede blev filtreret med 100-um nylon cell strainers (BD Falcon, San Jose, CA, USA) og centrifugeret ved 2.000 x g i 10 minutter ved 20 ° C for at udelukke urin debris. Efter centrifugering blev supernatanterne filtreret igen med cellen harper. Den filtrerede supernatant af urinprøverne blev opbevaret ved -80 ° C indtil senere analyser.

forberedelse urinprøve

I den foreliggende undersøgelse, urin peptider og proteinfragmenter fanget ved ionbytning Sepharoseharpiks blev analyseret ved anvendelse MALDI-TOF /MS

n. CM-Sepharose Fast Flow (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) blev anvendt som en ionbytterharpiks til at indfange og koncentrere peptiderne og proteinfragmenter i urinprøven, samt at afsalte koncentrerede prøver. Et in-house bygget MALDI digital ion trap (DIT) TOF /MS

n fremstillet af Shimadzu Corporation (Kyoto, Japan) blev anvendt til massespektrum-analyse. Differential analyser af urin masse spektrum data mellem 2 faggrupper (ikke-kræft og PCA) blev udført ved hjælp af ion-trap reflectron form for MALDI-DIT-TOF /MS. Peak identifikationer blev også udført i reflectron ion-trap-tilstand. Peak lister opnået fra MS

2 spektre blev anvendt til at identificere aminosyresekvens med den Mascot MS

søgningen 2 engine (Matrix videnskab, London, UK).

Frosne urinprøver (1,0 ml) blev optøet ved centrifugering ved 1000 x g i 15 minutter ved 20 ° C. Fire hundrede pi lysisbuffer (9 M urea, 2% CHAPS, 50 mM Tris, pH 9) blev tilsat til hver urinprøve og blandingerne blev inkuberet i 30 minutter ved 4 ° C med rotation. De denaturerede urinprøver blev tilsat til 3,6 ml bindende buffere (100 mM ammoniumacetat, pH 4, 0,05% Triton-X). Ninety pi 30% aktiveret CM-Sepharose blev tilsat til hver af de ovenfor bindingsbuffer blandinger og vortexet godt. Rørene blev inkuberet i 30 minutter ved 4 ° C med rotation. Efter at være blevet inkuberet, blev rørene centrifugeret ved 1.000 x g i 10 minutter ved 20 ° C. Supernatanterne blev kasseret ved hjælp af en 5-ml Finnpipette F1 (Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finland). Bundfaldene, CM-Sepharose-indfangede peptider og proteinfragmenter, blev overført til 1,5-ml mikrorør.

Harpikserne blev vasket tre gange med bindingsbuffer og destilleret vand til LC-MS. Vask involverede centrifugering (3.000 x g i 3 min ved 20 ° C med bindingsbuffer og 5.000 x g i 3 min ved 20 ° C med destilleret vand), idet supernatanterne, og tilsætning vaskeopløsninger. I det afsluttende vasketrin blev rørene centrifugeret ved 10.000 x g i 5 minutter ved 20 ° C og så meget vask destilleret vand som muligt blev trukket tilbage. Femogtyve pi 1% trifluoreddikesyre (TFA) opløsning blev tilsat til den CM-Sepharose harpiks til eluering de indfangede peptider og proteinfragmenter, og pipetteret godt i 2 min. Rørene blev centrifugeret ved 12.000 x g i 5 minutter ved 20 ° C. Kun supernatanterne blev udtaget og overført til andre mikrorør. Rørene blev centrifugeret ved 14.000 x g i 5 minutter ved 20 ° C, og supernatanterne blev overført til andre mikrorør. Disse supernatanter tjente som urinprøven ekstrakter.

Vi målrettet intakte peptider og proteinfragmenter mellem 1000 og 5000 Da i urinprøverne fordi deres aminosyresekvenser direkte kunne bekræftes ved MALDI-DIT-TOF /MS

2 i dette molekylvægtområde.

DHB matrix og MALDI plade

DHB (2,5-dihydroxybenzoesyre) matrix-opløsning blev fremstillet ved at opløse 5 mg af DHB (LaserBio Labs, Sophia- Antipolis Cedex, Frankrig) i 500 pi 50% acetonitril /0,1% TFA. I DHB matrix analyse blev en 0,5 pi alikvot af eluatet blandet med et tilsvarende volumen af ​​DHB matrix opløsning. De forblandede prøver blev spottet på følgende plader og lufttørret ved stuetemperatur; μFocus MALDI plade 900-um (384 cirkler, HST, Inc., Newark, NJ, USA) for forskellen analyser af massespektre eller en 384-stilling rustfri måltavle (Shimadzu Biotech, Kyoto, Japan) til kvantitative analyser af en potentiel biomarkør til diagnosticering af af PSA.

massespektrometrisk Målinger

i MALDI-DIT-TOF /MS

n, argongas blev anvendt til kollision-induceret dissociation fragmentering, og helium gas blev anvendt til ion køling. MS og MS

n analyser blev udført i positiv ion udvinding mode. Alle analyser blev udført under højvakuum tilstand (5 x 10

-5 Pa).

Massespektre blev eksternt kalibreret med en manuelt fremstillet 7-peptid standard bestående af angiotensin II ([M + H]

1046,54), angiotensin I ([M + H]

1296,69), Glu-fibrinopeptid B ([M + H]

1570,68), N-acetyl renin-substrat ([M + H]

1800,94), ACTH (1-17) ([M + H]

2093,09), ACTH (18-39) ([M + H]

2465,20), og ACTH ( 7-38) ([M + H]

3657,93)

Måling forhold i forskellen analyser af massespektre blev fastsat som følger:. 1) en μFocus plade blev anvendt som målet plade, 2 ) laserbestrålingen-stillingerne blev manuelt fokuseret til prøven-matrix-blanding af hver brønd, 3) antallet af bestråling punkter var 100, 4) antallet af bestråling skud var 64, og 5) lasereffekten blev fastsat til 85 arbitrære enheder. I alt 6400 spektre blev målt per brønd. Analyser blev udført in duplo, og en udtrukket alikvot blev anbragt i 2 brønde. Derfor blev data fra en urinprøve, der består af 4 rå datapunkter med 6400 spektre. Variationskoefficienten om intensiteter på flere store toppe, især på en biomarkør kandidat højdepunkt, blev mindre end 10% under disse analytiske betingelser (data ikke vist).

Databehandling af MS spektrum data og multivariat analyse

Mass spektrum rådata eksporteret gennem DIT-FP Console-softwaren (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan) til MALDI-DIT-TOF /MS som mzXML filer og importeres til MATLAB softwareversion 7,11 (The MathWorks Inc., Natick, MA, USA). MATLAB blev støttet af Bioinformatik Toolbox og statistik Toolbox. Følgende databehandling blev udført ved hjælp af værktøjskassen funktioner for at opdage og tilpasse toppe fra flere spektre. 1) En glat spektrum blev opnået ved hjælp af lokalt vægtet scatter plot udjævning (mslowess funktion [20]). 2) baseline blev trukket fra spektret ved hjælp af en spline tilnærmelse (msbackadj funktion [21]). 3) spektret blev normaliseret ved at dividere med det samlede ionstrøm. 4) Toppe blev detekteret ved at filtrere støj med undecimated diskrete wavelet transformation (mspeaks funktion [22]). 5) Peak lister blev genereret fra flere spektre ved at gentage behandlingen fra 1) til 4). 6) Peak lister blev justeret til at matche toppe på tværs af spektre (mspalign funktion [23]). peak lister CSV-formateret blev derefter eksporteret fra MATLAB og indført i en multivariat analyse software, dvs. SIMCA 13.0.3 (Umetrics AB, Umeå, Sverige [24], [25]). Alle importerede data var Pareto skaleret før multivariate analyse. Principal komponent analyse (PCA) blev anvendt til ukontrollerede multivariate analyser, og ortogonale partielle mindste kvadraters diskriminant analyse (OPLS-DA) blev anvendt til overvåget multivariate analyser. PCA og OPLS-DA modeller blev afbildet som score plots (hovedkomponent [PC1, PC2]), der viste nogen iboende gruppering af prøver baseret på spektrale variationer. I OPLS-DA-analyse, blev udvalgt potentielle biomarkører baseret på S-plot. Plottet af kovariansen versus korrelationen sammenholdt med de variable trend plots resulterede i lettere visualisering af data. De variabler, der ændrede de fleste blev afbildet i toppen eller bunden af ​​”S” formet plot, og dem, der ikke varierer betydeligt blev plottet i midten.

peptid rensning og Edman nedbrydning

i Edman-nedbrydning analyse af den N-terminale aminosyresekvens af det

m /z

2332 peptid blev oprensning af peptidet ved omvendt fase-HPLC udføres under anvendelse af en Shimadzu LC-20AD serie HPLC-system udstyret med en SPD-M20A diodearraydetektor (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan). En Luna C-18 søjle (5 um partikelstørrelse, 4,6 mm ID x 250 mm Phenomenex, Torrance, CA, USA) blev anvendt til oprensningsprocessen. HPLC betingelser var som følger: søjlen ovntemperaturen var 40 ° C, strømningshastigheden var 1,0 ml /minut, vand med 0,1% FA og ACN med 0,1% FA blev anvendt som opløsningsmidler A og B henholdsvis gradientbetingelse blev opretholdt ved 10%, som opløsningsmiddel B, i 2 min efter en 20-pi prøve injektion og var lineær fra 10% til 80% i 15 minutter. Eluerede peptider blev monitoreret ved 276 nm. Peptidet eluerede mellem 6,6 min og 6,9 min blev samlet i en mikrorør.

Den automatiserede Edman-nedbrydning af den N-terminale aminosyresekvens blev udført på RP-HPLC oprensede peptider under anvendelse af en Procise Model 491-sekventeringsapparat (Applied Biosystems , Inc., Foster City, CA, USA).

AQUA peptider og kvantitative analyser

Vi opnåede ikke-mærkede syntetiske peptider og isotopmærkede syntetiske peptider fra Sigma-Aldrich Japan (Ishikari , Japan). En brugerdefineret AQUA peptidsættet for massespektrometri blev syntetiseret af Sigma-Aldrich Japan til mere end 95% renhed, blev portioned i 1,0 nmol, og blev opbevaret som lyofiliseret pulver ved -30 ° C indtil anvendelse. Aminosyresekvensen af ​​AQUA isotop-mærket peptid var YTKVVHY [R-

13C

6, –

15N

4] KWIKDT [I-

13C

6, –

15N] VANP. Efterfølgende molekylvægten tilvækst i isotop-mærket peptid (i forhold til den ikke-mærkede peptid) var 17 Da. Dette peptid blev anvendt som en intern standard (ISTD) for de kvantitative analyser af en potentiel biomarkør kandidat til diagnosticering af PSA. Aqua peptider blev opløst til 1,0 pmol /pl hjælp 1000 pi 10% (v /v) eddikesyre fra LC-MS bedømmelse (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Stamopløsningen var (100 uL) blev anbragt i 500 pi mikrorør og blev opbevaret i -30 ° C indtil anvendelse.

Tyve pmol (20 pmol) af ISTD peptid (20 pi opløsning) blev tilsat til den blandingsopløsning af urinprøven og lyseringsbuffer og derefter inkuberet i 30 minutter ved 4 ° C med rotation. De følgende procedurer blev udført i overensstemmelse med urinprøven fremstillingsmetode. Kvantitative analyser blev udført ved anvendelse af MALDI-dit-TOF /MS. I kvantitativ analyser ved hjælp af MALDI-DIT-TOF /MS blev målebetingelser fastsættes som følger: 1) en rustfri mål stålplade blev brugt, 2) laser bestråling holdninger manuelt fokuseret til prøven-matrix-blanding af hver brønd, 3) antallet af bestråling punkter var 200, 4) antallet af bestråling skud var 16, og 5) lasereffekt blev fastsat til 85 arbitrære enheder. I alt 3200 spektre blev målt per brønd. Analyser blev udført in duplo, og en udtrukket alikvot blev anbragt i 2 brønde. Derfor blev informationer på en urinprøve bestående af 12800 spektre. Denne metode blev omtalt og ændret fra de metoder rapporteret af Sogawa K., et al. [26] og Tyan YC., Et al. [27]. Koncentrationerne af biomarkør kandidat blev beregnet på grundlag af forholdet mellem peak-området på

m /z

2332 mod, at der på

m /z

2349.

Statistik

Alle statistiske analyser i den foreliggende undersøgelse blev udført ved hjælp af JMP 10.0.2 statistisk software (SAS Institute Japan Inc., Tokyo, Japan). Mann-Whitney-Wilcoxon, også kaldet Mann-Whitney U, test blev anvendt til at identificere en ikke-parametrisk signifikant forskel mellem to grupper. Forskelle med

s

værdier på mindre end 0,05 blev anset for at være betydelig. Receiver opererer karakteristiske (ROC) kurver anslået af den statistiske software blev brugt til at vurdere nøjagtigheden af ​​diagnostiske tests, der gav kontinuerlig testresultater. Desuden blev ROC kurver udnyttes til at vurdere den prædiktive effekt af patognomonisk biomarkør identificeret i nærværende undersøgelse [28].

Resultater

Alder og serum PSA niveauer er ikke signifikant forskellig mellem ikke-kræft fag og PCA patienter bruges som en opdagelse sat

for at vurdere masse spektrum forskelle mellem urinprøver fra 12 ikke-kræft fag og 15 PCA patienter, de følgende analyser blev udført som en opdagelse sæt. Som vist i figur 1a og b, blev der ikke observeret signifikante forskelle i alder eller serum PSA udlodninger mellem ikke-kræft og PCA-grupper. Disse resultater indikerede, at aldersmatchede urinprøver kunne anvendes i efterfølgende analyser.

Alder (a) og serum PSA (b) fordelinger mellem ikke-cancerpatienter og prostatacancer (PSA) patienter blev vist. Ingen signifikante forskelle blev observeret i alder eller serum PSA mellem ikke-kræft forsøgspersoner (n = 12) og PCA-patienter (n = 15). Deres

p

værdier var 0,255 og 0,464 henholdsvis.

Massespektre hjælp MALDI-DIT-TOF /MS-analyser

Høj opløsning og høj følsomhed MALDI -DIT-TOF /MS

n blev anvendt til at analysere urin peptider og proteinfragmenter i den foreliggende undersøgelse. Den typiske massespektre af urin peptider og proteinfragmenter analyseret ved anvendelse af ion-trap reflectron tilstand af MALDI-DIT-TOF /MS er vist i figur 2. Efter koncentration og afsaltning af urinprøver fra CM-Sepharose, blev eluenten ekstraheret med 1,0% TFA-opløsning. DHB blev anvendt som MALDI-matrix. Massespektrene af ekstraherede prøver fra a) ikke-cancerpatienter og b) PCA patienter blev sammenlignet. Adskillige forskelle blev påvist i disse massespektre mellem de to grupper. Den mest udtalte top blev opdaget ved

m /z

2332,3.

Efter at koncentrere og afsaltning urinprøver fra CM-Sepharose blev eluenten ekstraheret med 1,0% TFA løsning. DHB blev anvendt som MALDI-matrix. Figur 2a og 2b viser analyseresultaterne af urin uddrag fra ikke-cancer fag og PCA patienter.

Multivariate analyser af massen spektre af urin ekstrakter hjælp SIMCA software

eksporterede peak-matrix filer ved MATLAB blev importeret til en multivariat analyse software, dvs SIMCA 13.0.3. Alle importerede data blev Pareto skaleret for multivariate analyser. En principal komponenter analyse (PCA) blev oprindeligt gennemført på spektre af urinprøver for at afgøre, om der forelå masse spektrum forskelle mellem ikke-kræft og PCA-grupper. En ortogonal partiel mindste kvadraters diskriminant analyse (OPLS-DA) blev derefter anvendt til at maksimere kovarians mellem de målte data (toppositioner og topintensiteter) og klassifikation af sygdomme. En S-plot blev brugt til at vælge og angive de potentielle biomarkør kandidater af betydelige biomaterialer relateret til gruppen adskillelse.

PCA score parceller i PC1 (R

2 = 0,217) og PC2 (R

2 = 0,148) viste uklare klynger mellem ikke-kræft og PCA-grupper (R

2X [cum]: 0,556 og Q

2 [cum]: 0,271, figur 3a). I modsætning hertil OPLS-DA score plots skelnes PCA-gruppen fra den ikke-cancer-gruppe (R

2X [cum]: 0,309, R

2Y [cum]: 0,722 og Q

2 [cum] : 0,058, figur 3b). Den OPLS-DA var et passende model til at skelne PCA-gruppen fra den ikke-cancer gruppe. En S-plot analyse baseret på den OPLS-DA model i forhold til andelen af ​​topintensiteterne af massespektre om PCa og ikke-cancer er vist i figur 3c. Topintensiteterne omkring

m /z

2332,3 blev isoleret fra S-plottet som nye potentielle patognomonisk biomarkører til at skelne mellem ikke-kræft og PCA-grupper.

(a) PCA score plot angiver forskelsbehandlingen mellem ikke-kræft og PCa i opdagelsen sæt. (B) OPLS-DA score plot viser en klar forskelsbehandling mellem ikke-cancer og PSA. (C) S-plot svarende til OPLS-DA score plot vist i figur 3b. En potentiel urin biomarkør kandidat blev ekstraheret på et højdepunkt omkring

m /z

2332,3 til diagnosticering af PCA patienter.

Identifikation af peptidfragmenter ved m /z 2332,3

massespektret af en urinprøve fra et PCA patient ved MALDI-DIT-TOF /MS

2 analyse er vist i figur 4a. Den Mascot MS

2 søgemaskine i MS

2 massespektrum indikerede, at

m /z

2332 peptid var en C-terminalt fragment af PSA. Dette resultat antydede, at PSA-fragmentet blev sammensat af følgende 19 aminosyrerester: YTKVVHYRKWIKDTIVANP. Den MALDI-DIT-TOF /MS

2 massespektrum af den syntetiserede peptid (Medical Biologisk Laboratories Co., Ltd, Nagoya, Japan) faldt sammen med den urin

m /z

2332 peptid (figur 4b), som bekræftede, at begge peptider bestod af det samme aminosyresekvens: YTKVVHYRKWIKDTIVANP. Desuden dens aminosyresekvens, der blev bestemt ved Edman-nedbrydning, bekræftede, at det var et C-terminalt fragment af PSA, der bestod af 19 aminosyrerester (data ikke vist). I nærværende undersøgelse har vi fokuseret på urinprøver bortfalder efter prostata massage, dvs. digital rektal undersøgelse (DRE). Oprindelsen af ​​peptidet ved

m /z

2332 blev undersøgt, og massespektre blev sammenlignet med de ekstraherede fraktioner fra urin prøverne før og efter DRE (figur 5). Toppen på

m /z

2332 blev udelukkende opdaget efter DRE. Disse resultater understøtter 2331 Da peptidfragmenter blive udskilt fra prostatakirtler af DRE.

(a) Aminosyresekvensen af ​​

m /z

2332 blev identificeret i urinprøver fra PCA patienter og anslåede bruge MS

2 analyser og Mascot MS

2 søgemaskine. Den N-terminale aminosyresekvenser af peptidet blev bekræftet fuldstændigt baseret på data opnået ved Edman nedbrydning af det oprensede peptid. Sekvensen blev bekræftet som følger: YTKVVHYRKWIKDTIVANP. (B) MS

2 spectrum sammenligninger af

m /z

2332-peptid mellem et syntetiseret materiale (1) og ekstraheret biomateriale fra urinprøver fra PCA patienter (2). Den resulterende 2 MS

2 spektre af

m /z

2332 peptider matchede helt.

Kvantitative analyser af en ny potentiel patognomonisk biomarkør hjælp MALDI-DIT- TOF /MS

som tidligere vist, peak intensitet på

m /z

2332,3 blev isoleret fra S-plottet som en potentiel biomarkør kandidat til at skelne mellem ikke-kræft og PCA-grupper . Således blev urinvejene 2331 Da peptid vurderet kvantitativt ved hjælp 50 urinprøver annulleret fra PCA patienter (Tabel 1) og 19 fra ikke-cancerpatienter (Tabel 2) efter prostata massage. En del af hvert datasæt havde også været brugt i opdagelsen trin.

alder og PSA fordelinger af alle fag er vist i figur 6a og b. Der blev ikke observeret nogen signifikante forskelle i alder eller PSA fordelingen mellem den ikke-cancer (n = 19) og PCA (n = 50) grupper.

Alder (a) og serum PSA (b) udlodninger mellem ikke-kræft fag og PCA patienter i validerings- sæt. Ingen signifikante forskelle blev observeret i alder eller serum PSA mellem ikke-kræft forsøgspersoner (n = 19) og PCA-patienter (n = 50). Deres

p

værdier var 0,364 og 0,076 henholdsvis.

En repræsentativ urinprøve analyseret med tilføjelse af den interne standard (ISTD) blev anvendt til at estimere forholdet mellem toparealerne ved

m /z

2332 for et ikke-mærket syntetisk peptid og ved

m /z

2348 for en stabil isotop-mærket syntetisk peptid (YTKVVHY [R-

13C

6, –

15N

4] KWIKDT [I-

13C

6, –

15N] VANP), hhv. Tilføjelsen indhold ISTD (stabil isotop-mærket 2348 Da peptid beløb) blev fastsat i 20 pmol /1,0 ml urin. En standardkurve for yderligere mængder af den 2331 Da peptidet er vist i figur 7a. Der blev observeret en stærk korrelation mellem toparealforholdet mellem

m /z

2332 og 2349 og yderligere 2331 Da peptid mængder, med en regressionsligning y = 0.0243x + 0,0722 (x-aksen: yderligere mængder af den 2331 Da peptid, forholdet topareal af

m /z

2332 /

m /z

2349 [ISTD]; y-aksen R

2 = 0,996). En lineær standardkurve blev opnået

(a) Forholdet mellem forholdet peak området mellem

m /z

2332 og 2349 (stabil isotop-mærket syntetisk peptid, intern standard [ISTD])., og yderligere 2331 Da (ikke-mærket syntetisk) peptid beløb. De yderligere indhold ISTD blev fikseret i 20 pmol /1,0 ml urin. En standardkurve om de yderligere mængder af 2331 Da peptidet vist. Passende korrelationer blev observeret i kvantitative analyser af de 2331 Da peptid hjælp MALDI-DIT-TOF /MS. (B) En sammenligning mellem patologiske kategorier og urinveje 2331 Da peptid koncentrationer. Der sås en signifikant forskel (

p = 0,0016

) mellem ikke-cancer (n = 19) og PCa (n = 50) grupper. (C) De ROC kurver blev beregnet ud fra de kvantitative resultater af de to (dvs. ikke-cancer og PCA) grupper. AUC af serum PSA-niveau og urin 2331 Da peptidkoncentration var 0,639 og 0,747 henholdsvis. Med hensyn til serum PSA, cut-off niveau på 3,82 ng /mL havde en følsomhed på 100% og specificitet på 36,9%. Med hensyn til urin 2331 Da peptid, cut-off niveau på 40,6 ng /mL havde en følsomhed på 86,0% og specificitet på 57,9%.

En signifikant forskel blev observeret i urin 2331 Da peptid-koncentrationer mellem ikke-cancer og PCA grupper (figur 7B). Medianerne af Da koncentrationen 2331 peptidet i den ikke-cancer og PCA grupper var 36,8 og 117 ng /ml. Dette resultat viste, at det kunne være muligt at skelne PCA patienter fra ikke-cancer fag.

ROC kurver beregnes ud fra disse resultater af to grupper er vist i figur 7c. Med hensyn til serum PSA, et område under kurven (AUC) var 0,639. Cut-off niveau på 3,82 ng /mL havde en følsomhed på 100% og specificitet på 36,9%. På den anden side, en AUC var 0,747 vedrørende urin 2331 Da peptid. Cut-off niveau på 40,6 ng /mL havde en følsomhed på 86,0% og specificitet på 57,9%.

Ingen korrelationer blev observeret mellem de 2331 Da peptid-koncentration og serum PSA-niveauer eller PCA stadier eller Gleason score på patienter (data ikke vist)

diskussion

diagnosen kræft udgør en stor udfordring for forskning og klinisk ledelse.; omfattende genomisk, transkriptom, og proteomiske undersøgelser er ved at blive gennemført med henblik på at opdage og identificere biomarkør kandidater til brug i high-throughput systemer, der kan store befolkning screening [29].