PLoS ONE: Høj mangfoldighed VacA og CagA Helicobacter pylori genotyper hos patienter med og uden Gastric Cancer

Abstrakt

Baggrund

Helicobacter pylori

er associeret med kronisk gastritis, mavesår og gastrisk cancer. Formålet med denne undersøgelse var at vurdere den topografiske fordeling af

H. pylori

i maven samt

Vaca

CagA

genotyper hos patienter med og uden mavekræft.

Metode /vigtigste resultater

Tre gastriske biopsier fra forudbestemte områder, blev evalueret i 16 patienter med mavekræft og 14 patienter med dyspeptiske symptomer. Fra kræftpatienter, blev yderligere biopsi prøver fås fra tumor centre og marginer; blandt disse prøver, tilstedeværelsen af ​​

H. pylori VacA

CagA

genotyper blev evalueret. Positiv

H. pylori

var 38% og 26% i biopsier opnået fra de mavekræft og ikke-kræft grupper, henholdsvis (

s

= 0,008), og 36% i tumor sites. Hos cancerpatienter, fandt vi en privilegeret fordeling af

H. pylori

i fundus og corpus, henviser til, at ikke-cancer-gruppe, fordelingen var ensartet (

s

= 0,003). Et flertal af biopsier var samtidig

CagA

gen-positive og -negativ. Den fundus og corpus viste en højere positivitet sats for

CagA

gen i den ikke-cancer gruppe (

s

= 0,036). En blanding af

CagA

gen størrelser var også signifikant hyppigere i denne gruppe (

s

= 0,003). Ninety-to procent af alle de emner, viste mere end en

Vaca

gen genotype; S1b og m1

Vaca

genotyper blev overvejende fundet i mavekræft gruppen. Den højeste

Vaca

-genotype signal-sekvens mangfoldighed blev fundet i corpus og 5 cm fra tumor marginer.

Konklusion /Betydning

Høj

H. pylori

kolonisering mangfoldighed, sammen med

CagA

genet, blev fundet overvejende fundus og corpus af patienter med gastrisk cancer. Genotypen mangfoldighed observeret på tværs systematisk hel-organ- og tumor prøveudtagning var bemærkelsesværdigt. Vi finder, at der ikke er tilstrækkelig dokumentation for foreningen af ​​ét isolat med en specifik sygdom, på grund af den multistrain karakter af

H. pylori

infektion vist i dette arbejde

Henvisning:. López-Vidal Y, Ponce-de-León S, Castillo-Rojas G, Barreto-Zúñiga R, Torre-Delgadillo A (2008) Høj mangfoldighed

Vaca

CagA Helicobacter pylori

genotyper hos patienter med og uden Gastric Cancer. PLoS ONE 3 (12): e3849. doi: 10,1371 /journal.pone.0003849

Redaktør: Debbie Fox, The Research Institute for børn på Børnehospital New Orleans, USA

Modtaget: 12. maj 2008; Accepteret: November 10, 2008; Udgivet: December 3, 2008

Copyright: © 2008 López-Vidal et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev finansieret af tilskud DGAPA PAPIIT-IN207302 fra Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), UC-MEXUS, og CONACYT-México 47.749-M. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Helicobacter pylori

er en gastrisk patogen der inficerer næsten 50% af verdens befolkning [1]. Det anses for den vigtigste ætiologiske agens for kronisk aktiv gastritis og er generelt accepteret som den primære årsag til mavesår sygdom; det er også en kendt risikofaktor for mavekræft [2]. Gastrisk cancer udvikling har vist sig at strække sig over flere årtier, begyndende i rækkefølge med

H. pylori

infektion og udvikling af kronisk aktiv gastritis [3]. Glandulær atrofi og intestinale metaplasi vinder forekomme i en undergruppe af patienter og ender i gastrisk cancer [4].

H. pylori

infektion er blevet foreslået at føre til en øget relativ risiko (RR) -on rækkefølgen af ​​fire til ni-fold-til udvikling forstadier gastriske betingelser, især når infektion forekommer i barndommen [5]. I betragtning af at kun et mindretal af

H. pylori

inficerede individer udvikler denne sygdom, menes det, at udviklingen af ​​sygdommen er afhængig af ekspressionen af ​​specifikke bakterielle virulensgener, for eksempel

CagA

Vaca

[6] , som begge er kraftigt udtrykt uanset sygdomstilstanden hos værten [7], [8]. Foreningerne mellem gastrisk topografi, genotypiske mangfoldighed i

H. pylori VacA

CagA

gener og udvikling af mavekræft forbliver kontroversiel. Formålet med den foreliggende undersøgelse var at vurdere fordelingen af ​​

VacA

CagA Salg genotyper af

H. pylori

langs maven hos patienter med og uden mavekræft

Hypotese:. en højere frekvens af

H. pylori

er forbundet med tidlige stadier af mavekræft.

Metoder

Patienter, der er nævnt for endoskopisk undersøgelse på grund af mistanke om kræft eller dyspeptiske symptomer blev inviteret til at deltage i et tværsnit prospektiv undersøgelse . Alle patienter med cancer blev inkluderet, såvel som dem med ikke-ulcus dyspepsi og /eller gastro-esophageal reflux. Eksklusionskriterier inkluderet koagulationsabnormiteter, ikke-steroid antiinflammatorisk (NSAID) drug indtagelse inden for de sidste 72 timer, portal hypertension, og tilstedeværelsen af ​​lymfom i den histologiske undersøgelse.

Alle patienter underskrev en skriftligt informeret samtykkeformular før deltagelse i undersøgelsen. Undersøgelsen protokol Den blev godkendt af Institutional Review Board af Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán (INCMNSZ), registreringsnummer CIBH-1081.

Øvre gastrointestinal endoskopi blev udført i overensstemmelse med en standard teknik. En systematisk ordning biopsi-sampling blev anvendt som følger: fra hver patient blev tre gastriske biopsier opnået fra hver af de fire mave sites (antrum, kantet del, korpus, og fundus). Fra patienter med mavekræft, blev yderligere biopsi prøver opnået fra centrum og margin af tumoren og i en afstand på mindst 2-5 cm fra tumoren margenerne.

Alle patologiske prøver fra patienter med mavekræft blev evalueret af en enkelt erfaren patolog og klassificeret i henhold til Lauren klassificering som diffus, tarm eller blandet type [9]. Beskrivelsen af ​​fremskreden mavekræft var baseret på BORRMANN klassifikationen [10]. Morfologiske tidlige gastrisk kræft sub-typer blev klassificeret i henhold til japansk Endoskopi Society retningslinjer [11], [12].

H. pylori

blev dyrket ved udtværing biopsiprøver på overfladen af ​​hesteblod-agarplader (10% hesteblod i CASMAN agarbase [BBL Microbiology Systems, Cockeysville, MD, USA]) [8].

Kromosomale DNA blev ekstraheret [13], og den

H. pylori 16S rRNA

CagA

genet blev PCR-amplificeret som tidligere beskrevet [7].

Vaca

signal sekvens og mid-region blev indtastet ved allel typespecifik PCR, som tidligere beskrevet af Morales

et al.

[8].

CagA

variabel region genamplifikation.

CagA

3 ‘gentagne regioner af

H. pylori

stammer undersøgt i denne undersøgelse, blev klassificeret i henhold til deres længde (på grund af tilstedeværelsen af ​​et variabelt antal gentagelsessekvenser i 3′-området af genet). Amplifikationsprodukterne opnåede blev kategoriseret efter størrelse i en af ​​tre grupper: korte (906 bp); medium (1.008 bp), og lang (1,110 bp), ifølge Karita

et al

. [14]. Amplifikation blev udført under anvendelse af primere cagRV17-F 5′-acc ctg gtc GGT AAT GGA TTA TCT-3 ‘og cag22-R 5′-TTA aga ttt ttg gaa acc acc ttt t-3’, som blev designet baseret på sekvenserne hentet fra Genbank hjælp Alig (videnskabelig og uddannelsesmæssig software) og ClustalW (BCM Søg Launcher, flere sekvensopstillinger).

data blev analyseret til beskrivende formål at udnytte relative frekvenser og aritmetiske midler (standardafvigelse [SD]), som anses for passende. Sammenligninger mellem grupper blev udført ved χ

2 analyse, samt med Fisher-Freeman-Halton eksakte test for kontingenstabeller. Den gastrisk cancer gruppe blev sammenlignet med patienter med ikke-ulcus dyspepsi og /eller gastroøsofageal refluks. Kræftpatienter blev stratificeret så tidligt for TNM stadie 0, I, eller II og avancerede til III eller IV. Alfa blev sat til 0,05. I betragtning af at flere samtidige sammenligninger blev udført, blev en nominel alfa-værdi korrektion indført efter Bonferroni procedure. Derfor har vi betragtet foreninger med

s

værdier mellem 0,05 og 0,01 som mistænkte. I modsætning hertil resulterer i

s

≤0.0063 niveau blev anset for rimeligt markant. Værdier mellem 0,01 og 0,0063 blev betragtet som marginal. Alle analyser blev udført ved hjælp af Stata statistisk software (intercooler Stata 7.0 til Windows 98/95 /NT-pakke, 2002) og Stat-Xact (v. 4.0.1., Cytel Software Corp., 1999).

Resultater

Toogtredive patienter blev inkluderet i denne undersøgelse. Baseret på endoskopisk diagnose, blev 18 klassificeret i gastrisk cancer gruppen og 14 i det ikke-cancer-gruppe. På grund af histologiske tegn på gastrisk lymfom imidlertid to patienter i mavekræft gruppen havde udelukkes, forlader 16 mennesker i denne gruppe. Gennemsnitsalderen for patienterne i mavekræft og dyspeptiske grupper var 57,6 ± 16,7 år (56% mandlige) og 47,2 ± 13,3 år (14% mandlige), hhv. Ti patienter (63%) udviste en diffus tumor ifølge Lauren klassificering. Fem patienter havde tidlige mavekræft (type I, tre; II een; IIB, en) og 11 havde fremskreden mavekræft (type IIIA, fire; IIIB, tre; IV, fire), ifølge den japanske Research Society for mavecancer retningslinjer og BORRMANN klassifikationen.

i vores 411 biopsiprøver,

H. pylori

blev identificeret ved enten kultur eller PCR i 38% (78/203) af biopsi prøver fra mavekræft gruppen, 26% (54/208) af de ikke-cancer gruppe (

s

= 0,008), og 36% (40/110) af tumor sites (se tabel 1 og 2).

H. pylori

viste en differentieret topografisk fordeling hos patienter med mavekræft, med en højere positivitet sats i fundus og corpus (

s

= 0,003), tabel 1. Den ikke-cancer gruppe viste ingen differential topografiske fordeling . En noget højere positivitet af

H. pylori

blev fundet i tumor websteder ved kultur eller ved tumor marginer ved PCR; Men disse stigninger i positivitet var ikke statistisk signifikante (tabel 2). Der var ingen signifikant sammenhæng mellem den

H. pylori

positivitet sats og TNM kræft stadie (tidligt vs. sent).

Vi fandt

H. pylori-CagA

positivitet i 72% af mavens prøver fra mavekræft gruppen, 73% af den ikke-cancer gruppe (

s

= NS) (tabel 3), og 83% af tumoren sites (

s

= ikke signifikant [NS]).

H. pylori-CagA

topografisk fordeling var ikke statistisk signifikant i mavekræft-gruppe, mens de ikke-cancer gruppe demonstrerede en højere positivitet sats i fundus og corpus; Men betydningen af ​​dette fund er tvivlsom (

s

= 0,036) (tabel 3). Igen i tumor sites, fandt vi ingen signifikant fordeling mønster for

CagA

positivitet fraktion, heller ikke var der en forskel mellem patienter med tidlig og fremskreden mavekræft.

Eighty- en

H. pylori

stammer blev undersøgt (80

CagA

+), herunder 46 stammer fra patienter med mavekræft og 35 fra patienter uden kræft. Kun to

CagA

gen størrelser blev opnået fra 80

H. pylori

stammer undersøgt; ingen af ​​de længere

CagA

sekvenser blev fundet. I begge grupper, den kortere

CagA

var den hyppigst opdaget. Resultaterne er sammenfattet i tabel 4. Det er interessant, både

CagA

størrelser blev amplificeret fra 12 (15%) stammer, hvilket tyder på, at disse patienter var samtidig inficeret med flere

H. pylori

stammer. Dette resultat blev opnået oftere i den ikke-kræftpatient gruppe (28,6%) end i mavekræft gruppen (4,4%) (

s

= 0,003).

Den fremherskende signal sekvens genotype hos patienter med mavekræft, der er til stede i 39% af gruppen, var S1b. Den S1b /s2 kombinationen var til stede i 20% af gruppen og s2 var til stede i 12%. Seksten procent af patienter med gastrisk cancer havde en uidentificerbare signalsekvens (s0). Der var ingen statistisk signifikant fordeling af

Vaca

genotyper tværs maven (

s

= NS) (se figur 1). Den hyppigste

Vaca

genotype i den ikke-cancer gruppe var S1b, som var til stede i 59% af gruppen, efterfulgt af S1A /S1b kombination i 11%, S1A /S1b /s2 i 7%, og en uidentificerbare signalsekvens i 9% (

s

= 0,06), figur 1. Analyse af topografiske genotypefordelingen viste, at genotype S1b af

VacA

var fremherskende i alle zoner (fundus, corpus , kantet del og antrum) af maven i begge grupper undersøgt (fig S1). Vi fandt en tydelig og marginalt signifikant forskel i spredningsmønstre for disse genotyper mellem kræft og ikke-kræft grupper (

s

= 0,01). Både corpus og fundus af mavens kræft gruppen udviste en større mangfoldighed af signal-sekvens genotyper, som gjorde corpus i den ikke-cancer gruppe (figur S1).

Den hyppigste

VacA

genotyper for hver af tumor sites (center og margin af tumoren, og mindst 2-5 cm fra randen af ​​tumoren) var S1b og S2, som var til stede i 19%; S1A /S1b og S1b /s2 blev hver stede i 17%, og S1A /S1b /2, S1A /s2, og s0 var til stede i 8%. Der var ingen signifikant sammenhæng mellem genotypen og tumorstedet nærhed (figur 2). Fordelingen af ​​denne genotype i tumor og anatomiske steder i patienter med kræft var ikke statistisk signifikant (

s

= 0,06) (figur 1 og 2). En signifikant sammenhæng (

s

= 0,02) mellem genotype og tumor fase blev identificeret: S1A /S1b, S1A /S1b /s2, og S1B /s2 genotyper var fremherskende i den tidlige gastrisk kræft gruppe, mens S1b, s2 , og S1A /s2 genotyper var relativt rigelige i fremskreden mavekræft gruppe (figur 3).

den hyppigste midt-region genotype hos patienter med mavekræft var m1, som var til stede i 44% af patienterne, efterfulgt af m0 (untypeable genotype) i 26%, m2 i 21%, og m1 /m2 kombination i 10% (figur 1). I den ikke-cancer-gruppe, den hyppigste

Vaca

genotype var m1, som var til stede i 52% af patienterne, efterfulgt af m0 i 32%, m1 /m2 kombination 11%, og m2 5%; der var en særskilt fordeling mønster for disse genotyper, med et tvivlsomt signifikansniveau (

s

= 0,03) (Figur 1). Analyse af topografiske fordeling tværs anatomiske zoner af midterområdet genotype viste, at m1 genotypen var overvejende (50%) i den kantede del, med den resterende i fundus (48%) og corpus (42%). Den m0 genotype var overvejende antrum (39%) i gastrisk cancer gruppen (fig S1). I den ikke-cancer gruppe, m1 genotypen var mest forekommende i fundus (77%); 56% var i corpus, og 43% var i antrum. Den m0 genotype blev påvist i den vinkelmæssige del (62%), med ingen statistisk signifikant forskel mellem studiegrupper (Figur S1). En næsten ensartet fordeling af de forskellige genotyper blev fundet i tumorstederne, (figur 2). Der var ingen forskel mellem anatomiske zoner og tumor-sites i patienter med gastrisk cancer (figur 1 og 2) eller mellem tidlige og fremskredne tumorer (figur 3).

Tabel 5 viser analysen af ​​den særskilte

VacA Salg genotyper fundet inden for de enkelte, for hvem mere end en biopsi blev undersøgt. Ninety-to procent (12/13) af patienterne cancerpatienter havde mere end én genotype stede. En lignende fund blev observeret i den ikke-cancer gruppe. Tre personer i den ikke-cancer gruppe var konsekvent positiv for

CagA

gen, og en anden tre besad begge typer (positive og negative) på samme tid. I kræft gruppen, seks personer var positive for

CagA

og syv for begge typer. Ingen patienter var konsekvent negative for dette gen. Figur 4 viser antallet af biopsier pr individuelt, og antallet af distinkte

Vaca

gen signal segment (SS) genotyper. Det laveste antal genotyper hos patienter med 10 eller flere biopsier var to, og den højeste var fem

Diskussion

Den foreliggende undersøgelse resulterede i fire store resultater:. Først ,

H. pylori

er ensartet fordelt over maven hos patienter med kun dyspeptiske symptomer; sekund,

H. pylori

har en præference for fundus og corpus hos patienter med gastrisk cancer; tredje, hos patienter med dyspeptiske symptomer,

H. pylori-CagA

har en privilegeret fordeling i fundus og corpus og der er en høj frekvens af blandet

CagA

størrelser; fjerde, den S1b genotypen var fremherskende i begge studiegrupper, og S1A genotypen var kun til stede i den dyspeptiske gruppe.

Den høje

H. pylori

positivitet i fundus af patienter med gastrisk cancer kan have været på grund af dets nærhed til corpus, en zone, der koloniseret i

H. pylori

-induceret gastritis. Corpus-domineret atrofi, eller tabet af specialiserede glandulær celletyper såsom parietal og vigtigste celler, synes at være kritisk for cancer progression [15], og det er sandsynligt, at fundus er involveret enten før eller efter corpus er allerede optaget i kræft.

En relativ høj positivitet for

H. pylori

blev fundet ved tumor-site trods tidligere udsagn, der

H. pylori

kan ikke udvikle sig i forkrøblede slimhinde, og at den intestinale metaplasi er en ugunstig miljø [16]. Tang

et al.

Imidlertid foreslået, at

H. pylori

kunne overleve i det gastriske epitel i nærvær af en kræftfremkaldende læsion [17]. Det er også blevet spekuleret, at visse virulensfaktorer kan spille vigtige roller i de vedvarende

H. pylori

i maveslimhinden [18].

I den foreliggende undersøgelse, vi observeret, at

H. pylori

demonstrerer lignende kolonisering af de anatomiske regioner i maven og tumorstedet.

H. pylori

positivitet i tidlige og avancerede mavekræft grupper viste sig også at være meget ens; Tang

et al

. Dog observeret de inverse resultater [17]. Vi mener, at den observerede mellem disse to undersøgelser forskel skyldes antallet af biopsier undersøgt i hver patient; Vi viste, at systematisk prøvetagning modificerer sammenslutning af

H. pylori

med sygdom.

En højere forekomst af

H. pylori CagA

gen-positivitet blev fundet i corpus og fundus af patienter med dyspepsi. Tidligere Semino-Mora

et al

. viste, at dette mønster ikke er til stede hos patienter med mavekræft [19], selv om vi brugte en anden

CagA

forstærkning fragment i det foreliggende arbejde. Gastric neoplastisk transformation induceres og opretholdes, i det mindste delvist, af

in vivo

intracellulær

CagA

udtryk; denne effekt kunne spille en rolle, ikke blot i den tidlige gastrisk carcinogenese men baseret på vores data, kan også forekomme senere i denne proces [19]. Vi observerede, at 15% af stammerne besad en blanding af

CagA

3 ‘gentage region størrelser, hvilket tyder på tilstedeværelsen af ​​co-infektion med flere

H. pylori

stammer, primært i den ikke-cancer gruppe. Kidd

et al

opnået forskellige resultater.; mens disse forfattere studeret et højere antal patienter [20], studerede vi et højere antal af gastrisk biopsier af som omfattede flere specifikke steder i maven.

Vi har tidligere observeret tilstedeværelsen af ​​genotypiske mangfoldighed i mavesår corpus [8]. Denne mangfoldighed er blevet foreslået for at afspejle de synergistiske handlinger, der er forbundet med denne proces [21]. Den fremherskende

Vaca

genotype signal sekvens påvist i begge studiegrupper var S1b efter aftale med vores tidligere rapport [22].

De vigtigste resultater af vores undersøgelse er, at der er en topografisk fordeling af

Vaca

signal-sekvens, den S1b genotypen er ofte forbundet med den ikke-cancer gruppen og /s2 kombinationen S1b eller s2 genotyper findes udelukkende i mavekræft gruppen. Ingen tidligere undersøgelser af personer med mavekræft har overvejet de fire tumor zoner evalueret i nærværende arbejde. Den S1c genotype blev fundet at være den mest udbredte genotype i Asien; imidlertid dets associering med mavekræft aftagende [22], [23]. Mangfoldigheden af ​​

Vaca

genotype af

H. pylori

er blevet forklaret med en co-evolution model [21].

Med hensyn

Vaca

mid-region alleler, fandt vi M1 og M2 genotyper, i begge undersøgte grupper, med m1 genotype er den mest hyppige i de forudbestemte områder af den evaluerede mave [8].

i begge studerede grupper, fandt vi

H. pylori

stammer, der var untypeable for signal-sekvens og mid-region alleler på grund af betydelig variation i

Vaca

gen [8], [24]. Vi konsekvent fandt, at

CagA

– og

Vaca

-allele mangfoldighed var større i tumoren, hvilket tyder på, at

H. pylori

kan forblive i tumoren uden miljøbelastning.

genotypiske mangfoldighed observeret på tværs af systematiske hele organer og tumorer i det foreliggende arbejde var bemærkelsesværdigt. Den væsentligste praktiske betydning af dette fund er behovet for at søge efter en lignende udtømmende ordning prøvetagning for at knytte en patogenicitet faktor med sygdom. Vi fandt, at foreningen af ​​et enkelt isolat-afledt fra en enkelt biopsi-med sygdommen ikke er tilstrækkelig på grund af den multistrain karakter

H. pylori

infektion påvist i det foreliggende arbejde.

Begrænsningerne af denne undersøgelse er relateret til dets observationelle natur og dens tværsnit design. Vi kan ikke udelukke, at der er en confounding variabel er forbundet både med tilstedeværelsen af ​​den

Helicobacter pylori

infektion og kræft eller dyspeptiske status. Desuden manglen på en langsgående opfølgning forhindrer os bekræfter den sekventielle udseende af de begivenheder, som udvikling af cancer og den indledende infektion med stamme (r) af

Helicobacter pylori

der blev til sidst påvist.

interessekonflikter erklæring

forfatterne erklærer nogen interessekonflikter.

Støtte oplysninger

figur S1. .

Topografisk signal sekvens og midterste region allel fordeling af Vaca genet hos patienter med og uden mavekræft

doi: 10,1371 /journal.pone.0003849.s001

(3,81 MB TIF)

tak

Vi takker Rosa Isabel Amieva-Fernández, Ana Karina Martínez-Díaz, Leonor Jacobo-Albavera, og Fernando Vargas-Romero for fremragende faglig bistand med DNA-amplifikation.