PLoS ONE: Post-operative Plasma Osteopontin forudser fjernmetastaser i Human Colorectal Cancer

Abstrakt

Baggrund

Den overordnede prognose for kolorektal cancer (CRC) patienter er utilfredsstillende på grund af kræft metastaser efter operation . Denne undersøgelse har til formål at undersøge den kliniske betydning af plasma osteopontin (OPN) niveauer, som minimalt invasive, forudsigende og surrogat biomarkører for prognose af CRC patienter.

Metoder

Dette randomiserede forsøg design består af præ -operative og postoperative plasmaprøver fra i alt 79 patienter. Vi bestemt plasmaniveauer af OPN ved ELISA og undersøgt deres korrelation med klinisk-patologiske parametre CRC patienter. Virkningerne af endogen og eksogen OPN på CRC metastaser blev undersøgt ved undersøgelse af virkningen på regulatorer af epitel at messenchymal overgang og migration assay.

Resultater

Vores resultater viste for første gang den kliniske korrelation af plasma OPN med metastase af CRC patienter. Høj postoperativ plasma OPN niveau ( 153,02 ng /ml) i forbindelse med udvikling af metastaser efter kurativ resektion (p 0,001). Desuden postoperativ plasma OPN niveau korrelerede med sygdomsfri overlevelse af CRC patienter (p = 0,009) og var en uafhængig faktor til forudsigelse udvikling af metastase i CRC patienter efter kurativ resektion (p = 0,036). Vores

in vitro

model viste, at OPN ektopisk udtryk fremkaldt DLD1 cellevandring gennem Sneglen og Twist1 overekspression og E-cadherin undertrykkelse, og sekretorisk OPN niveau forbedret celle migration.

Konklusioner

resultaterne af den aktuelle undersøgelse tyder på, at postoperativ plasma OPN korreleret med postoperativ metastase, hvilket antyder, at det er en potentiel ikke-invasiv biomarkør for udviklingen af ​​fremtidige metastase i CRC patienter. Endvidere blev OPN vist at være involveret i den metastatiske proces og dermed hæmning af OPN er en potentiel terapeutisk tilgang til behandling af CRC patienter

Henvisning:. Ng L, Wan TM-H, Lam CS-C, Chow AK-M, Wong SK-M, Man JH-W, et al. (2015) Post-operative Plasma Osteopontin forudser fjernmetastaser i Human kolorektal cancer. PLoS ONE 10 (5): e0126219. doi: 10,1371 /journal.pone.0126219

Academic Redaktør: Rajeev Samant, University of Alabama i Birmingham, UNITED STATES

Modtaget: August 28, 2014 Accepteret: 30 marts 2015; Udgivet: 11 maj, 2015

Copyright: © 2015 Ng et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er den tredje mest almindelige malignitet i verden [1]. Årligt, over 1,2 millioner mennesker udvikler CRC globalt, med mere end 600.000 patienter dør af sygdommen i 2008 [2]. Forekomst og dødelighed for CRC er faldet som følge af forbedrede test, der tillader tidlig påvisning af kræft, når det kan lettere behandles med kirurgi og kemoterapi sammen med strålebehandling [3]. Trods disse fremskridt i klinisk behandling, den overordnede prognose CRC patienter er stadig utilfredsstillende på grund af kræft metastaser. Derfor er det vigtigt at udvikle yderligere biomarkører for at forbedre prognosen for CRC patienter ved forudsigelse eller tidlig påvisning af okkult metastaser.

Blod-baseret, minimalt invasive markører ville være stigende betydning i CRC screening og overvågning af CRC patienter. Carcinoembryonalt antigen (CEA) og CA19-9 er blevet almindeligt vurderet i CRC patienter, men med varierende resultater, afhængigt af undersøgelsens design og undersøgelsespopulationen [4], og deres kliniske association med kræft metastaser er ikke blevet påvist hidtil. Selvom mange biomarkører er under evaluering til påvisning af CRC fra serum, ingen af ​​dem har tilstrækkelig følsomhed og specificitet, der skal overvejes i de nuværende retningslinjer [4].

Osteopontin (OPN) er et udskilt glycoprotein med en multi -domæne struktur og funktioner der er karakteristiske for et ekstracellulært protein [5]. Det er en lille integrin-bindende ligand

N

-bundet glycoprotein (SIBLINGNIVEAU), der binder til celleoverfladereceptorer, herunder integriner og CD44 [6]. OPN udtrykkes i mange væv og udskilles i kropsvæsker, herunder blod, mælk og urin [7-9], som har vigtige fysiologiske roller i knogleomdannelse, immunrespons og inflammation [10]. Det er også et tumor-associeret protein og forhøjede OPN niveauer er forbundet med cellulær proliferation, invasion og angiogenese via ændret aktivitet af matrixmetalloproteinaser, den epidermale vækstfaktor receptor og PI3K-AKT signalering [11, 12]. Disse prækliniske undersøgelser tyder på, at plasma OPN kunne være et vigtigt ikke-invasiv biomarkør for okkulte systemiske metastaser. I overensstemmelse, i en nylig metaanalyse af over 228 publikationer, høj tumor eller plasma OPN niveauer korreleret med nedsat sygdomsfri overlevelse og samlet overlevelse i multiple tumorer, herunder lungekræft, brystkræft, prostatakræft, hoved- og halscancer og levercancer [13].

Forøgede niveauer af OPN-mRNA og protein er blevet påvist i CRC sammenligning med den ikke-tumorvæv [14-17], og den høje ekspression korrelerede med metastatiske funktioner såsom lymfeknudemetastase og fjernmetastase [17]. Nitsche

et al

‘s undersøgelse, som undersøgte mere end 200 patienter med stadium II tyktarmskræft demonstrerede dog, at tumorvæv niveau af osteopontin var nyttigt til påvisning af tilstedeværelsen af ​​tyktarmskræft, men ikke til at forudsige prognosen for den patienter [18]. Disse undersøgelser tydede på, at OPN væv plan endnu ikke var genfremsat at opdage eller forudsige CRC metastaser. Blood OPN niveau er blevet foreslået som en mulig detektiv biomarkør for CRC, men dets kliniske korrelation med CRC metastaser er ikke påvist hidtil. Desuden er de fleste af undersøgelserne kræft med fokus på den kliniske betydning af præ-operative plasma OPN niveau, mens den postoperative plan kræftpatienter sjældent er blevet undersøgt. Derfor i denne undersøgelse, vil vi undersøge clinicopathogical betydning samt den prognostiske potentiale præ-operative og post-operative plasma OPN niveauer af CRC patienter.

Materialer og metoder

Patienter og prøver

den menneskelige prøveindsamling protokol er blevet godkendt af Institutional Review Board (IRB) fra University of Hong Kong, og al klinisk undersøgelse er blevet udført i henhold til principperne i Helsinki-erklæringen. Informeret skriftligt samtykke er indhentet fra deltagerne. Pre-operative blodprøver blev opnået fra 96 ​​patienter, som gennemgik kirurgisk resektion af primær CRC ved Institut for Kirurgi, Queen Mary Hospital, The University of Hong Kong, mellem 1998 og 2007. Vævsprøver blev opnået fra 32 ud af de 96 patienter, straks frosset i flydende nitrogen og holdt ved -80 ° C indtil analyse. Den postoperative blod blev opnået fra patienter under deres postoperativ opfølgning besøg på vores klinik (sædvanligvis inden for 6 måneder efter kirurgisk indgreb). Blod blev antikoaguleret med EDTA og derefter centrifugeret ved 2.500 rpm i 10 min. Plasmaet blev opsamlet, opdelt i prøver, og lynfrosset ved -80 ° C indtil brug. Klinisk-patologisk data og blod CEA-niveau blev opnået fra patienten database af vores hospital.

Enzyme-linked immunosorbent assay

plasmaniveau af OPN eller sekretorisk OPN niveau i CRC cellelinier blev målt ved anvendelse af en kommerciel enzymkoblet immunosorbent assay kit (R E-cadherin-forward primer: 5′- TGGAGGAATTCTTGCTTTGC-3 ‘; E-cadherin-revers primer: 5’- CGTACATGTCAGCCAGCTT-3 ‘; Snail-forward primer: 5’-CAGACCCACTCAGATGTCAA-3 ‘, snail-revers primer: 5′-CATAGTTAGTCACACCTCGT-3’; Twist1-Forward primer: 5’GGGAGTCCGCAGTCTTAC-3 ‘, Twist1-Reverse Primer: 5’CCTGTCTCGCTTTCTC-TTT-3′; GAPDH- forward primer: 5’- GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG -3 ‘, GAPDH- revers primer: 5′- ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA 3’. Real-time PCR blev udført under anvendelse af ABI 7900HT Hurtig Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster, CA) ved 95 ° C i 10 minutter, efterfulgt af 40 cyklusser ved 95 ° C i 15 sekunder og ved 56 ° C i 1 min. Hvert assay blev udført tre gange, gennemsnittet beregnes for og ekspressionsniveauet af mål-mRNA blev udtrykt som fold til ekspression af GAPDH. For celle-line eksperimenter blev fold-change beregnet ud fra ændringen i overflod af udskrift af interesse (normaliseret til GAPDH) fra forsøgsgruppe sammenlignet med overflod af udskrift af interesse (normaliseret til GAPDH) fra kontrolgruppen.

Plasmidkonstruktion

OPN fuld længde kodende sekvens blev forstærket af OPN-

Kpn

I-Forward Primer CGGGGTACCGTGCCAGCCAAACAACAAA og OPN-XbaI-Reverse Primer TGCTCTAGATGCAAAGTGAGAAATTGTATTT, hjælp Platinum

Taq

DNA Polymerase High Fidelity (Life Technoloies) i henhold til producentens anvisninger. Den PCR-cyklus var 94 ° C i 2 min, efterfulgt af 30 cykler af 94 ° C i 30 sek, 56 ° C i 30 sek og 68 ° C i 2 min. OPN PCR-produktet blev oprenset ved Qiagen PCR oprensningssystem (Valencia, CA, USA) ifølge producentens protokol. PcDNA3.1-vektoren (Invitrogen) og OPN oprenset PCR-produkter blev fordøjet af

Kpnl

I og

Xbal

I restriktionsenzymer (New England Biolabs), oprenset og ligeret med DNA-ligase (New England Biolabs). Ligeringsproduktet blev transformeret ind i DH5a kompetente celler (Life Technologies) ifølge producentens anvisninger. Plasmiderne blev ekstraheret ved den Qiaprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) sekvens fidelity blev bekræftet ved DNA-sekventering.

cellelinier, vævskultur, transfektioner og reagenser

CRC cellelinier blev opretholdt i DMEM med 10% føtalt bovint serum og antibiotika (Invitrogen, Carlsbad, CA), 5% CO

2 ved 37 ° C. DLD1 og SW480-celler blev transient transficeret med vektor kontrol eller OPN ekspressionsplasmid under anvendelse af lipofectamin 2000-reagens (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. DLD1-OPN1 og vektorkontrol stabile kloner blev genereret ved selektion i dyrkningsmedium indeholdende 1 mg /ml G418 (Roche) i 3 uger. HCT116 og SW620-celler blev transient transficeret med siRNA negativ kontrol eller OPN siRNA oligonukleotider (Invitrogen) under anvendelse af Lipofectamine 3000 reagens (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner.

Protein ekstraktion og western blot-analyse

Cell -lines blev høstet, opsamlet og lyseret i RIPA-puffer (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) indeholdende 1 mmol /l phenoylmethylsulfonyl fluorid i 1 time på is. Lysatet blev centrifuge ved 12.000 x g i 15 minutter og supernatanten blev overført til et nyt sterilt rør. Proteinkoncentrationen blev bestemt ved anvendelse BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific). Lyseret protein blev suspenderet i natriumdodecylsulfat-prøvepuffer, kogt, løst i natriumdodecylsulfat-polyacrylamid gelelektroforese og overført til PVDF-membraner (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Antistoffer mod E-cadherin og GAPDH (for normalisering) blev indkøbt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Repræsentative Western blots af eksperimenter, der blev gentaget 3 gange, er vist. Densitonmetry blev udført på de vestlige blots hjælp ImageJ software.

In vitro

migration og invasion assay

Celler blev høstet, resuspenderes i serum-frit medium og podet ind Transwell kammer (Corning eller BD Biosciences). To hundrede og halvtreds mikroliter af en 50000 cellesuspension i serum-frit medium blev tilsat til det øvre kammer, som blev anbragt i en 24-brønds plade med bunden fyldes med 750 pi komplet medium som en kemoattraktant. Efter 3 dage migreret antallet af celler blev bestemt ifølge producentens instruktioner. Hvert forsøg blev gjort i to eksemplarer, og resultaterne blev præsenteret som gennemsnit ± SD af tre uafhængige forsøg.

Statistisk analyse

Foreningen af ​​plasma OPN niveauer med kontinuerlige variabler blev testet med Pearsons korrelation. T-test blev anvendt til at sammenligne forskellen mellem to grupper. Forskelle i tilbagefaldsrater i forskellige grupper af patienter med CRC blev evalueret af Fisher eksakte test. Sygdomsfri overlevelse blev analyseret under anvendelse af Kaplan-Meier produkt limit fremgangsmåde og log-rank test. Univariate og multivariate analyser i en Cox proportionel-farer model for blev udført prognostiske indikatorer. Alle disse statistiske analyser blev udført med SigmaPlot 10,0 (Systat Software Inc., San Jose, CA, USA) eller SPSS 10.0 software (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). Statistisk signifikans blev sat til p ≤ 0,05.

Resultater

Sammenligning af plasma OPN niveau mellem normale donorer og CRC patienter

Vi først bestemmes plasma OPN niveauet fra 56 normale donorer og 83 CRC patienter før kirurgisk resektion af deres tumorer. Den gennemsnitlige plasma OPN niveau af CRC patienter 160.31 ng /ml, hvilket var betydeligt højere end for normale donorer (115.27 ng /ml; p 0,001). Vi yderligere opdelt patienterne i tidlig fase (fase I til II, n = 45) og forskud (stadium III-IV, n = 38). Den gennemsnitlige plasma OPN niveau af patienter forhånd stadie (187,91 ng /ml) var signifikant højere end i normale donorer (p 0,001), mens niveauet af patienter tidligt stadie (137,00 ng /ml) var ubetydeligt højere (p = 0,052). Disse resultater antydede, at plasma OPN kunne være en ikke-invasiv biomarkør til screening CRC patienter med forudgående tumor stadium, men dets følsomhed faldt i screening tidlige stadium CRC patienter.

Korrelation af præ-operative plasma OPN niveau med OPN transcript udtryk og klinisk-patologiske parametre

Vi næste undersøgt sammenhængen mellem den præ-operative plasma OPN-niveau og den parrede tumor OPN udskrift niveau i 32 CRC patienter. Som vist i fig 1A, der var en positiv korrelation mellem OPN niveau i plasma og CRC tumor (R = 0,452, p = 0,0010), hvilket antyder, at plasma OPN niveau i CRC patienter var repræsentativ for deres CRC OPN ekspression. Vi derefter undersøgte korrelationen af ​​præoperative plasma OPN niveau på 83 CRC patienter med deres klinisk-patologiske data (tabel 1). Plasma OPN niveau korrelerede ikke med alder, køn og lymfeknude metastaser. Signifikant højere plasma OPN niveau blev påvist hos patienter med tumorstørrelse over 5 cm (180,4 vs 140,7 ng /ml, p = 0,003; 1C), højere trin (187,9 vs 137,0 ng /ml, p 0,001, Fig 1D) og metastaserende CRC (197,0 vs 148,7 ng /ml, p = 0,003, fig 1E). Den præoperative plasma OPN niveau også positivt korreleret med tumorstørrelse (R = 0,390, p 0,001, Fig 1B). Disse resultater viste, at præ-operative plasma OPN var en potentiel ikke-invasiv biomarkør for tumorudvikling og metastase. Vi undersøgte også, om præoperativ plasma OPN niveau korreleret med fremtidig metastase af CRC patienter, der viste ingen fjernmetastaser ved operation. Vores resultater viste, at en sådan plan viste ingen signifikant forskel mellem patienter med og uden fremtidig metastase (132,09 vs 130,63 ng /ml, p = 0,951, Fig 1F)., Hvilket indikerer, at præ-operative plasma OPN niveau ikke prognostisk for fremtidig metastase

(

A

) korrelation af præoperativ plasma OPN niveau med den parrede tumor OPN udskrift niveau i 32 CRC patienter (R = 0,452, p = 0,010; Pearson korrelation). (

B

) Korrelation af præoperativ plasma OPN niveau med tumorstørrelse (R = 0,390, p 0,001; Pearson korrelation). (

C

) Sammenligning af præ-operative plasma OPN niveauer hos patienter med tumor ≥ 5 eller 5 (p = 0,003; t-test) (venstre). (

D

) Sammenligning af præ-operative plasma OPN-niveauer i patienter med lavere (I til II) eller højere trin (III til IV) (p 0,001; t-test). (

E

) Sammenligning af præ-operative plasma OPN-niveauer i patienter med eller uden fjernmetastaser (p = 0,003; t-test). (

F

) Sammenligning af præ-operative plasma OPN-niveauer i patienter med eller uden postoperativ metastase (p = 0,951; t-test). Alle data er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

Klinisk betydning af postoperative plasma OPN niveauer

Vi næste undersøgte den prognostiske værdi af postoperativ plasma OPN niveau udviklingen af ​​postoperativ metastase i en anden kohorte af 89 CRC patienter. 40 af dem udviklede postoperativ metastase inden 30 måneder, og disse patienter viste signifikant højere postoperativ plasma OPN niveau end de 49 ikke-metastatiske patienter (187,0 vs 145,7 ng /ml, p = 0,004; Fig 2A). Anvende den samlede median postoperativ plasma OPN niveau (153,02 ng /ml) af CRC patienter i denne undersøgelse som tærskelværdien, CRC patienter med højt postoperativ plasma OPN niveau var mere tilbøjelige til at udvikle fjernmetastaser (29 ud af 45 patienter) end dem med lav postoperativ plasma OPN niveau (11 ud af 44, s t-test). (

B

) forekomst af postoperativ metastaser i CRC patienter med høj (≥153.02 ng /ml) eller lav ( 153,02 ng /ml) postoperativ plasma OPN niveau. (C) ROC-kurve under anvendelse af postoperativ plasma OPN niveau for kræsne patienter med postoperativ metastase fra dem uden postoperativ metastase. (D) Korrelation af postoperativ plasma OPN med sygdomsfri overlevelse af CRC patienter (p = 0,009; log-rank test). Alle data er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

Sammenligning af prognostisk betydning mellem plasma OPN og blod CEA

For at bekræfte, at postoperativ plasma OPN niveau var en vigtig prognostisk faktor for fremtiden metastase, vi undersøgte de prognostiske værdier af postoperativ plasma OPN-niveau og præoperativ plasma OPN niveau for sygdomsfri overlevelse (DFS) i 44 fase i til III CRC patienter med grundig betjening og opfølgning oplysninger. Stage IV CRC patienter, hvor distale metastaser kan være til stede før operation blev udelukket fra denne analyse. Som vist i fig 2D, CRC patienter med lavere postoperativ plasma OPN niveau viste en signifikant længere sygdomsfri overlevelse end dem over tærskelværdien (p = 0,009), hvorimod præoperativ plasma OPN niveau ikke korrelerer med DFS af CRC patienter (S1 fig). Vi undersøgte også den prognostiske værdi af CEA niveauer (S1 Fig). Hverken præoperativ eller postoperativ CEA korreleret med DFS (p = 0,235 og 0,410 henholdsvis).

Risikofaktorer for sygdomsfri overlevelse for CRC patienter

Vi anvendte univariate og multivariate analyser at bestemme risikofaktorer for DFS af de ovennævnte 44 CRC patienter (tabel 2). Blandt de kliniske faktorer undersøgt i univariat analyse blev kun postoperativ plasma OPN niveau signifikant korreleret med DFS. Desuden viste vores multivariat analyse, at postoperativ OPN niveau og lymfeknude metastaser var risikofaktorer for DFS.

In vitro effekt af forhøjet OPN udskrift og sekretoriske OPN niveauer

Endelig undersøgte vi

in vitro

virkninger af OPN overekspression på sekretorisk OPN niveau og metastatisk træk ved CRC-celler. Vi sammenlignede først de transskriptionelle og sekretoriske OPN niveauer af to relativt ikke-metastatiske cellelinier DLD1 og SW480, og to metastatiske cellelinier SW620 og HCT116 [19, 20]. Efter 3 dage, begge niveauer var signifikant lavere for DLD1 og SW480 celler sammenlignet med SW620 og HCT116-celler (Fig 3A og 3B), hvilket antyder, at OPN transkript niveau korreleret med dets sekretoriske niveau, og høj OPN niveau korreleret med den metastatiske potentiale CRC celler. Vi næste stabilt overudtrykt OPN i DLD1 celler og genererede to stabile OPN transfektanter (DLD1-OPN # 1 og DLD1-OPN # 3), begge udtrykt højere niveau af OPN udskrift, protein og sekretorisk protein end DLD1-vektor kontrol (fig 3C, 3E og 4A). Vi bestemmes effekt på spredning, celle invasion og celle migration. Vores resultater viste, at OPN overekspression betydeligt induceret celle migration i DLD1 celler (Fig 4B), men ændrede ikke den vækstrate og celleinvasion evne (S2 Fig). For at bekræfte effekten af ​​OPN på celle migration, vi forbigående knock-down OPN udtryk i DLD1-OPN stabil klon af siRNA teknik. Sammenligning til siRNA kontrol transficerede celler, DLD1-OPN celler transficeret med siOPN vises signifikant lavere niveau af OPN transkript og protein samt sekretorisk OPN-protein (fig 3D, 3E og 4D). Vigtigere, blev migration sats også betydeligt undertrykt efter siOPN transfektion (Fig 4E), styrkelse af den regulerende rolle OPN på celle migration. Derudover undersøgte vi effekten af ​​sekretoriske OPN niveau på cellemigration ved at anvende dyrkningsmedium fra DLD1-OPN stabile kloner eller vektor kontrol (1: 1 blandet med frisk dyrkningsmedium) som kemoattraktant for cellemigrationsassay hjælp DLD1 celle som model. Vi fandt, at dyrkningsmediet med højere OPN niveau væsentligt induceret DLD1 cellevandring (Fig 4C). Desuden blev DLD1 migration celle væsentligt forringet ved anvendelse dyrkningsmedium af siOPN transficerede DLD1-OPN # 1-celler sammenlignet med den for siCTL transficerede celler (Fig 4F).

(

A og B

) Sammenligning af (

A

) transkriptionel og (B) sekretoriske OPN niveauer af to svagt metastatisk CRC cellelinier (DLD1 og SW480) og to metastatiske CRC cellelinier (SW620 og HCT116) (En måde ANOVA) .

(C)

OPN mRNA ekspressionen af ​​to DLD1-OPN stabile kloner (DLD1-OPN # 1 og # 3) og vektor kontrol (DLD1-Vector) og effekt af stabile OPN overekspression på mRNA ekspressionen af ​​EMT regulatorer E -cadherin, Twist og Snail (En måde ANOVA).

(D)

OPN mRNA ekspressionen af ​​siCTL eller siOPN transficerede DLD1-OPN # 1 celler og effekt af OPN siRNA på mRNA ekspressionen af ​​EMT regulatorer E-cadherin, Twist og Snail (t-test).

(E)

Effekt af OPN overekspression eller siRNA på E-cadherin proteinekspression. GAPDH tjente som lastning kontrol. Densitometri blev udført på Western blots ved anvendelse af ImageJ software og en asterisk angiver forskellen var statistisk signifikant (p 0,05) sammenlignet med kontrolgruppen (DLD1-V1 eller DLD1-OPN1 siCTL; envejs-ANOVA eller t-test). Alle data er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

(

A

) Sammenligning af relative sekretoriske OPN niveauer af to DLD1-OPN stabile kloner (DLD1-OPN # 1 og # 3) med den for DLD1-vektor kontrol (envejs-ANOVA). (

B

) Sammenligning af antallet af DLD1-OPN stabile kloner (DLD1-OPN # 1 og # 3) celler migrerede med den af ​​DLD1-vektor kontrol celler (En måde ANOVA). (

C

) Sammenligning af antal DLD1 celler migreret hjælp dyrkningsmedium fra DLD1-OPN stabile kloner (DLD1-OPN # 1 og # 3) eller DLD1-vektor kontrol som kemoattraktant (En måde ANOVA). (

D

) Sammenligning af relative sekretoriske OPN niveauer af DLD1-OPN # 1 stabil klon transficeret med siRNA-kontrol (siCTL) eller OPN siRNA (siOPN) (t-test). (

E

) Effekt af siCTL eller OPN siRNA transfektion om migration af DLD1-OPN # 1 stabile celler (t-test). (

F

) Sammenligning af antal DLD1 celler migreret hjælp dyrkningsmedium fra DLD1-OPN stabile kloner transficeret med siCTL eller siOPN som kemoattraktant (t-test). Alle data er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

Derudover vores resultater viste, at overekspression af OPN i DLD1 celler betydeligt inducerede transkription af Sneglen og Twist, som er inducere af epitel-til-mesenkymale overgang (EMT) proces ved nedregulering E-cadherin og fremme cellemigration, invasion og metastase [21-23]. Som forventet blev Transcript og protein niveauer af E-cadherin væsentligt reduceret i DLD1-OPN stabile kloner (fig 3C-3E). På den anden side, efter siOPN transfektion blev transkriptionen af ​​Sneglen og Twist undertrykt, og resulterede i forhøjelse af E-cadherin transkription og translation (Fig 3D og 3E). Disse resultater antydede, at induktion af EMT-processen er ansvarlig for den forøgede cellemigrering OPN-overudtrykker DLD1 celler.

Discussion

Den samlede prognose for CRC patienter stadig utilfredsstillende på grund af cancermetastase, derfor er det vigtigt at udvikle yderligere biomarkører for at forbedre prognosen for CRC patienter ved forudsigelse eller tidlig påvisning af okkult metastase. Blod-baserede, minimalt invasive markører ville være stigende betydning på grund af den lethed og bekvemmelighed af prøvetagning. Blood CEA og CA19-9 er blevet almindeligt vurderet i CRC patienter, men med varierende resultater, afhængigt af undersøgelsens design og undersøgelsespopulationen [4], og deres kliniske association med kræft metastaser mangler. Derfor mener vi, det ville være afgørende for at forbedre prognosen for metastatisk CRC patienter udvikling af yderligere blod-baserede biomarkør.

Øget OPN mRNA og protein er blevet påvist i CRC sammenligne med den ikke-tumorvæv [ ,,,0],14-17]. OPN ekspression reguleres af en lang række stimuli, der er forbundet med CRC progression og metastase [24-27], der involverer komplekse regulerende veje. Forskellige vækst- og differentieringsfaktorer også øge OPN ekspression, herunder blodpladeafledt vækstfaktor, epidermal vækstfaktor, transformerende vækstfaktor-β, knoglemorfogene proteiner og inflammatoriske cytokiner [28]. Desuden er transkription af OPN også direkte aktiveres af et antal transkriptionelle regulatorer herunder Wnt signalering og TCF-4 [28], som er en velkendt dereguleret pathway fremme CRC. I nærvær af β-catenin, TCF-4 samvirker at stimulere OPN promoter aktivering og proteinproduktion [29]. Vi mente, at aktiveringen af ​​disse faktorer og signalvejen under CRC tumor progression inducerer OPN ekspression og efterfølgende cancercellen metastase.

Plasma OPN er en potentiel ikke-invasiv prognostisk markør for tumorudvikling, invasion og metastase i gastrointestinal cancere [30]. Mens høje plasma OPN niveau er blevet associeret med metastatiske funktioner i en række forskellige cancere, såsom gastrisk cancer [31], hepatocellulært carcinom, esophageal pladecellecarcinom [32], renalcellecarcinom [33], prostatacancer [34] og brystcancer patienter [35], dens sammenhæng med CRC metastaser er ikke påvist hidtil.