PLoS ONE: Kromosomal Ustabilitet i nærheden-diploid Kolorektal Cancer: en forbindelse mellem tal og struktur

Abstrakt

Kromosomal ustabilitet (CIN) spiller en afgørende rolle i tumor udvikling og forekommer primært som følge af enten missegregation af normale kromosomer (MSG) eller strukturel omlejring (SR). Men lidt om de respektive kromosomale mål for MSG og SR og den måde disse processer kombineret i tumorer til at generere CIN. For at løse disse spørgsmål, vi karyotyped en fortløbende serie af 96 nær-diploide kolorektal kræft (CRC’er) og fornemme kromosomændringer genereret af enten MSG eller SR i tumorceller. Firs-tre tumorer (86%) præsenteret med kromosomafvigelser, der indeholdt både msgs SRS i varierende grad mens alle 13 andre (14%) viste normal karyotype. Ved hjælp af en maksimal sandsynlighed statistisk metode, kromosomer påvirket af MSG eller SR og sandsynligvis repræsenterer ændringer, der er udvalgt til under tumorprogression blev fundet at være forskellige og hovedsagelig gensidigt udelukkende. Msgs SRS var ikke tilfældigt forbundet inden tumorer, afgrænse to store veje for kromosom forandringer, der bestod af enten kromosom gevinster ved MSG eller kromosomale tab ved både MSG og SR. CRC’er viser mikrosatellit instabilitet (MSI) præsenteret med enten normale karyotype eller kromosomfejl gevinster mens MSS (mikrosatellit stabil) CRC’er udstillet en kombination af de to veje. Tilsammen disse data giver ny indsigt i den respektive inddragelse af MSG og SR i nær-diploide kolorektal kræft, der viser, hvordan disse processer målrette distinkte dele af genomet og resultere i specifikke mønstre af kromosomale ændringer i henhold til MSI status.

Henvisning: Muleris M, Chalastanis A, Meyer N, Lae M, Dutrillaux B, Sastre-Garau X, et al. (2008) Kromosomal Ustabilitet i nærheden-diploid Kolorektal Cancer: en forbindelse mellem tal og struktur. PLoS ONE 3 (2): e1632. doi: 10,1371 /journal.pone.0001632

Academic Redaktør: Dong-Yan Jin, University of Hong Kong, Kina

Modtaget: 8. oktober, 2007; Accepteret: 21 januar 2008; Publiceret: 20 feb 2008

Copyright: © 2008 Muleris et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde (Groupement des entreprises françaises dans la lutte contre le cancer) blev delvist støttet af tilskud fra foreningen pour la Recherche contre le cancer (ARC n ° 3946) og GEFLUC. AC var modtager af et stipendium fra le Ministère Français de la Recherche (MRT)

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Det er blevet påvist, at kromosomer vise ikke-tilfældige ændringer i kræftceller. Disse omfatter strukturelle rearrangementer (SRS), f.eks sletninger, amplifikationer eller translokationer, der opstår fra pauser i DNA, samt ændringer i antallet af intakte kromosomer, kendt som hel-kromosom missegregations (Besk) med oprindelse fra fejl i celledeling (mitose). Som et resultat af ophobning af sådanne processer, er kromosomal ustabilitet (CIN) kendt for at spille en nøglerolle i tumorudvikling. Men lidt om den nøjagtige bidrag MSG og SR i CIN og om de virker synergistisk under tumorprogression. Selvom kromosomal omlejring er en veldokumenteret proces i forbindelse med tumorigenese, bidrag fra hele-kromosom aneuploidi til tumor udvikling er stadig genstand for kontrovers. Kolorektale cancere (CRCs) er blevet klassificeret i to store molekylære undertyper: CIN og MSI (for “mikrosatellit ustabilitet”, også kaldet MIN). MSI CRC’er udgør ca. 15-20% af sporadiske kolorektal kræft. Det er en veldefineret undertype, der resulterer fra et tab af DNA mismatch repair (MMR) funktion, sekundært til inaktivering af MMR-gener. Ved ikke at reparere spontane fejl, som opstår under replikation, disse tumorer akkumulerer læserammeforskydningsmutationer der påvirker tumorsuppressorgener indeholder kodning gentagne sekvenser [1]. MSI tumorer menes at være nær-diploid med få, om nogen, karyotypic abnormiteter. Omvendt CIN viste sig at forekomme i ikke-MSI cancere (eller MSS for “mikrosatellit stabil”), der repræsenterer størstedelen af ​​CRCs og er godt inde for mismatch reparation. Selvom observeret hos ca. 80% af sporadiske colorektale tumorer, er CIN fænotype mere dårligt defineret end MSI. Oprindeligt brugt til at beskrive tumorer, der udviser en høj grad af intercellulære heterogenitet i kromosom nummer, som beregnet af tæller for et begrænset sæt af kromosom-specifikke centromerer [2], blev CIN yderligere ansat til at beskrive kræft med enten aneuploid eller polyploid DNA-indhold som målt ved cytometri eller cytogenetik eller flere gevinster eller sletninger af kromosomer eller kromosom arme, eller hyppige tab af heterozygositet (LOH). På nuværende tidspunkt er der ikke enighed om den eksperimentelle fremgangsmåde, der skal anvendes, eller minimumssatsen for kromosomal ustabilitet kræves for at definere CIN tumorer. Dette resulterer i meget strøm forvirring i litteraturen om forholdet mellem MSI og CIN efter den metode, der anvendes til at estimere CIN i sådanne CRCs. Selvom MSI og CIN blev anset gensidigt udelukkende, både vores tidligere data og de seneste undersøgelser tyder på, at nogle MSI tumorer kan også vise tegn på CIN, selv om omfanget og karakteren af ​​denne overlapning er endnu ikke fastslået [3] – [8].

cytogenetik giver en morfologisk tilgang til CIN at i sammenligning med molekylære studier gør det muligt at nemt at skelne beskeder fra SRS. Her brugte vi denne tilgang til mere præcist karakterisere CIN i en fortløbende serie af 96 nær-diploide kolorektale primære tumorer, der blev prospektivt indsamlet over en periode på 10 år. Nær-diploide tumorer blev valgt på grund af den involveret i fastlæggelse gevinster og tab i polyploide tumorer, der har gennemgået endoreduplikation tvetydighed. Faktisk fortolkning af alle numeriske kromosomforandringer observeret i en triploid tumor for eksempel, er helt anderledes, om en sådan tumor betragtes som en diploid tumor, der har fået mange kromosomer eller som har undergået endoreduplikation med yderligere efterfølgende kromosom tab at nå triploidy. I det foreliggende arbejde, blev næsten diploide CRC’er defineret som dem med en række kromosomer mellem 35 og 57, i henhold til det internationale system for Cytogenetisk nomenklatur [9]. De udgør 50,2% af vores indledende serier af karyotyped CRC’er (data ikke vist), hvilket er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser, der har vist det diploide brøkdel af CRC’er at være omkring 40% ([10], til gennemgang). Vi undersøgte i detaljer karakter og mål af CIN i disse tumorer. Ved at skelne kromosomale ændringer genereret af MSG eller SR, var vi i stand til at udarbejde en liste over kromosomer eller kromosomale regioner målrettet af MSG og SR og at undersøge, hvordan disse processer var forbundet inden tumorer i at generere CIN. Vi kiggede også for forskelle i karakteren af ​​CIN mellem MSI og MSS undertyper af CRC. Nye indsigter vedrørende rolle CIN i CRC blev opnået, tilladt os at foreslå et nyt perspektiv på carcinogenese i nær-diploid CRC’er der tager hensyn til både deres cytogenetiske og molekylære egenskaber.

Resultater

Missegregations og strukturelle rearrangementer kromosomer målrette forskellige dele af tumor genom i nær-diploide CRC’er

en serie af 96 nær-diploide kolorektale tumorer blev analyseret blandt hvilke 13 tilfælde viste en normal karyotype. Det samlede antal hel-kromosom gevinster var sammenlignelig med hel-kromosom tab (224 og 189 henholdsvis Chi2 = 2,96, p = 0,10). Whole-kromosom og -tab, der involverer individuelle kromosomer (supplerende tabel S2) blev samlet og fordelingen af ​​missegregated kromosomer blev testet ved hjælp af en sandsynlighed statistisk modellering. Frekvensen af ​​missegregation for individuelle kromosomer varierede fra 0-54% (figur 1A). Den højeste sandsynlighed blev observeret i to grupper, der indeholder 12 kromosomer hver, med p1 = 0,42, p2 = 0,13 og alpha = 0,46. Den første gruppe bestod, ved at nedsætte hyppigheden af ​​missegregation, kromosomer 18, 20, Y, 13, 7, X, 12, 14, 15, 8, 4 og 6. Denne gruppe vil sandsynligvis repræsentere mål kromosomer, hvis missegregation er valgt for under tumor evolution. For de fleste af disse kromosomer, blev en klar tendens observeret i retning enten forstærkning (kromosomer 7, 12, 13, 20 og X) eller tab (kromosomer 4, 14, 15, 18 og Y) (figur 1B). Den anden gruppe vil sandsynligvis repræsentere baggrunden af ​​kromosomal ustabilitet forekommer MSG i kolorektale tumorer. Samme fremgangsmåde blev anvendt til kromosomer involveret i strukturelle omlejringer. Frekvensen af ​​omlejringer for individuelle kromosomer varierede fra 0-42.7% (figur 1C). Sandsynligheden statistisk modellering (p1 = 0,38, p2 = 0,07, alpha = 0,58), at blandt de involverede i særhenstillinger kromosomer, kun kromosomer 17, 1, 8, 13, 6, 5, 11, 10, 9 og 4 vil sandsynligvis repræsenterer target kromosomer, der er udvalgt til under tumor progression. Af alle disse kromosomer undtagen 4, 9 og 11, blev en klar tendens observeret mod enten kromosom arm gevinst (8q, 13q og 17q) eller tab (1p, 5q, 6Q, 8 p, 10Q og 17p) (Figur 1D). Blandt de samlede ubalancer, som følger fra SRS, sletninger var dobbelt hyppigere end gevinster (197 versus 101 henholdsvis Chi2 = 30,92, p 0,001, se supplerende tabel S3). En samling af de kromosomale mål for MSG og SR er repræsenteret på figur 2. Med undtagelse af kromosomer 4, 6, 8 og 13, disse var gensidigt udelukkende (kromosomer 7, 12, 14, 15, 18, 20, X, Y for MSG sammenlignet med kromosomer 1, 5, 9, 10, 11, 17 for SR), der fremhæver, at disse processer primært rettet mod forskellige dele af tumor genom i nær-diploide CRC’er.

Frekvensen af ​​MSG (A) med deres resulterende gevinster og tab (B) og hyppighed for SR (C) med deres resulterende gevinster og tab (D) er repræsenteret. Den stiplede linie repræsenterer afskæringsværdi angivet af sandsynligheden statistisk modellering som skelner kromosomer, der sandsynligvis vil blive udvalgt til under tumorprogression (rød) fra dem, som udgør baggrunden af ​​kromosomal ustabilitet (grå). I B og D, hver bjælke repræsenterer procentdelen af ​​tab (lavere) eller forstærkning (øvre) af et kromosom (B) eller kromosom arm (D, s arm først, derefter q arm for ikke-acrocentriske kromosomer).

Blandt de kromosomer eller kromosomarmene, der sandsynligvis vil blive udvalgt til under tumorudvikling ifølge sandsynligheden modellering (se figur 1B og 1D), kun dem, for hvilke significative tendens til enten gevinster eller tab blev bibeholdt (Chi2 test , under nulhypotesen, bør antallet af gevinster og tab fordeles jævnt). Kromosomale tab (blå baggrund) og gevinster (rød baggrund) skelnes.

Beviser for privilegerede foreninger blandt kromosom forandringer

Det samlede antal missegregated kromosomer per tumor varierede fra 0-14 (middelværdi = 4,53 ± 3,08), og at af omarrangerede kromosomer fra 0-15 (middelværdi = 4,44 ± 3,66). Brug lineær sammenhæng analyser på de 83 tumorer, der udgør en unormal karyotype blev antallet af omarrangerede kromosomer sig ikke at være korreleret med missegregation begivenheder inden tumorer (r = 0,20, p = 0,07). Når hel-kromosom gevinster og tab var fornem, blev antallet af hel-kromosom gevinster og omarrangerede kromosomer omvendt korreleret (r = -0,31, p = 0,004), mens stigningen i antallet af hel-kromosom tab parallel, at af omarrangerede kromosomer (r = 0,69, p = 4,07 10

-13).

Vi næste undersøgt for mulige præferentielle foreninger blandt de hyppigste kromosom ubalancer frembragt af enten MSG eller SR, dvs. dem, der sandsynligvis ville blive udvalgt i CRCs efter sandsynligheden metode. En systematisk analyse af to-for-to associationer mellem 29 kromosomale ubalancer (406 muligheder) demonstrerede 51 foreninger (45 positive og 6 negative), der var betydeligt i vores tumor serie (p = 0,05) (Supplerende tabel S4). Vi ved, at i betragtning af, at 406 analyser blev udført, kunne det forventes, at 20 ud af disse 51 signifikante sammenhænge blev observeret tilfældigt alene (falsk positiv) på p = 0,05 niveauet. Ved hjælp af en p = 0,01 niveau blev 16 signifikante associationer fundet (figur 3), der er fire gange mere end antallet af falsk positive forventet, validering dermed eksistensen af ​​privilegerede foreninger. A p = 0,05 niveauet blev tilbageholdt til analyse. Blandt de 45 positive associationer, de fleste (84%), der beskæftiger udelukkende tab eller gevinster (27 og 11, henholdsvis) i forhold til syv, der viste gevinster blandet med tab (16%). Tyve (44,5%) viste sammenslutninger af MSG med SR begivenheder i forhold til 15 (33,3%) og 10 (22,2%), der er involveret udelukkende beskeder eller SRS-hhv. Ved at kombinere alle resultater fra to-for-to sammenslutninger af kromosomale ændringer observeret i CRC’er blev to hovedgrupper af kromosomafvigelser afgrænset (figur 3). Den første gruppe omfatter kun hel-kromosom gevinster ved MSG (13, 20, 7, + X, 12 og 6) mens den anden gruppe består hovedsageligt af kromosomale tab gennem MSG og SR (-18, -17p , -Y, -1p3, -8p, + 8Q, -14, + 13q, -15, -4, + 17q, 8, 6, -10q2, -11q, -9p, -8, -4p, – 11 p, -9q og -6 i faldende orden for forekomst). En mindre gruppe ikke er relateret til de tidligere to grupper bestod af en privilegeret forbindelse mellem -4q og -5q.

Skematisk fremstilling af de to-for-to forening undersøgelse fremlagt i supplerende Tabel S4. Positive (kontinuerlige linjer) og negative (stiplede linjer) foreninger er repræsenteret ved tykke og tynde linjer indikerer betydelige foreninger på p = 0,01 og 0,05 niveau, hhv. Størrelsen af ​​hver kasse er proportional med frekvensen af ​​ændringen, hel-kromosom eller kromosom arm gevinster (rød baggrund), og kromosom tab eller sletninger (blå baggrund) bliver fornem. De præferentielle associationer mellem ændringer, der involverer to parter samme kromosom, såsom -8p og + 8q eller -17p og + 17q, skal fortolkes med forsigtighed, da de stammer hovedsageligt fra en enkelt isokromosom formation begivenhed. For eksempel forstærkning af 17q synes at være en bivirkning af 17p deletion via isokromosom 17q formation (10/11 tumorer med 17q gevinst udviste også 17p tab henviser 17p tab alene blev observeret i yderligere 30 tumorer) både 8p tab og 8Q gevinst kan give tumorceller med en selektiv fordel, da selv associeret i 20 tumorer blev disse ændringer også observeret uafhængigt i 8 og 7 tumorer, henholdsvis (se også supplerende Figur S1). Nogle negative associationer (mellem 13 og + 13q, 8 og + 8q, 8 og -8p) kunne også skyldes det faktum, de indebærer det samme kromosom.

CIN ifølge MSI i tarmkræft

MSI status 66 tumorer, bestemt i henhold til internationale kriterier, viste 20 MSI og 46 MSS CRCs. Eftersom MSI tumorer er kendt for at være nær-diploide CRCs, det resulterede i en berigelse af MSI tilfælde i vores patienter kohorte, der er begrænset til nær-diploid CRCs (30%, dvs. 20/66 forhold til den forventede forekomst af 15-20% i overordnede CRCs). Dette tillod os at opnå en deraf følgende serie af MSI tumorer for at sammenligne deres cytogenetiske funktioner til den for den hyppigste MSS subtype. Klinisk-patologiske karakteristika tumorerne er vist i tabel 1 og Supplerende tabel S1. Alle variabler undtagen tumor placering blev ligeligt fordelt i de to undergrupper. Blandt de 10 tumorer med normal karyotype hvis MSI status blev bestemt, 7 var MSI, bekræfter en høj frekvens af MSI i ikke-CIN CRCs. Globale sammenligninger mellem MSS og MSI tumorer viste, at den sidstnævnte gruppe opholdt sig meget tæt på diploidi og udstillet betydeligt færre beskeder (gennemsnit på 1,45 versus 5,82 for MSS tumorer, p = 3 × 10

-10) SRS (gennemsnit 1,30 versus 5,02 for MSS tumorer, p = 1,2 x 10

-6) (tabel 1). Notatet de få observerede missegregations bestod hovedsagelig af hel-kromosom gevinster med meget sjældne tab hel-kromosom mens MSS tumorer præsenteret med mere komplekse CIN herunder både MSG og SR fører til kombinerede gevinster og tab af kromosomal materiale. Balanced omlejringer var relativt sjældne, men ikke signifikant forskellig mellem MSI og MSS CRC’er (tabel 1).

Klassifikation af CRC’er

På trods af eksistensen af ​​privilegerede to-for-to foreninger for nogle kromosomale ændringer, vi tilsidesat en klassifikation af tumorer i forskellige grupper ved hjælp af ukontrollerede hierarkisk klyngeanalyse baseret på kromosomale ændringer med et betydeligt konfidensinterval (bootstrap stimulation teknik). Dette taler for fravær af tilgængelige kriterier afgrænser forskellige delgrupper i nær-diploide CRC’er ifølge CIN.

Diskussion

I modsætning til nogle hæmatopoietiske tumorer eller sarkomer, er carcinomer ikke karakteriseret ved translokation begivenheder, der smelter en onkogen til en uhensigtsmæssig promotor. Faktisk i de fleste epitheliomas, kromosomal ustabilitet fortsætter gennem to store mekanismer, missegregation der resulterer i aneuploidi gennem gevinst eller tab af hele-kromosomer, og ubalanceret strukturelle rearrangementer (ubalancerede translokationer, sletninger, isochromosomes, …), der fører til tab og /eller forstærkning af kromosomale regioner. Vi analyserede her en stor serie af tæt-diploide kolorektal kræft ved klassiske cytogenetik at skelne kromosomale ubalancer, som følger af disse to mekanismer. Anvendelsen af ​​sandsynligheden statistisk modellering bidrog til at definere kromosom forandringer, der sandsynligvis vil blive udvalgt til under tumor evolution og dermed stige over baggrunden af ​​kromosomal ustabilitet. De udestående funktioner er at missegregation og strukturelle rearrangementer føre til kromosomale ubalancer, der er for det meste udelukker hinanden og kombineres for at generere CIN i næsten alle testede tumorer, hvilket tyder på, at kromosomale lidelser genereret af MSG SRS kan have komplementære snarere end additive effekter i CRC’er.

det overordnede mønster af kromosomale ubalancer, vi observerede i nær-diploid CRC’er er i overensstemmelse med tidligere rapporter, der brugte andre tilgange såsom CGH for genomet-dækkende vurdering af DNA-kopi nummer i tarmkræft (for gennemgang se [11]) . Imidlertid har spørgsmål om, hvordan missegregations og omrokeringer er fordelt, og hvordan ændringer er forbundet inden for tumorer sjældent blevet behandlet [12], [13]. Vores data viser, at strukturelle rearrangementer ophobes i takt med hel-kromosom tab i progressionen af ​​nær-diploide CRCs. I modsætning hertil hel-kromosom gevinster og rearrangementer, er omvendt korreleret. Samlet set er fordelagtige foreninger findes at afgrænse to veje for kromosom forandringer, der begunstigede ophobning af enten kromosomale tab eller kromosomfejl gevinster i kolorektale tumorceller, og som ikke udelukker hinanden. Af interesse, MSG og SR stærkt samarbejde om vej af kromosomale tab, der er forbundet med den såkaldte LOH vej, da det fører til hyppige kromosomale tab af samme loci som dem identificeret af LOH i CRCs, f.eks 17p, 18 og andre, der indeholder tumorsuppressorgener. I den anden vej, CIN fører udelukkende til ophobning af hel-kromosom gevinster gennem en missegregation proces, der involverer gentagne gevinster af kromosomer 20, 13, 7, X, 12 og 6. negative associationer til nogle ubalancer er også observeret (+12 og – 15, 12 og -17p, og 6 og -1p) tyder på, at kombinationen af ​​sådanne abnormiteter ville være skadelig for tumorceller. Tilsammen disse data giver en ny indsigt på vej MSG og SR kombinere under progressionen af ​​nær-diploid CRCs, hvilket antyder, at foreningen af ​​kromosomale ubalancer snarere end isolerede kromosomale ændringer ville være af funktionel betydning i denne proces.

da mikrosatellit ustabilitet er blevet beskrevet som en alternativ mekanisme til kolorektal celler til at blive ondartede, vi også sammenlignet cytogenetiske ændringer i nær-diploide CRC’er i forhold til deres mikrosatellit status. Som forventet blev MSI tumorer fortrinsvis placeret i den proksimale colon. Interessant, tab af hele-kromosomer var meget sjældne i MSI CRC’er og der blev observeret en netto tendens til hel-kromosom gevinster. Vores data er i overensstemmelse med nogle tidligere observationer rapporterer, at kromosom gevinster udgør en hyppig funktion i MSI CRCs. Faktisk tidlige studier fra vores gruppe ved hjælp karyotypebestemmelse demonstreret på et lille udsnit af tumorer, MSI CRC’er vist enten en normal karyotype eller kromosomfejl gevinster med ingen eller få rearrangementer [3]. Efterfølgende undersøgelser af større serier af MSI tumorer analyseret ved hjælp af kromosom komparativ genomisk hybridisering (CGH) eller matrix-baserede CGH (aCGH) har rapporteret, at gevinster kromosomer og /eller kromosom arme udgør de hyppigere kromosom ubalancer i MSI CRC’er [4], [ ,,,0],6] – [8]. Men i en række papirer, MSI og CIN anses at være overvejende gensidigt udelukker hinanden. Det er værd at bemærke, at i disse papirer, er CIN foretaget via LOH analyse. Faktisk siden begyndelsen undersøgelse af Thibodeau [14], adskillige rapporter demonstrerede, at LOH begivenheder sjældent blev fundet i MSI CRCs ([15] – [18] for eksempel). Af interesse, cytogenetik er en morfologisk tilgang egnet til påvisning af både kromosomale gevinster og tab, der er forbundet med CIN. Ved hjælp af denne metode, rapporterer vi her meste kromosomale gevinster og kun få kromosomale tab i MSI CRC’er, og konkluderer, at sådanne tumorer er faktisk CIN + i de fleste tilfælde (65%). Det kan derfor antages, at de modstridende resultater, der er opnået efter brug af LOH analyse vil sandsynligvis kunne tilskrives, i det mindste delvist, til en unøjagtig vurdering af CIN i disse studier. En større serie af MSI CRC’er bør nu blive analyseret med henblik på at præcis de hyppigste kromosomale gevinster observeret i disse tumorer. Dog bør ikke tages sameksistensen af ​​CIN og MSI som normen, især da af 20 MSI tumorer i vores serie, 7 (35%) udviste en strengt normal karyotype.

Omvendt til MSI CRC’er der præsenteret en normal kromosom komplement eller hovedsageligt med kromosom gevinster blev kombinationer af de to kromosomale veje beskrevet ovenfor (kromosomale og -tab) findes i MSS CRCs. Endelig fandt vi en delmængde af nær-diploide MSS tumorer, der er mikrosatellit og kromosomal stabil i overensstemmelse med tidligere rapporter [4], [5], [16], [19] – [22]. Under hensyntagen til, at 3 supplerende tumorer med normal karyotype var af ukendt mikrosatellit status, kunne man forvente, at en sådan delmængde af tumorer ville hverken MSI eller CIN udgør kun en mindre del af næsten diploide CRCs dvs. 3 (3/96) til 6 % (6/96) og således måske mindre end 3% af alle CRCs. Selvom 13 ud af 96 tumorer i vores serie ikke vise kromosomal ustabilitet, er det fortsat at blive bekræftet, om de er forbundet med LOH gennem kryptiske mekanismer såsom uniparental disomi eller mitotisk rekombination.

CIN synes således at spille en rolle i både MSI og MSS kolorektale tumorer, men alternative mønstre af kromosomale hændelser kan selekteres for i nær-diploid CRCs ifølge tilstedeværelsen eller fraværet af MSI. På trods af disse observationer, ukontrollerede hierarkisk klyngeanalyse udført i vores serie var ikke i stand til at adskille tumorer på grundlag af kromosomale ændringer. Denne uoverensstemmelse med de resultater rapporteret af Trautmann et al. [7] kan skyldes et mindre antal tumorer i deres undersøgelse (46 tilfælde) og det faktum, at disse forfattere ikke teste tillid deres klynge analyseresultater. Det er i overensstemmelse med konstateringen af ​​nogen specifikke ændringer til MSI tumorer, de mest tilbagevendende gevinster i MSI tumorer bliver også observeret i MSS tumorer.

Spørgsmålet om de biologiske konsekvenser af de ikke-tilfældige ubalancer observeret i kolorektale karcinomer er stadig debatteret. Det anses generelt, at kromosomale tab giver en forbedret sandsynlighed for at inaktivere tumorsuppressorgener. De nuværende modeller for tumorigenese generelt ikke omfatte en mulig rolle for kromosom gevinster. Mere generelt kan kromosomal ustabilitet tilvejebringe en vækstfordel til cancercellen ved at forårsage omfattende ændringer i genekspression via øget celleproliferation eller nedsat celledød. Men på grund af transkriptionel regulering, kan forholdet mellem DNA kopital ændringer og forstyrrelser i genekspression være mere kompleks end et simpelt dosering virkning. Interessant Tsafrir et al. [23] for nylig vist, at ekspressionen af ​​store grupper af sammenhængende gener i MSS kolorektale karcinomer varierer på en koordineret måde og afspejler gevinst eller tab af den tilsvarende kromosomale segment. Baseret på de forskelle, vi observerede mellem MSS og MSI tumorer, blev en formodet model for carcinogenese foreslået. Det kan antages, at i MSS nær-diploide tumorer, kombination af vejen af ​​kromosom gevinster med den af ​​kromosomale tab er nødvendigt at målrette både onkogener surexpression og tumorsuppressorgener inaktivering, hvorimod i MSI tumorer, de observerede gevinster kromosomer sandsynlige resultat i en forøget ekspression af formodede onkogener, der ville være komplementær til tab af funktion rammeskift mutationsbegivenheder der påvirker tumorsuppressorgener indeholdende kodende gentagelsessekvenser (figur 4).

i MSS tumorer, kombination af vejen af ​​kromosom gevinster med den for kromosomale tab er nødvendig for at målrette begge onkogener (ONC) og tumorsuppressorgener (GTS), hhv. I MSI tumorer, er vejen af ​​kromosom gevinster hyppigt observeret mens der af kromosomale tab findes sjældent. I disse tumorer er dog tab af funktion begivenheder ofte observeres som følge af rammeskift mutationer i kodning mikrosatellitmarkørerne sekvenser. MSG, missegregation; SR, strukturelle omlejringer.

Det er kendt, at MSI CRC’er bo tæt-diploid mens en delmængde af MSS CRC’er bliver polyploid, eventuelt gennem en endoreduplikation proces [24]. Som allerede nævnt, kunne polyploide CRC’er ikke inkluderet i vores analyse på grund af uklarhed til at skelne kromosomale gevinster fra tab i sådanne CRCs. Ikke desto mindre er det bemærkelsesværdigt, at vores cytogenetiske data om delmængde af nær-diploide CRC’er er efter aftale med CGH profil fra en meta-analyse omfattende en total på 859 CRC’er af alle ploidi niveauer [11]. Det skal også bemærkes, at vores undersøgelse kohorte af patienter er forudindtaget med hensyn til inddragelse af familiære tilfælde. Som anført i den supplerende tabel S1, blev 3 ud af 96 patienter med CRC’er identificeret som patienter med familiær adenomatøs polypose, så det er usandsynligt, at inklusion af disse patienter kunne have forudindtaget de samlede resultater. Da der var hverken slægtshistoriske data for patienter eller kønscellelinie mutation screening for MLH1 eller MSH2, er det sandsynligt, at nogle personer med en tidlig debut MSI CRC indskrevet i denne undersøgelse nærede arvelige ikke polypose tumorer. Selv om cytogenetiske data i forbindelse med MSI CRCs af enten tidlige (alder ≤ 50 år på tidspunktet for kirurgi) eller sen begyndelse (alder 50 år) her viste sig at være ret ens med navnlig ingen signifikant forskel med hensyn til antallet af tumorer, der viser en normal karyotype (se supplerende tabeller S1, S2 og S3), ville det være af interesse for yderligere at undersøge patienter med familiær CRC’er identificeret på grundlag af strenge kriterier.

den morfologiske tilgang, vi bruges til at analysere den kromosomale ustabilitet i nær-diploide kolorektale karcinomer fremhæver inddragelsen af ​​missegregative begivenheder, der påvirker normale kromosomer, især kromosom gevinster, i kolorektal carcinogenese. Vores arbejde er meget tyder på en involvering af aneuploidi i CRC’er gennem valg af missegregation begivenheder, der samarbejder med andre begivenheder, der genereres i disse tumorer gennem kromosomale omlejringer eller mikrosatellit ustabilitet. Yderligere undersøgelser er baseret på transkriptom og proteom tilgange er nu nødvendigt at præcis de funktionelle konsekvenser af de genomiske veje, vi har karakteriseret her, under hensyntagen til de andre molekylære karakteristika CRC’er.

Materialer og metoder

tumor prøver

data blev indsamlet i løbet af en systematisk cytogenetisk analyse af tarmkræft drives på Curie Instituttet, Paris. For nærværende undersøgelse, valgte vi næsten diploide tumorer, der er med en gennemsnitlig antal kromosomer mellem 35 og 57 i henhold til internationale kriterier [9]. Vi brugte 96 tumorer opstår fra 94 patienter, med to patienter, der har metachronous tumorer. Tre patienter præsenteret med typiske syndrom med familiær adenomatøs polypose. Fordi der var hverken slægtshistoriske data for patienter eller kønscellelinie mutation screening for MLH1 eller MSH2, kan vi ikke udelukke tilstedeværelsen af ​​arvelig non polypose colorectal cancer i vores serie af tumorer. Klinisk-patologisk karakteristika patientens alder og køn, tumor placering og Astler Coller iscenesættelse leveres i supplerende tabel S1.

Cytogenetisk analyse

Cytogenetisk analyse blev udført på friske tumorer efter operation for de fleste tilfælde eller på endoskopisk biopsier i nogle tilfælde efter vores sædvanlige protokol [12]. Mekanisk desaggregering af væv blev udført og kortvarig dyrkning i 24-48 timer blev opnået i TC 199 medium suppleret med 20% af humant serum og antibiotika. Kulturer blev høstet ved en thymidin synkroniseringsfremgangsmåde i de fleste tilfælde. Thymidin blev sat til dyrkningsmediet i en slutkoncentration på 0,3 mg /ml. Efter 17 timer blev dyrkningsmediet fjernet, cellerne blev vasket to gange og inkuberet i frisk medium i 8 timer, herunder en 3-timers behandling med colcemid. Celler blev fikseret og spredes på objektglas og analyse blev udført på karyotyped celler efter R-banding. I de fleste tumorer, blev der observeret celler med nært beslægtede unormale kromosom komplementer. Celler blev betragtet som en klon, når mindst to havde samme strukturelle aberration eller trisomi, eller mindst tre havde samme monosomi [9]. Sammenligning af kloner førte til genopbygningen af ​​det kromosomale udviklingen af ​​tumoren [25]. Kun kromosomafvigelser observeret i kloner og subkloner blev overvejet. Inddragelse af individuelle kromosomer i missegregation og rearrangementer blev scoret separat, sammen med deres resulterende kromosomale ubalancer (Supplerende tabeller S2 og S3). Detaljerede oplysninger om de strukturelle abnormiteter defineret af band eller sub-band er også (Supplerende figur S1).