PLoS ONE: Hæmning af non-homolog End Sammenføjning Reparation Forringer kræft i bugspytkirtlen Vækst og Forbedrer Radiation Response

Abstrakt

Pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC) er blandt de mest dødelige menneskelige kræftformer, på grund af sin sene diagnose samt som dens intense modstand mod tiden tilgængelige terapeutiske midler. For at identificere mekanismer, hvorfor PDAC er refraktære over for DNA ødelæggende cytotoksisk kemoterapi og strålebehandling, vi udførte en global forhør af DNA skade responset af PDAC. Vi finder, at PDAC celler generelt nærer høje niveauer af spontan DNA-skader. Inhibering af non-homolog End Sammenføjning (NHEJ) reparere enten farmakologisk eller ved RNAi resulterede i en yderligere akkumulering af DNA-skade, hæmning af vækst, og i sidste ende apoptose selv i fravær af exogent DNA-beskadigende midler. Som reaktion på stråling, PDAC celler afhængige NHEJ pathway til hurtigt reparere DNA dobbelt-strengbrud. Mekanistisk, når NHEJ inhiberes der en kompensatorisk stigning i homolog rekombination (HR). På trods af denne opregulering af HR, DNA skader fortsætter, og celler er betydeligt mere følsomme over for stråling. Tilsammen udgør disse resultater støtter inkorporeringen af ​​NHEJ hæmning i PDAC terapeutiske tilgange, enten alene eller i kombination med DNA skadelige behandlingsformer såsom stråling

Henvisning:. Li YH, Wang X, Pan Y, Lee DH, Chowdhury D, Kimmelman AC (2012) Hæmning af non-homolog End Sammenføjning Reparation Forringer kræft i bugspytkirtlen vækst og Forbedrer Stråling svar. PLoS ONE 7 (6): e39588. doi: 10,1371 /journal.pone.0039588

Redaktør: Guenter Schneider, Technische Universität München, Tyskland

Modtaget: Januar 16, 2012; Accepteret: 25. maj 2012; Udgivet: 18 juni, 2012 |

Copyright: © 2012 Li et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. ACK er støttet af National Cancer Institute Grant R01CA157490, Kimmel Scholar Award, og AACR-PanCAN Career Development Award. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Ingen yderligere ekstern finansiering blev modtaget til denne undersøgelse

Konkurrerende interesser:. ACK er en konsulent for Forma Therapeutics og Dainippon Pharma. Han har modtaget forskningsmidler fra Karyopharm terapi for en uafhængig projekt, og har modtaget en talende honorar fra Pfizer. Der er ingen patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke vores tilslutning til alle de PLoS ONE politikker om datadeling og materialer, som beskrevet online i vejledningen for forfattere.

Introduktion

Pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC) er fortsat den fjerde førende årsag til kræft dødelighed i USA [1], og er kendetegnet ved en intens resistens mod kemoterapi og ioniserende stråling (IR). På grund af dette, vil størstedelen af ​​patienterne bukke under for deres sygdom i mindre end et år, og er klart behov for nye behandlingsmetoder. Genomisk ustabilitet er et af kendetegnene for kræft [2] og i overensstemmelse med dette har vi og andre har vist, at pancreascancer vise ekstremt høje niveauer af genomiske ændringer [3]. Endvidere pancreascancer er dybt resistente over for DNA-beskadigende behandlinger såsom cytotoksisk kemoterapi og stråling [4]. Men den biologiske betydning af genomisk ustabilitet i denne sygdom, og hvordan dette kan påvirke respons på DNA ødelæggende behandlinger er relativt uudforsket.

Double strandede pauser (DSBs), fremkaldt af stråling eller andre DNA-ødelæggende midler, menes at være de mest farlige DNA-læsioner, der truer cellulære overlevelse. Som reaktion på ioniserende stråling, er DSB’er detekteret af Mre11-RAD50-Nbs1 kompleks (MRN kompleks) og Ku70 /Ku80-komplekser, som hurtigt aktiverer ataksi telangiectasia muteret (ATM) og DNA-PK henholdsvis [5]. Aktivering af disse kinaser inducerer en række cellulære begivenheder, herunder phosphorylering af cellecyklus checkpoint proteiner og indledningen af ​​DNA reparationsprocessen. Histon H2AX, et vigtigt substrat af ATM og DNA-PK, er phosphoryleret på serin 139 (benævnt γH2AX), som danner foci på DSB sites forbundet med andre reparationsfaktorer [6].

To store veje eksisterer at reparere DSBs -homologous rekombination (HR) og ikke-homolog endesammenbinding (NHEJ) [7], [8]. HR-dirigeret reparation kræver en homologe kromosomer eller et søsterkromatid som en skabelon til at reparere DNA med high fidelity, og derfor er det primært forekommer i S- og G2- faser af cellecyklussen, når skabelonen er tilgængelig. I modsætning til HR, NHEJ reparationer DSB ved ligering af to DNA ender efter DNA ende behandling. Enden behandling fører ofte til tab af nukleotider og gør NHEJ fejlbehæftede [9]. NHEJ er aktiv i hele cellecyklus. Derfor cellecyklus scenen og karakteren af ​​DNA ender er to determinanter for reparation valg mellem HR og NHEJ [7], [10]. Derudover har DNA-PK-aktivitet selv været impliceret i inhibering af HR [11], [12]. Vigtigere, cancerceller ofte vise abnormiteter i DNA beskadigelse respons og mangler i DNA-reparation, der kan korrelere med ændret ekspression af reparation proteiner. For eksempel højere ekspression af NHEJ-proteiner, DNA-PK og Ku70 /80 er blevet rapporteret i cancercellelinier [13], [14], [15], [16] Imidlertid DNA beskadigelse respons og DNA-reparation i PDAC celler fortsat relativt uudforsket.

Her undersøgte vi betydningen af ​​DNA-reparation i PDAC biologi og opdager, at PDAC celler harbor forhøjede niveauer af basal DNA-skader. Inhibering af NHEJ resulterer i forøget DNA-beskadigelse og i sidste ende nedsat proliferation. Som svar på NHEJ inhibering, er HR opreguleret men cellerne er i stand til at reparere DNA-skader effektivt som respons på stråling. Dette resulterer i øget stråling følsomhed som vist ved faldet klonogene overlevelse. Vores data implicerer NHEJ hæmning som en potentiel terapeutisk tilgang i PDAC.

Resultater

Basal DNA-skader i PDAC

I et forsøg på at forstå, hvorfor PDAC er dybt resistente over for DNA skade behandlingsformer såsom cytotoksisk kemoterapi og strålebehandling, foretog vi en indsats for at forstå den DNA beskadigelse respons og DNA-reparation i disse tumorer. Som et første skridt blev basale niveauer af DNA beskadigelse undersøges i en samling af 18 PDAC cellelinier såvel som en ikke-transformeret immortaliseret human pancreas ductal cellelinje (HDPE) [17] som en kontrol. Western blot-analyse for γH2AX, et meget anvendt markør for DNA-skader, især DNA dobbelt streng pauser (DSBs) [18], [19] blev udført. Slående, mere end halvdelen af ​​PDAC cellelinjer viste forhøjede niveauer af γH2AX (figur 1A og 1B) sammenlignet med HDPE. For at bekræfte, at de forhøjede niveauer af γH2AX var ikke alene på grund af øget samlede histoner, vi normaliseret niveauerne af γH2AX til den samlede H2AX i udvalgte cellelinjer (data ikke vist) og viste, at disse linjer fortsatte med at have forhøjede γH2AX forhold til HDPE celler. Som yderligere bevis på den forhøjede DNA-skader i PDAC blev γH2AX immunfluorescens udført i repræsentative PDAC cellelinjer. Disse analyser var stort set i overensstemmelse med Western Blot data, med foci i PDAC linier typisk er højere end i HPDE (figur 1C og 1D). Til direkte at måle DNA-skader, blev neutrale comet assays udført for at vurdere mængden af ​​dobbelt-strenget pauser under basale betingelser. Igen i overensstemmelse med de γH2AX data, fire af de fem PDAC cellelinier analyseret viste statistisk højere hale øjeblikke end i HDPE (figur 1E), hvilket indikerer øget DSB’er. Taget sammen indikerer disse data, at PDAC celler ofte besidder forhøjede basale niveauer for DNA-skader, som kan resultere i aktivering af en DNA-skader reaktion.

(A) Western blot-analyse af γH2AX i HDPE og 18 PDAC cellelinier. Prøver fra 8988T og Panc1 bestrålet ved 4Gy blev anvendt som positive kontroller og actin tjente som lastning kontrol. Eksperimenter blev udført mindst tre gange. (B) Kvantificering af γH2AX udtryk ved densitometri blev normaliseret til actin udtryk og præsenteres som i forhold til HDPE. Data vises fra tre uafhængige forsøg med fejlsøjler repræsenterer standardafvigelser. (C) immunofluorescens for basal γH2AX foci i tre repræsentative cellelinier (HDPE, 8988T og HPAC). Grøn: γH2AX; Blå: DAPI (kerne). Scale bar lig 10 um. Kvantificering blev udført i (D) og vist som procentdelen af ​​celler med mere end 5 foci. Eksperimenter blev udført tre gange, og de gennemsnitlige værdier blev beregnet. Fejl- søjler repræsenterer standardafvigelse fra tre individuelle eksperimenter. (E) Neutral komet assay blev udført på en direkte vurdering DNA dobbelt-strengbrud og dataene udtrykkes som hale øjeblik (Tail øjeblik = hale længde ×% af DNA i halen). For alle paneler, asterisk viser en statistisk signifikant stigning i forhold til HDPE af t-test (p ≤ 0,05).

DNA Reparation veje i PDAC

De to store DNA reparation veje for dobbeltstrengsbrud reparation er homolog rekombination (HR) og ikke-homolog ende sammenføjning reparation. HR reparation kræver en homologe kromosomer eller et søsterkromatid som skabelon og hovedsagelig foregår i S eller G2 fase af cellecyklus til præcist at reparere beskadigede DNA [7]. NHEJ imidlertid reparationer DNA ved direkte ligering af DNA-ender efter udgangen forarbejdning der ofte indfører tab af nukleotider og gør NHEJ fejlbehæftede [9]. I betragtning af de forhøjede basale niveauer af DNA-skader i PDAC, vurderede vi den færdighed af disse celler til HR og NHEJ. At måle den relative mængde af HR, udførte vi immunfluorescens for RAD51, en kritisk HR protein, som binder til enkeltstrengede DNA-overhæng og katalyserer processen med DNA-strengen udveksling. Dannelsen af ​​RAD51 foci er en følsom og specifik indikator for HR [20], [21]. Basale niveauer af RAD51 foci var lave i 8988T PDAC celler såvel som i Æske med HDPE-celler (fig 2A). Mens Æske med HDPE celler viste en markant stigning i RAD51 foci med stigende doser af stråling, viste 8988T celler en signifikant lavere stigning i foci selv ved 5 Gy stråling (figur 2A). I betragtning af de minimale niveauer af HR ses i denne PDAC linje, vi spekulerede at disse celler kan især afhænge NHEJ til reparation. For at vurdere NHEJ, vi udnyttet en velkarakteriseret luciferase-baserede plasmid reparation assay [22], [23]. Kort fortalt er et snit luciferase plasmid (pGL2) transficeret i celler og reparation via NHEJ måles ved relativ luciferaseaktivitet. Både 8988T og Panc1 PDAC linjer demonstrerede færdigheder i NHEJ som vist i figur 2B.

(A) HR som reaktion på stigende doser af stråling (0, 2 og 5 Gy) blev målt ved RAD51 foci dannelse og udtrykte som gennemsnit foci per celle. Foci øges i Æske med HDPE-celler med stigende doser af stråling, mens der kun minimalt ændret i 8988T celler. Data er fra to uafhængige forsøg udført med replikat dækglas med fejlsøjler repræsenterer standardafvigelser. Stjerner viser en statistisk signifikant forskel ved t-test (p ≤ 0,05). Repræsentative billeder er vist nedenfor. (B) NHEJ målt med et plasmid luciferase reparation assay. Data er normaliseret til transfektion effektivitet og derefter til uklippet luciferase. Både Panc1 og 8988T celler viser mærkbar NHEJ reparation. Knockdown af Ku80 markant nedsat NHEJ i Panc1 celler. Fejl søjler repræsenterer standardafvigelser for tre uafhængige forsøg.

DNA-PK er nødvendig for PDAC vækst

I betragtning af resultaterne fra DSB reparation analyser, vi næste spurgt, om PDAC celler er afhængige af NHEJ for normal proliferation og vækst. Vi fokuserede på inhibering af DNA-PK, som består af Ku70 /Ku80 heterodimert protein og den katalytiske underenhed, DNAPKcs, og er afgørende for NHEJ [24]. Brug shRNAs, undertrykt vi udtryk for de regulatoriske subunits af DNA-PK, Ku70 og Ku80 i 8988T celler. Både shRNAs produceret en robust reduktion af ekspressionen af ​​Ku70 eller Ku80 i 8988T celler, som blev påvist ved QRT-PCR for Ku70 og Ku80 og ved Western blot for Ku70 (figur 3A). Udtømning af Ku70 eller Ku80 inhiberede signifikant forankringsuafhængig vækst af 8988T som vurderet ved softagar assays samt spredning af vækstkurve assay (figur 3B og 3C). Undertrykkelse af Ku70 eller Ku80 faldt også væksten i yderligere to PDAC cellelinjer, HupT3 og BXPC3 (figur 3C). I modsætning til PDAC, udtømning af Ku70 eller Ku80 i HDPE, MCF7 (en brystcancer-cellelinie) eller H460 (a lungecancer-cellelinie) viste mere beskeden effekt på proliferation (figur 3C). Disse data antyder, at PDAC celler kræver Ku70, Ku80 for vækst. For yderligere at analysere kravet om NHEJ at opretholde PDAC vækst, en farmakologisk DNA-PK-inhibitor, NU7026 [25], [26], blev anvendt til at undersøge inddragelsen af ​​DNA-PK i PDAC vækst. NU7026 behandling nedsatte signifikant forankringsuafhængig vækst af PDAC celler, medens væksten af ​​H460 og MCF7 ikke blev påvirket, selv ved de højeste doser (20 uM) (figur 4A). Desuden har vi bestemt sensitivitet blandt en samling af PDAC linjer til NU7026 ved at bestemme IC50’er (Fig 4C). Mere end halvdelen af ​​linjerne var følsomme over for DNA-PK-inhibering. NU7026 faldt også klonogen overlevelse 8988T PDAC celler (figur 4B). Sammen de data understøtter, at PDAC celler afhængige NHEJ DNA-reparation til vækst under basale betingelser.

(A) Undertrykkelse af Ku70 eller Ku80 udtryk i 8988T celler ved shRNAs detekteret af kvantitativ real-time PCR (til venstre) og western blot (til højre). (B) Overpanel: repræsentative billeder af blød agar koloni dannelse af 8988T celler inficeret med enten en kontrol shRNA til GFP eller to forskellige shRNAs til Ku70 eller Ku80 hhv. Nedre panel: kvantificering af blød agar-kolonidannelse af 8988T celler i forhold til shGFP inficerede celler. Resultaterne er gennemsnit af tre uafhængige forsøg og fejlsøjler repræsenterer standardafvigelser. To stjerner angiver statistisk signifikans:

P

0,01 af t-test (C) vækstkurve analyser blev udført for at vurdere effekten af ​​hæmning af NHEJ af Ku70 og Ku80 knockdown på PDAC vækst. Bemærk den robuste undertrykkelse af væksten i PDAC cellelinier (8988T, HupT3, BXPC3) og kun beskedne virkninger på andre cellelinjer (MCF7, H460 og Æske med HDPE).

(A) blød agar analyser i 8988T PDAC celler og tumorcellelinier af andre histologier (H460 og MCF7) med stigende doser af DNA-PK inhibitor NU7026 demonstrerer den dosisafhængige inhibering af forankringsuafhængig vækst i PDAC celler, men kun minimal effekt på de andre cellelinier analyseret. Stjerner viser en statistisk signifikant forskel ved t-test (p ≤ 0,05). (B) Klonogen overlevelse 8988T celler behandlet med NU7026 viste reduceret klonogene vækst. (C) IC50’er til NU7026 tværs af et større panel af PDAC cellelinier viser størstedelen er følsomme over for DNA-PK-inhibering. Fejl- søjler repræsenterer standardafvigelse fra tre uafhængige forsøg. (D) NU7026 behandling af 8988T celler induceret DNA skader og apoptose målt ved γH2AX og spaltede caspase-3 hhv. 8988T-celler blev behandlet med NU7026 eller DMSO som kontrol for en dag eller syv dage efterfulgt af western blot analyse. Forøget DNA-skader blev set ved den tidlige (dag 1) tidspunkterne med stigende tab og i sidste ende apoptose set på dag 7. (E) Æske med HDPE-celler i sammenligning viser en lille stigning i γH2AX ekspression, men meget minimal stigning i spaltet caspase-3.

En mulig resultat, når beskadiget DNA ikke repareres, er, at cellerne i sidste ende vil undergå apoptose [27], [28]. For at vurdere de cellulære konsekvenser af DNA-PK hæmning på PDAC celler, vi kiggede på markører for DNA-skader og apoptose efter kort (1 dag) eller langvarig (7 dage) behandling med NU7026. Vi fandt faktisk, at DNA-PK hæmning for en dag forårsagede yderligere DNA skader analyseret af γH2AX. Men på syv dages tidspunkterne, øget spaltet caspase-3-ekspression blev klart indikerer, at apoptose kan være forhøjet i NU7026 behandlede celler, men ikke i DMSO behandlede kontrolceller (figur 4D). I modsætning hertil viste behandling af Æske med HDPE-celler med NU7026 forøget γH2AX med meget minimale spaltet caspase-3-ekspression (figur 4E). Således hæmning af NHEJ sti fører til en yderligere ophobning af DSBs, checkpoint aktivering og i sidste ende apoptose i PDAC celler.

DSB reparation i PDAC efter IR er afhængig af DNA-PK

For yderligere udforske respons PDAC celler på DNA-skade, målte vi reparationen kinetik tre PDAC cellelinier efter IR ved at overvåge γH2AX foci ved 30 min, 2, 6 og 12 timer efter IR med en klinisk relevant dosis 2Gy. γH2AX foci toppede på omkring 30 minutter efter IR. Ved 12 timer efter IR, antallet af γH2AX foci i alle tre PDAC celler vendte tilbage til basisniveauet. Vi fandt endvidere, at reparation af alle tre PDAC cellelinier blev signifikant svækket ved hæmning af DNA-PK, hvilket indikerer, at reparation af DSB’er i PDAC celler er meget afhængig af NHEJ (figur 5A). Interessant hæmning af DNA-PK havde kun en minimal virkning på reparation af Æske med HDPE-celler (Fig 5A). Vi næste undersøgt, hvordan HR reparation var påvirket af hæmning af NHEJ. Som tidligere vist, HR var lavere i 8988T celler selv efter IR forhold til HDPE. Men HR blev øget betydeligt i tilstedeværelse af NU7026 i 8988T celler efter IR (figur 5B). Trods den tilsyneladende kompenserende stigning i HR i 8988T celler, hvor NHEJ inhiberes, antallet af γH2AX foci fortsat høj (figur 5A), hvilket viser, at dette stadig ikke tilstrækkeligt til fuldstændig reparation.

(A) Reparation kinetik tre PDAC cellelinier (8988T, Panc1 og BXPC3) blev målt ved γH2AX farvning på forskellige tidspunkter efter stråling. Data er vist som foci antallet per celle, normaliseret til 30 min tidspunkterne når foci formation var maksimal. Hver cellelinje blev behandlet med NU7026 (20 uM) eller DMSO. I hver linje løsningen af ​​foci blev væsentligt forsinket med NU7026 behandling. Lignende eksperimenter blev udført i Æske med HDPE-celler (højre panel). Bemærk at NU7026 ikke dæmper foci beslutning i disse celler. (B) HR øges som en kompenserende reaktion på NHEJ hæmning i PDAC celler. RAD51 foci-dannelse er markant forøget, når DNA-PK-aktivitet inhiberes af NU7026. Venstre panel: RAD51 foci i grøn og kernen i blå vist ved DAPI farvning. Højre panel: kvantificering af foci per celle ved de angivne betingelser. Data vises fra to uafhængige forsøg med fejlsøjler repræsenterer standardafvigelser af middelværdien.

NHEJ hæmning sensibiliserer PDAC IR

Hæmning af NHEJ øger DNA-skader, der fører til nedsat vækst og apoptose i PDAC celler, såvel som resulterer i den langvarige tilstedeværelse af DNA-skader foci efter stråling. Derfor ville NHEJ inhibering forventes at forbedre effektiviteten af ​​stråling. Både 8988T og Panc1 celler viste forøget følsomhed over for IR når de blev behandlet med NU7026 som vist ved nedsat klonogene overlevelse (figur 6A). Tilsvarende 8988T og Panc1 celler med Ku70 eller Ku80 knockdown var også mere følsomme over for IR (figur 6B). I overensstemmelse med den formindskede klonogene celleoverlevelse, en forøget fraktion af 8988T celler blev standset ved G2 /M-fasen af ​​cellens cyklus, hvor celler blev behandlet med NU7026 og IR (71,88% vs. 27,26% i det bestrålede kontrol) sammenlignet med kontroldyr behandlet eller bestrålede celler (figur 6C).

(A) hæmning af DNA-PK med NU7026 radiosensibiliserer 8988T og Panc1. Celler blev udpladet i 6-brønds plader in triplo og behandlet med DMSO eller NU7026 20 uM den næste dag. Celler blev underkastet IR efter behandling natten over med DMSO eller NU7026. Efter 9 dage blev cellerne fikseret, farvet, og kolonier tælles. Den overlevende fraktion blev beregnet ved anvendelse udpladningseffektiviteten. (B) Undertrykkelse af Ku70 eller Ku80 radiosensitized PDAC cellelinjer, 8988T og Panc1. 8988T eller Panc1 celler blev inficeret med shKu70 eller shKu80 og shGFP blev brugt som kontrol. Assays blev udført som i (A). (C) Typisk cellecyklusfordeling af 8988T ved angivne behandlinger. 8988T-celler blev behandlet med NU7026 eller DMSO i to dage efterfulgt af IR hos 2Gy og farvet med propidiumiodid 24 timer senere. Celle cyklus blev analyseret ved flowcytometri. Forsøgene blev gentaget tre gange og vist er det repræsentativt resultat.

Diskussion

pancreascancer er dybt resistente over for nuværende terapeutiske tilgange, herunder dem, der arbejder via fremkalde DNA-skader såsom forskellige cytotoksisk kemoterapier og stråling. Således kan forstå respons af disse tumorer på DNA-skade tilvejebringe vigtige terapeutiske indsigter. Vores arbejde viser, at pancreas cancercellelinier ofte har forhøjede niveauer af basal DNA beskadigelse i fravær af exogene beskadigende midler. Mens den nøjagtige ætiologi af den øgede basale DNA-skade ikke er kendt, er det fristende at spekulere, at den konstante genomisk instabilitet, at disse tumorer udholde [3] kan være delvist ansvarlig. For eksempel under processen med genomisk amplifikation, brud-fusion-bridge cyklusser forekomme, hvilket resulterer i dannelsen af ​​kontinuerlige forbigående DSB’er [29]. Disse og andre genomiske begivenheder ofte set i PDAC, såsom kromosomale translokationer, kan fremme en stabil tilstand af DNA-skader.

Vores resultater tyder også på, at NHEJ er den vigtigste vej med ansvar for DSB reparation i bugspytkirtelkræftceller som hæmning af NHEJ afskaffer de hurtige reparation kinetik. Tilsammen vil de beviser tyder et scenario, hvor disse tumorer har udviklet en afhængighed af NHEJ at overleve kontinuerlig genomisk ustabilitet og den deraf følgende DNA-skader, som indledes. Udvælgelsen af ​​DSB-reparation pathway og forholdet mellem HR og NHEJ er af stor videnskabelig interesse og mens de nøjagtige molekylære fundament for pathway udvælgelse er under udarbejdelse, er det sandsynligt, at i det mindste en del af reparationen valg styres af cellecyklen som HR kan kun fungere i S /G2 /M [7]. Vi viser, at HR er ganske lav i PDAC celler, selv som reaktion på IR. Men der er en kompenserende stigning i HR, når NHEJ hæmmes, men det er nok til at hindre genotoksisk niveauer af DNA-skader.

Derudover er vores resultater er også i overensstemmelse med de seneste terapeutiske tilgange i BRCA1 og 2 mutante tumorer ved hjælp PARP-inhibitorer. Denne “syntetisk letalitet”, hvor tumorer med en enkelt DNA-reparationsvej, såsom HR forringes er følsomme over for inhibering af en anden reparationsvej (fx BER), har fået megen opmærksomhed [30], [31], [32]. I overensstemmelse med begrebet hæmme DNA reparation veje som en terapeutisk tilgang, PDAC viser en følsomhed over for NHEJ hæmmere. Et potentielt forklaring er, at den forhøjede basal DNA-skade tjener til at overvælde DSB-reparation gør dem modtagelige for inhibering af NHEJ eller andre DNA-reparationsveje.

Endelig inhibering af NHEJ viser en stærk synergi med stråling. Dette er ikke uventet fra et mekanistisk synspunkt, men kan have kliniske implikationer i behandlingen af ​​sygdommen. Mens fjernt sygdom er en væsentlig årsag til dødelighed i bugspytkirtelkræft, seneste data viser, at så mange som 30% PDAC dødsfald henføres direkte til lokal progression [33]. Desværre, kirurgi ikke er mulig for de fleste af disse patienter, og den eneste anden tilgængelige lokal terapi, stråling, er uden virkning i de fleste tilfælde, selv når det kombineres med kemoterapi [34]. Derfor øger følsomheden af ​​disse tumorer for stråling kunne have en transformativ effekt i denne population af patienter. Faktisk er udvikling af inhibitorer til DNA reparation proteiner forekommer hurtigt, og mange er på vej ind på klinikken som bestanddele af kræftbehandling [35]. De mekanistiske indsigt identificeret i denne undersøgelse, giver en overbevisende molekylær rationale at udforske udviklingen af ​​sådanne midler til behandling af kræft i bugspytkirtlen.

Materialer og metoder

Cell kultur og reagenser

de humane tumorcellelinjer blev opnået fra American Type Culture Collection eller den tyske samling af mikroorganismer og cellekulturer. Æske med HDPE-celler blev opnået fra M.S. Tsao. [17]. Celler blev dyrket i enten DMEM eller RPMI suppleret med 10% kosmisk kalveserum, antibiotika og glutamin. Æske med HDPE-celler blev dyrket i keratinocyt serumfrit (KSF) medium suppleret med ekstrakt fra bovin hypofyse og epidermal vækstfaktor (Gibco). NU7026 (Sigma) blev anvendt ved 20 uM med mindre andet er angivet.

Real-time PCR

RNA blev isoleret med TRIzol (Invitrogen), DNase-behandlet og revers transkriberet til cDNA ved anvendelse af MMLV High ydeevne revers transkriptase (Epicentri) ved at følge fabrikantens instruktion. PCR blev udført under anvendelse af SYBR Green påvisningsreagens (Applied Biosystems) i et Bio-Rad Chromo4 Thermocycler. PCR-amplifikation blev udført ved 95 ° C i 2 min efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 15 sek, 55 ° C i 15 sek og 72 ° C i 30 sek. Endelig en smeltekurve blev dannet fra 55 ° C til 95 ° C, læse hver 0,5 ° C. Primerne var som følger:. Ku70, frem 5’AGTCATATTACAAAACCGAGGGC -3 «og omvendt 5’CCTTGGAGGCATCAACCAAAAA -3 ‘Ku80 frem 5’CCTTTCTGGTGGGGATCAGTA -3« og omvendt 5’ACCTGGTTGGATTTTGCTTTCAA -3’

IC50-assay

Celler blev udpladet i 96-brønds plader og behandlet ved seriel fortynding af NU7026 den næste dag i 72 timer. Cellelevedygtighed blev målt ved anvendelse af celle-Titer-Glow assay (Promega, G7570) ifølge producentens instruktioner. IC50 blev beregnet ved hjælp af en S-formet model med BioDataFit 1.

shRNA transfektion

pLKO.1 plasmider indeholdende shRNA sekvens for Ku70 og Ku80 blev opnået fra The RNAi Consortium (sekvenser til rådighed efter anmodning). Lentivirus indeholdende Ku70, Ku80 og GFP kontrol shRNAs blev produceret i HEK293T pakkende celler og anvendt til at inficere celler i nærvær af 8 ug /ml polybren (Sigma H9268). Ved puromycinselektion i 2-3 dage blev cellerne returneret til regelmæssig medium for eksperimenter.

Cell proliferation assay

Celler inficeret med lentivirus indeholder shGFP, shKu70 og shKu80 blev udsået i tre eksemplarer på 24- brønds plader på 2500-5000 celler pr. Celler blev fikseret i 10% formalin og farvet med 0,1% krystalviolet på dagen som angivet. Farvestoffet blev ekstraheret med 10% eddikesyre, og proliferation blev bestemt ved at måle OD ved 595 nm. Relativ proliferation blev beregnet ved normalisering til dag 0.

blød agar-assay

2 ml medium indeholdende 1% agarose (Nobel Agar, BD 214.230) blev anbragt i 6-brønds plader som bundlaget . 2 ml cellesuspension med 5000 celler i medium indeholdende 0,5% agarose blev anbragt på toppen af ​​størknet bundlag. Efter 9-14 dage blev kolonier farvet med p-iodonitrotetrazolium violet (Sigma, 18377), talt og fotograferet. Hvis det er nødvendigt, blev NU7026 tilsat til både bunden og toppen agar inden de placeres i pladerne. 200 pi medium indeholdende inhibitorer blev tilsat på toppen hver 3. dag. For RNAi eksperimenter blev celler podet to dage efter transfektion.

Klonogen overlevelse assay

Celler blev podet i tre eksemplarer på 6-brønds plader med 100 celler /brønd i vækstmedium, behandlet med NU7026 den næste dag, og udstrålede ved 2, 4 og 6 Gy. Efter 10-14 dages inkubation blev cellerne fikseret i 80% methanol og farvet med 0,2% krystalviolet, og kolonier blev talt. Den overlevende fraktion blev beregnet ved anvendelse udpladningseffektiviteten.

Neutral comet assays

Neutrale comet assays blev udført ifølge producentens instruktioner (Trevigen). Kort fortalt blev cellerne kombineret med lavtsmeltende agarose (katalog nr. 4250-050-02), og derefter monteret på CometSlide (katalog nr. 4250-200-03). Efter cellelysis (katalog nr. 4250-050-01) og afvikling af DNA blev cellerne underkastet elektroforese i 40 minutter ved 21 volt i TBE-buffer. Slides blev fikseret med ethanol, plettet af SYBR og billeder med AutoComet maskine (TriTek Corp). Minimal et hundrede tilfældigt udvalgte celler fra hver prøve blev analyseret ved hjælp CometScore software (https://autocomet.com). DNA-skader blev bestemt ved hale øjeblik (tail længde ganget med den procentdel af DNA i halen).

Western blot-analyse

Celler blev vasket af PBS, talt og lyseret i 2x SDS loading buffer . Western blot-analyse blev udført ifølge standardprotokoller. Følgende antistoffer blev anvendt til Western: Actin (Sigma, A2066), γH2AX (Millipore, 05-636), Ku-70 ged (Santa Cruz, sc-1487), Phospho-Chk1 (S345) (cellesignalering, # 2348) , og spaltes caspase-3 (Asp175) (cellesignalering, # 9664).

immunfluorescensfarvning Salg

Celler dyrket på dækglas eller 8-brønds mikroskopi objektglas blev fikseret i 20 minutter med 4% paraformaldehyd og permeabiliseret med 0,1% Triton X-100 i 3 minutter. Celler blev derefter inkuberet natten over ved 4 grader med monoklonale museantistoffer mod γH2AX (Millipore, 05-636), eller RAD51 (Santa Cruz, sc-8349, H-92), efterfulgt af gede-anti-muse-IgG-FITC (Santa Cruz, 1 :300) eller gede anti-kanin IgG-FITC (Santa Cruz, 1:300). Cell billeder blev taget under et Zeiss mikroskop ved hjælp af et 63x objektiv og analyseret for foci /kerne.

In vitro pGL2 plasmid -baseret NHEJ assay

pGL2-kontrol plasmid (Promega) blev fuldstændig lineariseret ved restriktionsendonukleasen Hindlll og det lineariserede DNA blev ekstraheret fra agarose gel med gel Extraction kit (Invitrogen). Cirkulært plasmid og lineariserede DNA blev derefter co-transficeret med pRT-RL plasmidet i celler med Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668). De transficerede celler blev lyseret og undersøgt for luciferaseaktivitet med Dual Luciferase Assay (Promega). Den ildflue signal blev normaliseret til den af ​​Renila der fungerede som en transfektion reference. Samlet NHEJ kapacitet blev beregnet ved ildflue-luciferase-aktivitet fra celler transficeret med HindIII-fordøjet DNA forhold til den for det intakte plasmid.

flowcytometriassayet

Celler blev udpladet i 6-brønds plader, behandlet med NU7026 den følgende dag for 48 timer, og udstrålede ved 2 Gy og fikseret efter 24 timer med iskold 70% ethanol i PBS i natten over. Efter centrifugering blev pellets resuspenderet i PBS, farvet med propidiumiodid opløsning i 30 minutter og analyseret ved flowcytometri (BD FACS Calibur) i mørke.