PLoS ONE: Fælles Virkninger på Cancer Cells udøves af en Random Positioning Machine og en 2D Clinostat

Abstrakt

I denne undersøgelse fokuserede vi på tyngdekraft-følsomme proteiner af to menneskelige kræft i skjoldbruskkirtlen cellelinier (ML-1; RO82-W-1), der blev udsat for en 2D clinostat (CLINO), en tilfældig placering maskine (RPM) og til normal en

g

-conditions. Efter en tre (3d) – eller syv-dages-kultur (7d) på de to enheder, fandt vi begge celletyper voksende tredimensionelt inden multicellulære sfæroider (MCS) og også celler resterende adhærerende (AD) til kulturen kolben, mens 1

g

-styring kulturer kun dannet adhærente monolag, medmindre bunden af ​​dyrkningsskålen blev dækket af agarose. I dette tilfælde cytokinerne IL-6 og IL-8 lettet dannelsen af ​​MCS i begge cellelinier ved hjælp af væske-overlay teknik ved 1

g

. ML-1-celler dyrket på RPM eller de CLINO frigivet mængder af IL-6 og MCP-1 i supernatanten, hvilket var signifikant forhøjet i sammenligning med 1

g

-controls. Frigivelse af IL-4, IL-7, IL-8, IL-17, eotaxin-1 og VEGF øget tidsafhængigt, men blev ikke signifikant påvirket af tyngdekraften betingelser. Efter 3d på RPM eller CLINO, en akkumulering af F-actin omkring cellemembranen var påviselig i AD-celler fra begge cellelinier. IL-6 og IL-8-stimulering af ML-1-celler til 3d og 7d påvirket proteinindhold ß

1-integrin, talin-1, Ki-67, og beta-actin dosisafhængigt i adhærente celler. SS

1-integrin indhold blev signifikant reduceret i AD og MCS prøver sammenlignet med 1

g

, mens Tallinn-1 blev højere udtrykt i MCS end AD befolkninger. Spredningen markør Ki-67 blev forhøjet i AD-prøver sammenlignet med 1

g

og MCS prøver. ß-actin indhold af R082-W-1-celler forblev uændret. ML-1-celler udviste ingen ændring i ß-actin i RPM kulturer, men en reduktion i CLINO prøver. Vi konkluderede derfor, at simuleret vægtløshed påvirker frigivelse af cytokiner i follikulært kræft i skjoldbruskkirtlen celler, og produktionen af ​​ß

1-integrin og Tallinn-1 og forudser en identisk effekt under virkelige vægtløshed betingelser.

Henvisning : Svejgaard B, Wehland M, Ma X, Kopp S, Sahana J, Warnke E, et al. (2015) Fælles Virkninger på Cancer Cells udøves af en Random Positioning Machine og en 2D Clinostat. PLoS ONE 10 (8): e0135157. doi: 10,1371 /journal.pone.0135157

Redaktør: Yoshiaki Taniyama, Osaka University Graduate School of Medicine, JAPAN

Modtaget: 31 januar 2015; Accepteret: 19 Juli 2015; Udgivet: 14 August, 2015

Copyright: © 2015 Svejgaard et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. forfatterne vil gerne takke det tyske Rumorganisation (DLR (GD) BMWi projekter 50WB1124 og 50WB1524), den Europæiske Rumorganisation (ESA ESA-CORA-GBF-2011 -005 projekt Device Sammenligning; ESA-CORA-GBF- 2013-001 projekt skjoldbruskkirtlen 3) (DG), Aarhus Universitet, Danmark (GD), University of Regensburg (JG), og DGLRM (Young Fellow Program for EW og GA) . De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lange rumrejser ofte forårsager skadelige sundhedsmæssige problemer hos mennesker. En række rumflyvning virkninger er blevet omfattende undersøgt i fortiden og revideret [1-4]. Nogle effekter kan forklares med kendte fysiologi; f.eks. manglen på gravitationel stress på benet muskulatur resulterer i et hurtigt tab af knogler og muskler, og manglen på den gravitationelle vektor forårsager problemer relateret til balance og øjenbevægelser [1]. Det var blevet påvist, at der annullerede tyngdekraftens indflydelse de molekylære mekanismer i cellerne direkte [3]. Celler udsat for virkelig eller simuleret vægtløshed ændre deres gen og protein udtryk opførsel [5-7], øge apoptose [8, 9], forsinke cellevækst [10] og ændre cytoskelettet [11-13]. Desuden blev detekteret multicellulære aggregater, som lignede organerne hvorfra deres celler var blevet afledt [14].

I de senere år blev det klart, at undersøgelser af opførslen af ​​cancerceller i rummet kan understøtte kræftforskning på Jorden [15]. Nu er det af interesse at sammenligne roller distinkte proteiner i cellulær tilpasning til ændrede miljøforhold (vægtløshed). Vi karakteriseret forskellige linjer af humane kræft i skjoldbruskkirtlen celler dyrket under forhold med reel og simuleret vægtløshed med det formål at finde muligheder for at reducere kræftcellen aggressivitet [16-18]. Da eksperimenter under virkelige vægtløshed dvs. rumflyvning muligheder er sjældne og dyre [16], en stor del af studierne blev udført ved hjælp af anordninger for at simulere vægtløshed på Jorden [3, 19]. Men hver enhed påvirker cellerne ikke kun ved at forhindre sedimentation, men også af karakteristika for dets driftsmåde, som omfatter forbigående hypergravity eller vibration [20]. Derfor blev det anset, at nogle observationer på celler dyrket på en vægtløshed simulerer enhed ikke alene kan skyldes at forebygge celle sedimentation, men også på grund af enhedsspecifikke virkninger [18]. Desuden er vi også observeret, at effekter er specifikke for definerede typer af skjoldbruskkirtlen cellelinjer [21]. For at undersøge indflydelsen af ​​ændrede tyngdekraft på celleniveau, vi studerede forskellige kræftceller på forskellige enheder simulerer vægtløshed efter sammenlignelige protokoller. Forud for karakterisering, menneskelige skjoldbruskkirtlen celler FTC-133, ML-1, og HTU-5 blev dyrket på Random Positioning Machine (RPM, Fig 1A) [17], men kun FTC-133 celler på RPM og den hurtigt roterende 2D -Clinostat (CLINO, fig 1B) [18] og i rummet [16, 22, 23]. Forsøgene afslørede flere aspekter og pegede på cytoskeletale proteiner og cytokiner som primære mål af vægtløshed effekter [3, 19, 22, 23]

A:. Random Positioning Machine (RPM) og B:. 2D-Clinostat

i dette studie undersøgte vi effekten af ​​simulerede vægtløshed ved hjælp af RPM og CLINO enheder på to humane follikulært kræft i skjoldbruskkirtlen cellelinier (ML-1, RO82-W-1) i en parallel måde enten til tre (3d) eller syv (7d) dage, henholdsvis før udvalgte cytokiner og cytoskeletale proteiner blev kvantificeret. For at vurdere den mulige rolle af cytokinerne IL-6 og IL-8 til ekspression af udvalgte proteiner i skjoldbruskkirtlen kræftceller, vi studerede virkningen af ​​IL-6 og IL-8 ansøgning om Ki-67, SS

1- integrin, talin-1, og beta-actin proteiner i adhærente ML-1-celler. Desuden har vi fokus på den rolle, de cytokiner IL-6 og IL-8 i ML-1 og RO82-W-1 klumpformet dannelse ved hjælp af væske-overlay teknik under en

g

-conditions [24]. Cytokiner og cytoskeletproteiner, hvis frigivelse eller udtryk blev ændret henholdsvis diskuteres med hensyn til deres specifikke roller i kræft i skjoldbruskkirtlen.

Metoder

Cellelinjer

ML-1 cellelinie.

Monolag af ML-1 follikulære thyreoideacancerceller [25] blev dyrket på enten RPM eller clinostat. ML-1-cellelinje afledt af en tilbagevendende tumor i et dårligt differentieret follikulært skjoldbruskkirtlen karcinom (stadie pT4) af en 50-årig kvinde [25]. Cellelinien har en fordoblingstid på 4 dage. Cellerne optager glucose, secernerer thyroglobulin thyroxin og triiodthyronin og er tumorigen i nøgne mus.

UCLA RO82-W-1-cellelinien.

RO82-W-1-cellelinien var oprettet ved Estour

et al

. i 1989 [26]. Cellelinjen blev købt fra Sigma-Aldrich Chemie (München, Tyskland). Denne cellelinie afledt af metastaser af en follikulært carcinom i en kvindelig patient. Selvom den primære tumor i RO82-W-1 frigivet thyroglobulin (Tg) i kredsløbet, optagelsen af ​​I131 var mindre end 2% [26]. RO82-W-1-celler er Tg-positive og er også tumorigene i nøgne mus [26].

Begge cellelinier blev dyrket i RPMI-1640 medium ved 37 ° C og 5% CO

2. Mediet blev suppleret med 100 ug /ml streptomycin, 100 U /ml penicillin og 10% FCS (alle Biochrom, Berlin, Tyskland).

Fordi begge maligne humane thyroide follikulære cellelinjer havde bevaret evnen til at syntetisere Tg udgør de værdifulde modeller til undersøgelse af humane follikulære carcinomer.

Cell Culture Procedure

24 timer før forsøgene, celler af begge typer blev podet i enten slide kolber (Thermo Scientific, Roskilde, Danmark) med et voksende område på 9 cm

2 for CLINO eller ind T25 kolber (Sarstedt, Nümbrecht, Tyskland) med et voksende område på 25 cm

2 for RPM. Cellerne for hver type dyrkningskolber blev randomiseret til at blive dyrket som statiske jorden kontroller (1

g

-condition) eller på en af ​​enhederne. Fase kontrast billeder blev taget til fange. De morfologiske billeder til RO82-W-1-celler er vist på figur 2. CLINO og RPM blev udført i individuelle inkubatorer ved 37 ° C, og jordbaserede kontroller blev altid holdt ved siden af ​​eksperimenterne i den samme respektive inkubator, hviler under statisk 1

g

-conditions. Celler af begge typer blev høstet efter 3d dage og 7d

A:. Follikulære kræft i skjoldbruskkirtlen celler dyrket til 3d på statisk en

g

. Cellerne florerede som 2D monolag. B: RO82-W-1-celler inkuberet i 3d på RPM. Pilene viser 3D aggregater (flercellede spheroids; MCS). Skærene viser svømning 3D sfæroider i supernatanten. C: MCS dannet på CLINO efter 3 dage. D: RO82-W-1-celler dyrket i 7 dage på CLINO. Pilene viser 3D sfæroider. Indsatsen demonstrerer en flydende sfæroid i supernatanten. E: RO82-W-1 celler dyrket i 7 dage ved statisk 1

g

-conditions vokse samt et konfluent monolag. F: 7 dage gamle MCS dannet på RPM (pile) kunne detekteres og adhærente RO82-W-1 celler

Virkninger af IL-6 og IL-8 på adhærerende ML-1. celler dyrket under en

g

– betingelser

ML-1 celler fra frosne lagre blev dyrket i T75-kolber i RPMI 1640-medium, indtil de nåede subkonfluens (3-5 dage). Bagefter blev cellerne subdyrket i 5 T175 og så snart de nåede subkonfluens blev de sub-dyrket igen i 20 T175 kolber. Efter at få subkonfluerende, blev cellerne behandlet med vehikel RPMI 1640 medium eller med 0,03 ng /ml, 1 ng /ml, 10 ng /ml, 100 ng /ml IL-6 eller 1 ng /ml, 10 ng /ml, 45 ng /mL eller 100 ng /ml IL-8-koncentrationer henholdsvis [27-29]. Vi anvendte også for den IL-6-gruppen 0,03 ng /ml og for IL-8 45 ng /ml, fordi disse koncentrationer blev frigivet i supernatanten af ​​ML-1-celler efter 7 dage.

10 T175 kolber ( 2 T175 uden IL-6 eller IL-8 og 8 T175 med forskellige koncentrationer af IL-6 eller IL-8) blev dyrket i inkubatoren (1

g

) til 3d, og et andet sæt af 10 T175 for 7d.

efter 3d eller 7d mediet i dyrkningskolberne er blevet kasseret, cellerne blev skrabet i 10 ml DPBS og centrifugeret ved 6000 rpm i 15 minutter. Supernatanten blev fjernet, blev pelleten opløst i 1 ml DPBS og centrifugeret igen ved 6000 rpm i 15 minutter. Pelleterne blev straks anvendt til proteinekstraktion, Western blot-analyse af beta-actin, ß

1-integrin, talin-1 og Ki-67 og efter densitometri [17,19]. Resultaterne er vist på figur 3.

Western blot-analyser og densitometriske data er givet. A, C: beta-actin, 3d og 7d; B, D: ß

1-integrin, 3d og 7d; E, G: Ki-67, 3 og 7 dage; F, H: Talin-1, 3 og 7 dage. IL-6 doser: 0,03 ng /ml; 1 ng /ml; 10 ng /ml og 100 ng /mL. Dosen 0,03 ng /mL er den maksimale mængde IL-6 frigives af ML-1-celler i supernatanten og målt ved MAP (mørk-grå søjler). IL-8 doser: 1 ng /ml; 10 ng /ml; 45 ng /ml og 100 ng /mL. Dosis 45 ng /mL er den maksimale mængde af IL-8 udgivet af ML-1-celler i supernatanten og målt ved MAP (dark-grå søjler).

Flydende-overlay teknik

Multicellulære tumor sfæroider blev produceret ved hjælp af væske-overlay teknik [24]. Thyreoideacancerceller af ML-1-cellelinien og cellelinien UCLA RO82-W-1 høstet fra adhærent voksende konfluente monolag blev udpladet på agarose-coatede 96-flere brønde plader (Nunc GmbH, Wiesbaden, Tyskland) ved en koncentration på 4000 celler /200 pi RPMI 1640-medium og inkuberet ved 37 ° C og 5% CO

2. Cellerne blev stimuleret med vehikel, IL-6 (1 ng /ml, 10 ng /ml og 100 ng /ml) og IL-8 (1 ng /ml, 10 ng /ml og 45 ng /ml). Efter 3d og 7d billeder blev taget, og resultaterne præsenteres i figur 4.

A1-A7: Fase kontrast mikroskopiske billeder taget efter 3d. ML-1-celler dyrket i agarose-coatede brønde, behandlet med vehikel eller forskellige doser af IL-6 eller IL-8. A8: 3 dage gammel kugleformet og vedhængende ML-1 celler på CLINO. B1-B7: Billeder taget efter 3d. RO82-W-1 thyreoideacancerceller dyrket i agarose-coatede brønde, behandlet med vehikel eller forskellige doser af IL-6 eller IL-8. B8: 3 dage gammel kugleformet og vedhængende RO82-W-1 celler på CLINO. C1-C7: Billeder taget efter 7d. ML-1-celler dyrket i agarose-coatede brønde, behandlet med vehikel eller forskellige doser af IL-6 eller IL-8. B8: 7 dage gammel sfæroide og adhærerende ML-1 cellepopulation efter inkubering i 2D CLINO. D1-D7: fasekontrast billeder taget efter 7d. RO82-W-1 thyreoideacancerceller dyrket i agarose-coatede brønde, behandlet med vehikel eller forskellige doser af IL-6 eller IL-8. D8:. 7-daggamle MCS og vedhængende RO82-W-1 celler efter kultur i CLINO

Random Positioning Machine

RPM blev købt fra ADS, tidligere hollandsk Space , Leyden, Nederlandene (fig 1A). Dens konstruktion og funktion blev beskrevet tidligere af van Loon [30]. Den består af to uafhængigt roterende rammer i hinanden. I vores forsøg blev RPM drives “tilfældig tilstand” (60 ° /s), i hvilken retning ændres kontinuerligt og tilfældigt. Over tid bliver alvor vektor af Jorden annulleret. Under forsøgene blev RPM lastet med op til 15 T25 cm

2 kolber, der blev fastgjort til jorden plade af maskinen. I realiteten alle kolber bopæl indenfor en afstand af 7,5 cm fra centrum af rotation. I den relativt lave hastighed (60 ° /s) af RPM, er centrifugalkraften opleves af celler, selv ved de fjerneste punkter fra rotationscentret antages at være ubetydelig [30].

2D Clinostat

2D CLINO enhed (fremstillet af DLR, Köln, fig 1B) består af seks arme muliggør rotation af prøverne omkring en akse vinkelret på tyngdekraften [31]. Hver roterende arm blev fyldt med 4 slide kolber, for i alt 24 kolber pr løb. På CLINO er ​​tyngdekraften vektor randomiseret ved hurtig og konstant rotation. Stor omhu blev truffet for at sikre, at alle kolber valgt til clinorotation var fri for luftbobler, der ellers ville fremkalde kaotiske flydende bevægelse. 2D CLINO roterende konstant ved 60 rpm genererer tilbageværende accelerationer i afstand på 3 mm omkring omdrejningspunktet i størrelsesordenen 0,012

g

, mens celler placeret på yderligere afstand erfaring op til 0,036

g

[18, 31]. Selvom tyngdekraft-relaterede grænse på skjoldbruskkirtlen cancerceller er ukendte, er det kun de celler, der ligger inden for afstand på 3 mm omkring rotationsaksen blev høstet for analyserne, hvilket betyder, at disse celler havde oplevet en meget lav residual acceleration.

pH-målinger

pH blev målt med en Metrohm 827 pH-meter ikke mere end 1 time efter eksperiment opsigelse. Alle målinger blev udført to gange, og prøverne blev holdt i lukkede Eppendorf-rør indtil måling for at undgå reaktioner med atmosfæriske gasser.

Fase kontrast mikroskopi

Axiovert 25 mikroskop (Carl Zeiss Microscopy, LLC, USA) blev anvendt til visuel observation af morfologien af ​​cellerne.

Western blot-analyser

Western blot analyser, immunoblotting, og densitometri blev udført ifølge rutinemæssige protokoller [32-37]. Følgende antistoffer blev anvendt til at kvantificere antigenerne: Anti-beta-actin, og anti-talin-1 blev anvendt i en fortynding på 1: 1000 (Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA, USA); samt anti-integrin-beta

1-antistof (Epitomics, Burlingame, USA); Ki-67 blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, TX, USA (fortynding 1: 500); den sekundære, HRP-bundet antistof blev anvendt ved en fortynding på 1: 4000 (Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA, USA). Som lastning kontrol glyceraldehyd 3-phosphat-dehydrogenase (ABR-Affinity bioreagenser, Golden, USA; fortynding: 01:10 000) blev anvendt

Membranerne blev analyseret ved hjælp af ImageJ software (amerikanske National Institutes of Health, Bethesda. , MD, USA;. https://rsb.info.nih.gov/ij/), for densitrometric kvantificering af de bands

F-actin farvning

F-actin blev visualiseret ved rhodamin-phalloidin-farvning (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) og kernerne blev farvet med Hoechst 33342 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA), som offentliggjort tidligere [36, 37]. Prøverne blev monteret med Vectashield (Vector, Burlingame, CA, USA) og analyseret mikroskopisk. F-actin farvede prøver blev undersøgt under anvendelse af et Zeiss 510 META inverteret konfokal laser scanning mikroskop (Zeiss, Tyskland), udstyret med en plan-Apochromat 63 × 1,4 mål. Excitations- og emissionsbølgelængder var: λexc = 488 nm og Aem = ≥505 nm for FITC. Bagefter blev prøverne analyseret ved hjælp af billedet analyseprogram Scion Image (Version 1,63 MacOS, Scion Corporation, USA).

Cytokin målinger med Multi-analyt Profilering teknologi

Frigivelsen af cytokiner blev undersøgt via Multi-analyt Profiling (MAP) som tidligere beskrevet [18, 22]. For hver betingelse blev fem supernatanter opsamlet efter 72 timer og opbevaret ved -80 ° C indtil test. MAP blev udført af firmaet Myriad RBM (Austin, Texas, USA), besluttede de Human Cytokiner af valg MAP A og B.

Cytokine måling ved enzymbundet immunsorbentassay

IL-6, IL-8, og MCP-1 proteiner, som frigives fra RO82-W-1-celler i cellekultursupernatanterne under RPM og CLINO eksperimenter blev detekteret ved ELISA’er købt fra R 0,05 blev betragtet som signifikante.

Resultater

Cellerne i de follikulært kræft i skjoldbruskkirtlen cellelinjer ML-1 og RO82-W-1 blev dyrket til 3d og 7d på RPM, på 2D CLINO , og under normal statisk laboratorium en

g

-conditions. Op til den syvende dag, pH forblev i det normale område, uanset om cellerne blev dyrket på RPM, under 1

g

eller på CLINO. Imidlertid forblev cellerne vokser i et monolag, hvis dyrkningen blev udført under 1

g

, mens, når den dyrkes under ændrede tyngdekraft betingelser, cellerne delt i to populationer, hvoraf en omfattede celler resterende adhærerende, medens den anden indeholdt celler danner 3D aggregater ligner dem beskrevet for FTC-133-celler [18].

Vi modtog lignende resultater med de RO82-W-1 og ML-1-celler. Begge typer af celler prolifererede ligesom RO82-W-1-celler er vist i figur 2 som en adhærent monolag (figur 2A og 2E) og som multicellulære sfæroider på RPM (Fig 2B og 2F) og CLINO (Fig 2C og 2D). Der var ingen forskelle med hensyn til antallet af sfæroider af hver cellelinje, der opstod på enten RPM eller CLINO. Begge enheder leveres sfæroider af forskellig størrelse (maks. Diameter 0,4 mm) ved begge tidspunkter som vist i figur 2B, 2C, 2D og 2F. Detachment af AD-celler startede tidligt og celle-tilknytning og klumpformet dannelse forekom også efter 7d.

Virkningen af ​​IL-6 og IL-8 på ML-1 celler dyrket under en

g

-conditions

IL-6 (0,03 ng /ml og 1 ng /ml) stimulation øget mængden af ​​beta-actin og ß

1-integrin protein i adhærerende mL-1-celler. Desuden IL-8 (1, 10 og 45 ng /ml) forøgede beta-actin proteinindhold i disse celler, hvorimod kun højere doser (10-100 ng /ml) forhøjet proteinindholdet i ß

1-integrin inden for 3 dage (fig 3A og 3B).

efter 7d, en stigning blev fundet for beta-actin protein i alle IL-6-behandlede prøver samt i prøver behandlet med 1 og 10 ng /ml IL -8 (fig 3C). SS

1-integrin protein blev induceret ved 0,03 ng /ml og ved 10 ng /ml IL-6, hvorimod kun 10 ng /ml IL-8-induceret mængden af ​​proteinet efter en 7-dages-stimulering (fig 3D).

Desuden begge cytokiner (IL-6 og IL-8, alle doser) inducerede en forøgelse af proteinindholdet Ki-67 efter 3d (fig 3E). Efter 7d, alle IL-6 doser samt 1 ng /ml og 100 ng /mL IL-8 øget mængden af ​​Ki-67-protein i ML-1-celler (Fig 3G). I modsætning hertil blev talin-1 proteinindhold tydeligt reduceret med IL-6 og IL-8 ansøgning til mediet. Lave doser af IL-6 og alle doser af IL-8 var effektive (Fig 3F) i løbet af 3-dag-1

g

-experiment. Et andet resultat blev fundet efter 7d. IL-6-stimulering resulterede i en forøgelse af talin-1 (fig 3H). En lignende konklusion blev set i IL-8-behandlede prøver (1, 10 og 45 ng /ml) af ML-1-cellelinien.

Disse forsøg er defineret for det første, den optimale IL-6 og IL-8 doser til ekspression af distinkte proteiner under en

g

-conditions og for det andet, at doserne teste deres indvirkning på MCS dannelse ved hjælp af væske-overlay metode (se nedenfor og figur 4).

Virkningen af ​​IL-6 og IL-8 på klumpformet dannelse under en

g

-conditions

Efter 3d, ML-1-celler viste kun løse celle aggregater, når den dyrkes under en

g

-conditions på agarose. 10 og 100 ng /mL IL-6 og 1, 10 og 45 ng /ml IL-8 behandling resulterede i en bedre aggregeringen af ​​ML-1-celler til sfæroider, når de dyrkes i agarose-coatede brønde (Liquid-overlay teknik) (fig 4A1-4A7). RO82-W-1-celler dannede store uregelmæssige aggregater efter en 3 dages inkubation i agarose-coatede brønde. Begge cytokiner forbedret dannelsen af ​​RO82-W-1 flercellede sfæroider ved hjælp af væske-overlay metode (Fig 4B1-4B7).

Efter 7d, ML-1 celler viste uregelmæssige dannede cellulære aggregater på agarose. De cytokin-behandlede grupper indeholdt flere tætte sfæroider efter en uges stimulering (Fig 4C). ML-1 sfæroider dannet på CLINO lignede de flydende-overlay sfæroider blev behandlet med 45 ng /ml IL-8 (fig 4C7 og 4C8).

Efter 7d, voksede de RO82-W-1-celler i form af tætte flercellede spheroids samt enkelte celler svømning i supernatanten i agarose brønde. Cytokin ansøgning til mediet forbedret lidt størrelsen af ​​sfæroiderne (fig 4D1-4D7).

Sfæroiderne af begge celletyper dannet efter IL-6 og IL-8 behandling udviste en lignende morfologi end MCS fremstillet efter inkubation på CLINO (fig 4A8, 4B8, 4C8 og 4D8).

Cytokine frigivelse af ML-1 celler

Måling af cytokiner i human Cytokine valg MAP A og B, vi har registreret IL 4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-17, MCP-1, VEGF-A og eotaxin-1 i supernatanterne for de forskellige cellekulturer. Vi målte ca. 32 pg /ml IL-4 og IL-7 i supernatanterne fra 3 dage gamle cellekulturer, uanset om cellerne var blevet inkuberet på RPM, om CLINO eller i den stationære 1

g

-styring. Efter en 7-dages-eksponering, cellekultursupernatanterne indeholdt ca. 47 pg /ml IL-4 og ca. 43 pg /ml IL-7, uafhængigt af dyrkningsbetingelser (Fig 5A og 5C). Et lignende fænomen blev observeret med hensyn til IL-8 og VEGF-A. Ca. 710 pg /mL VEGF-A og 11.000 pg /ml IL-8 blev fundet i supernatanterne fra 3 dage gamle kulturer, uanset om cellerne var blevet inkuberet på RPM, på CLINO eller under stationær 1

g

-conditions. Efter en 7-dages-eksponering, VEGF-A og IL-8-koncentrationer blev forøget til omkring 3000 pg /mL VEGF-A og ca. 35.000 pg /ml IL-8 blev detekteret, igen uden signifikant forskel med hensyn til dyrkningsbetingelser (Fig 5D og 5F). Tilsammen Fig 5A, 5C, 5D og 5F viser, at indholdet af IL-4, IL-7, VEGF-A og IL-8 i kultursupernatanterne blev forøget i de 7-dag-prøver sammenlignet med 3- dag-prøver, mens en betydelig indflydelse for at udsætte celler til RPM eller CLINO ikke kunne ses for disse 4 typer af cytokiner

a:. IL-4, B: IL-6, C: IL 7, D: IL-8, E: MCP-1, F: VEGF-a proteiner frigivet af ML-1-celler i supernatanten efter en 3- og 7-dages-eksponering for RPM eller 2D Clinostat, bestemt ved Multi -Analyte Profilering af supernatanten. RPM: Tilfældig Positioning Machine; CLINO: 2D Clinostat; * P 0,05

I modsætning hertil akkumulering af IL-6 og MCP-1 i de forskellige kultursupernatanter tydeligt afhang af dyrkningsbetingelser. En frigivelse af 27 og 33 pg /mL IL-6 blev fundet i supernatanterne af RPM prøver efter 3d og 7d i dyrkning henholdsvis mens et beløb på 22,5 pg /mL IL-6 blev målt i relevant en

g

-controls (fig 5B). Tilsvarende blev en koncentration på 24 og 36 pg /ml IL-6 findes i supernatanterne af CLINO prøver efter en 3- og 7-dages-eksperiment, hvorimod /ml IL-6 om en mængde på 25 pg blev målt i relevant en

g

-controls (fig 5B). Derudover monocyt-kemoattraktant-protein-1 (MCP-1) niveauer ændres, når celledyrkning blev udført på enheder simulerer vægtløshed. Under normale tyngdekraft betingelser, ca. 600 pg /ml MCP-1 blev fundet efter 3 dage og mellem 700 og 750 pg /ml efter 7 dage, mens MCP-1-koncentrationer steg fra 750 til 950 pg /ml på RPM og fra 700 til 1000 pg /mL på CLINO (fig 5E).

Ud over de seks cytokiner vist i figur 5 vi søgt efter yderligere cytokiner som vist i tabel 1. Men vi fandt ikke yderligere cytokiner frigives til supernatant i 3 dage af celledyrkning under alle forhold. Frigivelse af IL-17 og eotaxin var detekterbar i prøver dyrket i 7 dage på CLINO, på RPM samt på jorden med ingen signifikante forskelle i koncentrationer på ca. 1 pg /ml (IL-17) og 15 pg /mL (eotaxin) (tabel 1).

Cytokine frigivelse af RO82-W-1 celler

Vi undersøgte udgivelsen af ​​udvalgte cytokiner i supernatanten af ​​RO82-W-1 celler efter en 3-dages-eksponering for RPM eller CLINO enheder. Mængden af ​​IL-6 blev signifikant forhøjet fra 56,9 pg /ml til 75,2 pg /ml på RPM (Fig 6A). Et lignende resultat blev opnået for IL-8 (fig 6B). Ikke-betydelige stigninger for begge cytokiner blev målt til CLINO-prøverne.

Udskillelsen af ​​MCP-1 i RO82-W-1 celler var meget lavere end udgivelsen af ​​ML-1-celler (fig 5E og 6C ). Kultur af RO82-W-1 celler på RPM eller CLINO helt stumpe udgivelsen af ​​MCP-1 (Fig 6C)

A:. IL-6, B: IL-8, og C: MCP 1 proteiner frigivet af RO82-W-1 skjoldbruskkirtlen cancerceller i supernatanten efter en 3-dages-eksponering for RPM eller 2D CLINO, bestemt ved ELISA-teknik. RPM: Tilfældig Positioning Machine; CLINO: 2D Clinostat; * P. 0,05

Effekter af simuleret vægtløshed på cytoskelettet

Da tidligere undersøgelser har vist, at cytoskeletale proteiner af forskellige typer af celler er hårdt ramt af vægtløshed [11-13, 37, 39-41], udførte vi F-actin farvning på celler dyrket på RPM og på 2D CLINO til 3d og 7d. Efter 3 dage, en akkumulering af F-actin langs den ydre cellemembran var synlig i ML-1-celler samt i RO82-W-1-celler dyrket på CLINO og RPM (figur 7). Efter 7 dage blev cellerne fuldstændigt konfluente og overgrew hinanden. En fortykkelse af den ydre membran blev fundet under begge betingelser (1

g

og simuleret vægtløshed), men var mere udtalt på RPM og CLINO

AC:. ML-1 3-dages -eksperiment. A: ML-1-celler, 3d, 1

g

-condition: normale celler med normal F-actin cytoskeleton B: ML-1-celler, 3d, akkumulering af F-actin ved den ydre cellemembran (gule pile ) efter RPM-eksponering. Den hvide pil markerer til adskillelse af celleaggregater fra det klæbende cellelag. C: ML-1-celler, 3d, tykkere lag af F-actin ved den ydre cellemembran (gule pile). D-F: ML-1 7-dages-eksperiment. D: ML-1-celler, 7d, 1

g

-condition: sammenflydende normale celler med normal F-actin cytoskeleton. E: ML-1-celler dyrket på RPM i 7d viste tykkere lag af F-actin ved den ydre membran (insert). F: En 7-dages-eksponering af ML-1-celler til CLINO inducerede lignende ændringer i F-actin cytoskeleton. Indsatsen viser ticker F-actin fibre ved de cellulære membraner. G-I: RO82-W-1 3-dages-eksperiment. G: normal F-aktincytoskelet RO82-W-1-celler. H: MCS-dannelse (gule pile) efter en 3-dages-inkubation på RPM. En ophobning af F-actin ved den ydre cellemembran er synlige (gule pile). I: RO82-W-1 dyrket i 3d på clinostat afslørede en klar fortykkelse af F-actin fibre (pile). Indsæt: 3D MCS. J-L: RO82-W-1 7-dages-eksperiment. J: F-actin cytoskelettet sammenflydende RO82-W-1-celler dyrket på en

g

. K, L: MCS dannelsen af ​​RO82-W-1-celler efter RPM- (K) og CLINO-eksponering (L). Pilene viser 3D MCS og en fortykkelse af F-actin fibre ved de ydre membraner.

Western blot-analyser af β-actin i ML-1-celler viste et fald efter 7d i clinorotation (Fig 8A ), men proteinet forblev uændret efter 7d i RPM-eksponering. Eksponering af ML-1 celler til RPM og clinostat induceret signifikante fald i β

1-integrin i AD og MCS celler efter 7d (Fig 8B). Talin-1-protein blev reduceret betydeligt i AD-celler kun, når ML-1-celler blev inkuberet på CLINO (Fig 8C). Ki-67 protein, en nuklear protein, der er forbundet med den cellulære proliferation proces, var signifikant forhøjet i AD-celler i forhold til MCS og en

g

-styring celler på begge enheder (figur 8D).

Western blot analyser af AD: ML-1 celler efter en 7-dages-eksponering på RPM og CLINO. A: ß-actin, B: ß

1-integrin, C: Tallinn-1 og D: Ki-67 proteiner. Klare forskelle mellem de to enheder er fundet for ß-actin. Western blot analyser af E-H: RO82-W-1 celler efter en 7-dages-eksponering på RPM og CLINO. E: ß-actin, F: ß

1-integrin, G: Tallinn-1 og H: Ki-67 proteiner. Der var ingen ændring i beta-actin indhold af RO82-W-1 celler dyrket på RPM eller CLINO til 7d. Mængden af ​​ß

1-integrin og Ki-67 var sammenlignelig med de ML-1 kulturer dyrket under s-μ

g

. * P. 0,05

Ingen ændring i beta-actin blev fundet i RO82-W-1-celler efter en 7-dages-kultur på RPM eller CLINO (Fig 8E). Indholdet af beta-actin-protein forblev konstant.