PLoS ONE: CXCL16 og CXCR6 co-udtrykkes i Human Lung Cancer in vivo og mægle invasionen af ​​lungekræft cellelinier in vitro

Abstrakt

På trods af fremskridt i tidlig diagnose og multimodalitet terapi for kræft, de fleste af lungekræft patienter er blevet lokalt fremskreden eller metastatisk på tidspunktet for diagnosen, hvilket tyder på den meget progressive karakteristisk for lungekræft celler. Mekanismerne slave invasionsevne og metastase af lungecancer er endnu ikke belyst. I den foreliggende undersøgelse blev immunhistokemi udført for at detektere ekspressionen af ​​CXCL16-CXCR6 i humane lungecancer væv. Det blev påvist, at ligner CXCL12 og CXCR4, CXCL16 og CXCR6 også blev co-udtrykt i humane primære lungekræft væv. Efter bekræftelse af funktionelle eksistens CXCL16 og CXCR6 protein i A549, 95D og H292 celler ved ELSA og flowcytometri analyse, vi nærmere betydningen af ​​CXCL16-CXCR6 aksen i de biologiske funktioner af lungekræft cellelinier

in vitro

. Det blev konstateret, at CXCL16 havde nogen effekt på PCNA (prolifererende celle nuklear antigen) udtryk for A549, 95D og H292 celler. Men både eksogene CXCL16 og CM (konditioneret medium fra A549, 95D eller H292) signifikant forbedret

in vitro

levedygtighed og invasion af tre lunge cancer cellelinjer. Det neutraliserende antistof mod CXCL16 eller nedregulering af CXCR6 var i stand til at hæmme den øgede levedygtighed og invasiv af A549, 95D og H292 celler stimuleret af CXCL16 eller CM. Vores resultater indebærer, at CXCL16-CXCR6 aksen er involveret i reguleringen af ​​levedygtighed og invasion i stedet PCNA udtryk for lunge Caner celler, der åbner døren for en bedre forståelse af mekanismerne i lunge tumor progression og metastase

Henvisning.: Hu W, Liu Y, Zhou W, Si L, Ren L (2014) CXCL16 og CXCR6 co-udtrykkes i human Lung Cancer

In Vivo

mægle invasion af lungekræft cellelinier

In vitro

. PLoS ONE 9 (6): e99056. doi: 10,1371 /journal.pone.0099056

Redaktør: Vladimir V. Kalinichenko, Cincinnati Children ‘s Hospital Medical Center, USA

Modtaget: September 19, 2013; Accepteret: 11 maj 2014; Udgivet: 4 Jun 2014

Copyright: © 2014 Hu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde er støttet af National Natural Science Foundation of China 81270753 (til W.-HZ), Wuhan Videnskab og Teknologi Projekt 2013060602010249 (til W.-DH), Natural Science Foundation for Videnskab og Teknologi Ministeriet for Hubei-provinsen 2010CDB05502 (til W.-DH ) og uddannelse af personale plan for Health Care System af Beijing 2013-3-021 (til W.-HZ). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

lungekræft er en almindelig ondartet svulst, der rangerer som den førende årsag til malignitet dødsfald på verdensplan, og forekomsten af ​​lungekræft har været stigende i de seneste år i nogle store byer i Kina [1]. Trods fremskridt i tidlig diagnose og multimodalitet terapi for kræft, den femårige samlede overlevelsesrate for mest avancerede lungekræftpatienter er stadig mindre end 20%. Mekanismerne slave invasiv og metastase af lungekræft har tiltrukket en masse opmærksomhed fra thorax onkologer i årtier af år. Nogle hypoteser og molekyler er blevet fremsat, men en grundig forståelse af de indviklede invasive og metastatiske processer carcinomceller er stadig et åbent spørgsmål.

Siden opdagelsen af ​​den første kemokin i 1987, mere end 50 slags chemokiner og 20 typer af kemokinreceptorer er blevet klonet og identificeret. Aktivering af chemokin /receptor-signalvej er blevet bekræftet at mediere en række fysiologiske og patologiske begivenheder, især rekruttering af lymfocyt samt tumorvækst og metastatisk spredning, som giver mulighed for belysning af metastatiske proces af maligne celler fra immunologi perspektiver [2], [3], [4], [5], [6].

Blandt forskellige kemokiner og kemokinreceptorer, CXCL16-CXCR6 er en unik chemokin /kemokinreceptor par. CXCL16, også kendt som SR-PSOX, tilhører CXC kemokin familie og eksisterer både i en transmembrane og opløselig form [7], [8], [9]. Samspil mellem CXCL16 og dens »eneste receptor, CXCR6 (også kaldet Bonzo, STRL33 og TYMSTR) er involveret i flere biologiske aktiviteter, herunder selektiv handel med lymfocytundergrupper, celleadhæsion, celle overlevelse, muskel regenerering, hjernens udvikling, kronisk inflammation og anti tumor immunitet [9], [10], [11], [12], [13], [14]. Især har de seneste undersøgelser bekræftet overekspression af CXCL16 og /eller CXCR6 i flere typer af humane kræftformer og CXCL16 kunne stimulere væksten, migration, invasion og aktivering af AKT signalvejen af ​​kræftceller via sin ‘receptor CXCR6

in vitro

[15], [16], [17], [18]. Vores tidligere undersøgelse bekræftede også den overdrevne udtryk for CXCR6 protein i humane native prostatacancerceller og aktiveringen af ​​CXCL16-CXCR6 vej kunne fremme migration og invasion af PC3 og LNCaP celler

in vitro

[19]. Disse resultater antyder, CXCL16-CXCR6 kan være en hidtil ukendt kemokinligand /receptor-par impliceret i tumorgenese og metastase. Nogle grupper er begyndt at være opmærksom på den rolle, CXCL16-CXCR6 i tumor, men forholdet mellem CXCL16-CXCR6 og lungekræft er stadig undvigende og fortjener yderligere undersøgelser.

I den foreliggende undersøgelse, udtryk for CXCL16 og CXCR6 i menneskelig lungekræft væv og lungekræft cellelinjer, A549, H292 og 95D, blev bestemt ved immunhistokemi og immuncytokemi hhv. Så enzymmaerket assay (ELISA) og flowcytometri blev udført for at undersøge den funktionelle udtryk for CXCL16 og CXCR6 i tre cancer cellelinjer. For yderligere at belyse den rolle, CXCL16-CXCR6 aksen i lungekræft, vi også observeret virkningen af ​​CXCL16 på PCNA (prolifererende celle nuklear antigen) udtryk og invasive evne A549, H292 og 95D celler. Virkningerne af CXCR6 genet nedregulering af små interfererende RNA (siRNA) teknologi på levedygtighed og invasivitet af A549-celler blev også bestemt ved MTT og invasion assay. Gennem udforske ændring af biologisk adfærd lungekræft celler medieret af CXCL16-CXCR6 aksen, vi håber at kunne give indsigt i bedre forståelse af progression af denne aggressive ondartet svulst.

Materialer og metoder

Menneskelig tissue Collection

Alle procedurer, der involverer deltagere i undersøgelsen blev godkendt af Zhongnan Hospital i Wuhan University menneskelige forskningspotentiale etiske komité, og deltagerne havde givet deres skriftlige informerede samtykke.

Menneskelig lungekræft (33 tilfælde) og normale (5 sager) væv blev opnået fra patienter, som gennemgik pulmonal lap resektion eller pneumonectomy for kræft eller ikke-kræft lungesygdomme på Zhongnan Hospital i Wuhan University fra 2003 til 2006. identifikationen af ​​tumortyper blev udført af to professionelle patologer . Af 33 lungekræft, 13 tilfælde var adenokarcinomer (AC), 12 tilfælde var planocellulære karcinomer (SC), 7 tilfælde var adenosquamøst karcinomer (ASC) og 1 tilfælde var bronchoalveolær carcinom (BC). Etaperne i tumorer blev anslået i henhold til syvende udgave af det nye TNM foreslået af den internationale sammenslutning for studiet af lungekræft (IASLC) i 2009. I de 33 prøver, 3, 1, 9, 8, 10 og 2 tilfælde var IA, IB, IIA, IIB, IIIA og IIIB, henholdsvis.

Cell Culture

Lungekræft cellelinjer A549, H292 og 95D celler blev opnået fra Cell Bank of Chinese Academy of Science (Shanghai, Kina). Cellerne blev dyrket i 1640 indeholdende 10% varmeinaktiveret FBS (Gibco, Grand Island, NY, USA), 10 mM HEPES, 1 mM pyrodruesyre natrium, 4,5 g /l glucose, 100 UI /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Cellerne blev udvundet og passeret tre gange og fik derefter lov at vokse til konfluens for de følgende eksperimenter.

Immunhistokemi

Fremgangsmåden til immunohistokemi blev baseret på vores tidligere procedure [19]. Kort fortalt blev vævene rutinemæssigt fikseret med formalin og indlejret i paraffin. Antigen-genvinding blev udført og 0,3% H

2O

2 i phosphatpufferopløsning (PBS) blev anvendt til at blokere endogen peroxidaseaktivitet i afsnittene. Efter behandlet med protein blokerende serum for at blokere ikke-specifik binding blev sektionerne inkuberet natten over ved 4 ° C med muse-anti-human CXCR4 (25 ug /ml), muse-anti-humant CXCR6 (25 ug /ml), muse anti- human CXCL12 (20 ug /ml) og gede-anti-human CXCL16 (20 ug /ml) antistoffer (fra R 5% (score = 0), 5-25% (score = 1), 26-50% (score = 2), 51-75% (score = 3) eller 75% (score = 4). Kombinere immunfarvning intensitet score og procentdelen af ​​positive celler, vi klassificeret scoring som følger: 2, negativ udtryk; 2-3, svag udtryk; 4-5, moderat udtryk og 6-7 så stærkt udtryk [19].

Immuncytokemi

Efter 70-80% sammenløbet af celler, A549, H292 eller 95D celler blev fordøjet med 0,25 % trypsin (Bio Basic Inco., BBI, Ontario, Canada) indeholdende 0,1% EDTA og podet med en tæthed på 2 × 10

5cells /brønd i plader med 6 brønde Forudplacerede med dækglas. Efter dyrket i 48 timer blev lungekræft cellelinier fikseret i 4% formalin i 20 minutter ved stuetemperatur, vasket i PBS og permeabiliseret i 15 minutter i 0,03% Triton X-100-PBS, derefter behandlet med 0,3% H

2O

2 for at inaktivere endogen peroxidaseaktivitet. Den følgende procedure var som beskrevet ovenfor ved fremgangsmåden ifølge immunhistokemi og humane primære dyrkede trophoblastceller blev også anvendt som positiv kontrol [13], [19]. Resultaterne blev analyseret af Image-ProPlus 6.0 software og den gennemsnitlige udtryk tætheden af ​​CXCL16 og CXCR6 i tre cellelinier blev indspillet. Forsøgene blev gentaget tre gange.

Fremstilling af Cell Cultured konditioneret medium

Det isolerede A549, 95D og H292 blev podet i kultur flasker (6 ml /flaske) ved en densitet på 1 x 10

6 /ml, og dyrket kontinuerligt i 48 timer. Supernatanterne, nemlig konditioneret medium (CM), blev opsamlet og centrifugeret ved 2000 g og derefter opbevaret ved -80 ° C. Supernatanterne fra dyrkningsmedium uden celler blev også opsamlet som kontrol. Salg

enzymkoblet immunsorbentassay (ELISA) Salg

Fordøjede A549, H292 og 95D-celler blev podet i plader med 24 brønde (500 pi /brønd) med en densitet på 5 x 10

5 /ml. Supernatanter af cellekulturerne blev opsamlet ved 24, 36, 48, 60, 72, 96 og 100 timer i kultur. Hver opsamlet supernatant blev opbevaret ved -80 ° C til ELISA-analyse. Mængden af ​​CXCL16 i hver supernatant blev målt ved human CXCL16 ELISA-kit (Shanghai Westang Bio-Tech Co. Ltd, Shanghai, Kina), i henhold til producentens anvisninger. Den CXCL16 assay kit demonstrerede en følsomhed på 40 pg /ml og en intra-assay variationskoefficient på under 12%. Forsøgene blev gentaget tre gange.

Flowcytometri Detection for CXCR6 Expression

Membranen ekspression af CXCR6 protein på A549, blev H292 og 95D-celler påvist ved flowcytometri ifølge vores tidligere fremgangsmåde og CXCR4 blev også anvendt som kontrol på samme tid [20]. Kort fortalt, for at beskytte membranen lokalisering af kemokinreceptoren i videst muligt omfang, de celler, ved 70-80% celle konfluens blev spaltet med 0,25% trypsin kun for 30-50 s, så blæst ud forsigtigt og vasket med PBS [ ,,,0],20]. Efter blokering med 10% FBS, blev de udvundne celler inkuberet med muse-anti-humant PE (phycoerythrin) -CXCR6 monoklonalt antistof (1:10; R eBioscience) eller muse PE-IgG

2a isotype (eBioscience) i 1 time ved stuetemperatur i mørke [21]. Følgende gennemgang Fremgangsmåden var som beskrevet ovenfor i fremgangsmåden til flowcytometri detektion for CXCR6 ekspression. Forsøgene blev gentaget tre gange.

CXCR6 stilhed til A549-celler

De isolerede A549-celler blev podet på plader med 6 brønde med en tæthed på 2 x 10

5 /ml. Ved 70-80% konfluens, blev disse celler transficeret med phU6 /GFP /Neo plasmid indeholdende korte hårnål RNA (shRNA) molekyler er målrettet mod CXCR6, med brugen af ​​Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Sekvenserne for tre shRNA oligonukleotider var: (CXCR6-2819-1): 5′-ctGAG GAC AAT TCC AAG ACT T-3 ‘(sense) og 5′-AAG TCT TGG AAT TGT CCT CAG-3′ (anti-sense ); (CXCR6-2820-2) 5’-ctCAC CAT GAT TGT CTG CTA T-3 ‘(sense) og 5′-ATA GCA GAC AAT CAT GGT GAG-3′ (anti-sense); (CXCR6-2821-1) 5’-gcTTG CTC ATC TGG GTG ATA T-3 ‘(sense) og 5′-ATA TCA CCC AGA TGA GCA AGC-3’ (Anti-sense) (GENECHEM, Shanghai, Kina). Grupperne blev inddelt i phU6 /GFP /Neo-CXCR6 (CXCR6-shRNA), ikke-målrettet siRNA oligonukleotider negativ kontrol (phU6 /GFP /Neo, shRNA-kontrol) og blank-kontrol (ingen nogen behandling). Stabile transfektanter blev selekteret ved G418 kultur ved en koncentration på 800 ug /ml. Forsøgene blev gentaget tre gange, og den lyddæmpende effektivitet blev bestemt ved Western blot.

Cell Levedygtighed Assay

MTT [3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2, 5-diphenyltetrazoliumbromid blev Sigma Chemicals] assay anvendes til at vurdere virkningerne af CXCL16-CXCR6 på cellelevedygtighed

in vitro

[21]. Forsøgene blev inddelt i to trin: for det første, de isolerede A549 celler fra blank-kontrol, shRNA-kontrol og CXCR6-shRNA (2819-1) grupper blev podet i 96 brønde fladbundede mikroplader med en tæthed på 2 × 10

3 celler /brønd og dyrket i 24, 48, 72, 96 og 120 h, henholdsvis. For det andet, efter udsultet med 1640 uden FCS i 12 timer, cellerne fra blank-kontrol, shRNA-kontrol eller CXCR6-shRNA (2819-1) grupper blev behandlet med kontrolmedium (1640) eller CXCL16 ved en koncentration på 100 ng /ml i 48 timer.

MTT-reagens (20 pi) blev tilsat til hver brønd i mikroplader med 96 brønde og inkuberet ved 37 ° C i 4 timer. Mediet blev dekanteret og 100 pi DMSO blev tilsat for at opløseliggøre de reaktive krystaller. Absorptionsevne blev målt ved en bølgelængde på 570 nm på en automatisk mikropladelæser. Prøverne blev kørt i tre eksemplarer og forsøgene blev gentaget tre gange [21].

ECM Invasion Assay

invasive evne lungekræft cellelinier blev evalueret objektivt af

in vitro

invasion assay baseret på vores tidligere metode [19], [20]. Kort fortalt, de cellekultur skær (8 um porestørrelse, 6,5 mm diameter; Corning, Corning, NY, USA) blev overtrukket med 10 ul rent ekstracellulære matrix (ECM) gel (Sigma, St. Louis, MO 63103, American) placeret i en 24-brønds plade. Forsøgene blev opdelt i følgende to dele: For det første, den isolerede A549, H292 eller 95D-celler (1 x 10

5/200 pi serumfrit 1640) blev udpladet i det øverste kammer, og behandlet med CM, CXCL16 ( 100 ng /ml) og en kombination af CM eller CXCL16 med CXCL16 neutralisering antistof (100 ng /ml). For det andet blev A549 celler, fra det tomme-kontrol, phU6 /GFP /Neo og phU6 /GFP /Neo-CXCR6 gruppe, podet på det øvre kammer med en tæthed på (1 × 10

5/200 pi serum- fri 1640), derefter behandlet med CXCL16 (100 ng /ml) eller CM. De nedre kamre blev fyldt med 800 pi 1640 medium leveres med 10% FBS. Efter inkuberet ved 37 ° C i 24 timer blev inserterne fjernet og vasket i PBS. Derefter noninvading celler sammen med ECM gel blev fjernet fra den øvre overflade af filteret ved aftørring med en vatpind. Indsatsene blev fikseret i 4% formalin i 10 minutter ved stuetemperatur, og farvet med hematoxylin. Resultatet blev observeret under et lysmikroskop (Olympus, Tokyo, Japan), og cellerne migreret til den nedre overflade blev talt. For at eliminere den individuelle variabilitet blev resultaterne vurderet af to uafhængige forskere og invasive indeks blev beregnet som andelen af ​​de migrerede celler i forsøgsgruppen med den for sin egen kontrol. Hvert forsøg blev udført i tre eksemplarer, og gentages tre gange.

Statistik

Forsøgene

in vitro

blev vist i gennemsnit ± SE. Dataene i PCNA udtryk,

in vitro

levedygtighed og invasion assay blev vurderet med post hoc Dunnetts

t

test og Dunnett T3 test, når det er relevant. Forskellene blev accepteret som signifikant på

P

. 0,05

Resultater

Protein Expression af CXCL16-CXCR6 i Human Lung Cancer

in vivo

Immunhistokemi blev udført for at bestemme protein ekspression af CXCL16 og CXCR6 i human lunge caner (33 prøver) og normalt væv (5 prøver). Resultaterne i fig. 1 klart vist coekspression af CXCR6 og CXCL16 protein i humane lunge cancer væv. Specifik brunfarvet farvning for CXCR6 og CXCL16 i cytoplasmaet og membranen klart kunne observeres i de primære lungekræft celler, men den positive udtryk sats og farvning intensitet CXCR6 var stærkere end CXCL16. Selv moderat til stærk, brunfarvet farvning for CXCL16 og CXCR6 blev også observeret i normale lungevæv, men den positive ekspression blev hovedsageligt begrænset til de alveolære epitelceller og inflammatoriske celler. Der var ingen tegn på ikke-specifik farvning med kontrol antistof.

Immunhistokemi blev udført for at bestemme protein ekspression af CXCL16-CXCR6 og CXCL12-CXCR4 i humane primære lungecancer væv. Antistofferne anvendt i denne forsøgene var muse-anti-human CXCR4 (25 ug /ml), muse-anti-humant CXCR6 (25 ug /ml), muse-anti-human CXCL12 (20 ug /ml) og gede-anti-human CXCL16 (20 ug /ml) antistoffer. Det blev demonstreret i fig. 1, at en bestemt brun-farvet farvning for CXCL16-CXCR6 og CXCL12-CXCR4 i cytoplasmaet og membranen af ​​humane forskellige patologiske typer lungekræft celler. Moderat til stærk, blev brun-farvet farvning for CXCL16 og CXCR6 også observeret i normale lungevæv, men den positive ekspression blev hovedsageligt begrænset til de alveolære epitelceller og inflammatoriske celler. Der var ingen tegn på ikke-specifik farvning med kontrol antistof. Billederne var repræsentant for forsøgene. AC: adenokarcinomer; SC: pladecarcinomer; BC: bronchoalveolær karcinom; Con: normale lungevæv; Villi: humane første trimester villøse væv, som en positiv kontrol. Forstørrelse, × 200.

Desuden har vi også analyseret sammenslutningen af ​​CXCL16-CXCR6 udtryk mønster med forskellige patologiske typer af lungekræft. Det blev demonstreret i fig. 2, at af de detekterede 33 lungekræft prøver, for CXCR6 proteinekspression, kun 3 SC tilfælde var svagt positive og de andre var alle moderat til stærk positiv, mens det for CXCL16, farvningsintensiteten var negativ (10), svag (8), moderat (8) og stærk (7). Af de 10 CXCL16-negative prøver, 7 tilfælde tilhører AC, 2 tilfælde hører til SC og 1 tilfælde var ASC. Af de 7 CXCL16-stærk prøver, 5 tilfælde var SC og 2 tilfælde var ASC. Resten af ​​16 svage til moderate prøver var AC (6), SC (5) ASC (4) og BC (1), (fig. 2).

Ifølge immunfarvning intensitet score og procentdelen af positive celler, blev resultaterne af immunkemi analyse klassificeres som følger: 2, negativ udtryk; 2-3, svag udtryk; 4-5, moderat ekspression, og 6-7 så stærk ekspression. AC: adenokarcinomer; SC: pladecarcinomer; ASC: adenosquamøst carcinomer; BC:. Bronchoalveolær karcinom

I den foreliggende undersøgelse har vi også brugt CXCL12-CXCR4 som positiv kontrol og sammenlignet ekspressionsmønsteret mellem CXCL16-CXCR6 og CXCL12-CXCR4. Som vist i fig. 1,2 og tabel 1 hovedparten af ​​prøverne udtrykt CXCR4 (30/33) og CXCL12 (28/33) protein, trods af en let forskel i udtrykket intensitet. Desuden i 33 prøver påvist, var der 30 sager, der co-udtrykte CXCR6 og CXCR4 protein og 19 sager, der co-udtrykte CXCL16 og CXCL12 protein.

Protein Expression af CXCL16-CXCR6 i Human Lung cancercellelinier

efter bekræftelse af coekspression af CXCL16-CXCR6 protein i humane native lunge kræftceller, vi yderligere analyseret udtryk for CXCL16-CXCR6 i human lungecancer cellelinier A549, H292 og 95D ved immunocytokemi. Som vist i fig. 3, positiv brunfarvet farvning for både CXCL16 og CXCR6 klart kunne observeres i cytoplasmaet og cytomembrane af A549, H292 og 95D celler. Selv om der var forskelle i ekspression intensitet i A549, 95D og H292 celler, farvningen for liganden var alle forholdsvis svagere end det er receptor i tre typer celler. Endvidere ekspressionsmønsteret for CXCL16-CXCR6 var ligner den i CXCL12-CXCR4, den specifikke farvning for både CXCR4 og CXCL12 også kunne observeres i tre lung cancercellelinier trods af forskellen af ​​ekspression intensitet i forskellige celler.

Immuncytokemi blev udført for at påvise protein ekspression af CXCL16-CXCR6 og CXCL12-CXCR4 i humane lunge cancercellelinier. Antistofferne anvendt i denne forsøgene var muse-anti-human CXCR4 (25 ug /ml), muse-anti-humant CXCR6 (25 ug /ml), muse-anti-human CXCL12 (20 ug /ml) og gede-anti-human CXCL16 (20 ug /ml) antistoffer. Positive brun-farvet farvning for både CXCL16 og CXCR6 blev klart observeret i cytoplasmaet og cytomembrane af A549, H292 og 95D celler. Desuden CXCL12 og CXCR4 blev også co-udtrykt i de tre lunge cancer cellelinjer. Ingen baggrund farvning blev observeret i isotypekontrol. A: Billederne var repræsentative for forsøgene; B: Den relative udtryk intensiteten af ​​CXCL16-CXCR6 og CXCL12-CXCR4 i A549, H292 og 95D celler. Tro: humane primære dyrkede trophoblastceller som en positiv kontrol. Forstørrelse, × 200.

Derefter blev en ELISA assay udført for at undersøge frigivelsen af ​​den opløselige CXCL16 i dyrkede A549, H292 og 95D celler

in vitro

. Som vist i fig. 4, tre typer lungekræft cellelinier alle udskilte CXCL16 spontant næsten ved en konstant hastighed, men der var en lille forskel i koncentrationen af ​​CXCL16 i dyrkningsmediet. Mængden af ​​CXCL16 produceret af H292 celler var den højeste blandt de tre celletyper. Koncentrationen af ​​CXCL16 i 24 timer dyrket medium af H292 allerede nået til 1391,9 ± 13,43 ng /ml, og den akkumulerede koncentration af CXCL16 var 2633,2 ± 9,84 og 2566,9 ± 3,1 ng /ml efter dyrkning i 96 og 120 t. Selv om produktionen af ​​CXCL16 af A549-celler var relativt mindre end for både H292 og 95D celler, produktion af CXCL16 var stadig i en tidsafhængig måde, og mængden af ​​CXCL16 var 977,45 ± 12,85 ng /ml efter dyrkning i 120 timer. For 95D celler, koncentrationen af ​​CXCL16 også korreleret positivt til dyrkningstid og 120 h produktion af CXCL16 var 1165,2 ± 12,00 ng /ml.

Fordøjede A549, H292 og 95D-celler blev podet i plader med 24 brønde (500 pl /brønd) ved en densitet på 5 x 10

5 /ml. Supernatanter af cellekulturerne blev opsamlet ved 24, 36, 48, 60, 72, 96 og 100 timer i kultur. En ELISA-assay blev udført for at undersøge frigivelsen af ​​den opløselige CXCL16 i dyrkede A549, H292 og 95D celler

in vitro

. Som vist i fig. 4, tre typer lungekræft cellelinier alle udskilte CXCL16 spontant i en tidsafhængig måde, Despites af en forskel i koncentrationen af ​​CXCL16 i dyrkningsmediet. Forsøgene blev gentaget tre gange. Fejlsøjler skildrer standardfejlen på middelværdien.

Flowcytometri blev anvendt til at påvise membran ekspression af CXCR6 i A549, H292 og 95D-celler. Selvom andelen af ​​CXCR6 ekspression med H292 celler var mindre end både A549 (52,4 ± 5,79%) og 95D-celler (56.03 ± 11,42%), den gennemsnitlige procentdel var stadig 34.87 ± 6.17 (fig. 5). Endvidere påvises vi også membranen ekspression af CXCR4 i A549, H292 og 95D celler med flowcytometri. Det konstateredes, at procentdelen af ​​CXCR4-positive celler i A549, H292 og 95D var 25.56 ± 6,44, 46,00 ± 6,52 og 28,57 ± 1,43 hhv. Således blev membranen CXCR6 og CXCR4 co-udtrykt i tre lung cancercellelinier trods af en lille forskel i positivt udtryk andel.

flowcytometri (FCM) blev anvendt til at påvise membran ekspression af CXCR6 i lungekræft cellelinier . Cellerne i 1 × 10

5 blev talt og fortyndingsforhold på (phycoerythrin) -CXCR6 monoklonalt antistof og PE-CY5-CXCR4 monoklonalt antistof var 1:10 og 01:05 hhv. Histogrammet demonstrerede den gennemsnitlige ekspression andel af CXCR6 og CXCR4 i A549, H292 og 95D celler. FCM billeder var repræsentative for eksperimenterne. Procentdelen af ​​membran CXCR6-positive celler i A549, H292 og 95D var 52,4 ± 5,80, 56,03 ± 11,42 og 34,8 ± 6,17 hhv. Endvidere blev membranen ekspression af CXCR4 også observeret i A549, H292 og 95D-celler på samme tid. Forsøgene blev gentaget tre gange, og billederne var repræsentative for eksperimenterne. Fejl barer skildrer standardfejlen af ​​middelværdien.

Effekter af CXCL16 på PCNA Angivelse af Lung Cancer Cell Lines

in vitro

Efter at have identificeret den funktionelle eksistens CXCL16 og CXCR6 i A549, 95D og H292, vi yderligere observeret virkningen af ​​CXCL16 stimulation på PCNA-ekspression af disse celler. Som vist i fig. 6, var der ingen væsentlige ændringer i PCNA niveau i forskellige forsøgsgrupper (P 0,05, sammenlignet med kontrolgruppen). Resultaterne var meget konsekvent i tre lunge cancer cellelinjer og CXCL16-CXCR6 aksen viste ingen effekt på PCNA udtryk for A549, 95D eller H292.

Efter udsultet for 12 (100 ng /ml) eller en kombination af CXCL16 med CXCL16 neutraliserende antistof (100 ng /ml) i støvknap 48 timer. Derefter blev virkningerne af CXCL16 stimulation på PCNA (prolifererende celle nuklear antigen) udtryk påvist ved flowcytometri. Som vist i fig. 6, var der ingen væsentlige ændringer i PCNA niveau i forskellige forsøgsgrupper (P 0,05, sammenlignet med kontrolgruppen). Billederne er repræsentative for forsøgene og resultaterne var reproducerbare og konsekvent i tre lung cancercellelinier. Fejl barer skildrer standardfejlen af ​​middelværdien.

CXCR6 blev nedreguleret af siRNA techonology

Effektivitet af RNA-interferens mod CXCR6 blev valideret af western blot. Det blev vist i fig. 7, at CXCR6 protein væsentligt blev udtrykt i A549-celler (bank-kontrol, uden nogen behandling) og RNA-interferens teknologi effektivt hæmmede CXCR6 udtryk i A549 celler. Den silencing effektivitet CXCR6 shRNA- (2819-1) var den bedste, og dermed i alle de efterfølgende eksperimenter, vi brugte dette siRNA til tavshed CXCR6 mRNA-ekspression.

Sådan slukkes CXCR6 genekspression, vi transficeret A549 celler med phU6 /GFP /Neo plasmid indeholdende korte hårnål RNA (shRNA) molekyler målrettet mod CXCR6, med brugen af ​​Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Sekvenserne for tre shRNA oligonukleotider var: (CXCR6-2819-1): 5′-ctGAG GAC AAT TCC AAG ACT T-3 ‘(sense) og 5′-AAG TCT TGG AAT TGT CCT CAG-3′ (anti-sense ); (CXCR6-2820-2) 5’-ctCAC CAT GAT TGT CTG CTA T-3 ‘(sense) og 5′-ATA GCA GAC AAT CAT GGT GAG-3′ (anti-sense); (CXCR6-2821-1) 5’-gcTTG CTC ATC TGG GTG ATA T-3 ‘(sense) og 5′-ATA TCA CCC AGA TGA GCA AGC-3’ (anti-sense). Effektivitet af RNA-interferens mod CXCR6 blev valideret af western blot. Det blev vist i fig. 7, at CXCR6 protein væsentligt blev udtrykt i A549-celler (bank-kontrol, uden nogen behandling) og RNA-interferens teknologi effektivt hæmmede CXCR6 udtryk i A549 celler. Bane 1: Blank-kontrol; Bane 2: RNA-kontrol; Bane 3: CXCR6 shRNA- (2821-1); Bane 4: CXCR6 shRNA- (2820-2); Bane 5:. CXCR6 shRNA- (2819-1)

Virkninger af CXCL16-CXCR6 på A549 Cellelevedygtighed

in vitro

MTT analyseresultater i fig. 8 viste, at der ikke var forskel på den

in vitro

levedygtighed mellem tomme-kontrol og shRNA-kontrol. Men sammenlignet med den tomme-kontrol, levedygtigheden af ​​A549 celler fra CXCR6-shRNA (2819-1) grupper faldt betydeligt med forlængelsen af ​​kulturen tid (sammenlignet med kontrolgruppen, P 0,01 ved 72, 96 og 120 timer) . Desuden humant rekombinant CXCL16 var i stand til at øge

in vitro

levedygtighed A549 celler fra den tomme-kontrol og shRNA-kontrol (sammenlignet med kontrolgruppen, P 0,01), mens havde ingen effekt på levedygtighed A549 celler fra CXCR6 nedreguleret gruppe (sammenlignet med kontrolgruppen, P 0,05).

MTT-analysen blev anvendt til at vurdere virkningerne af CXCL16-CXCR6 på cellernes levedygtighed

in vitro

. Som vist i fig.