PLoS ONE: High-Throughput transkriptom og RNAi Analyse Identificerer aim1, ERGIC1, TMED3 og TPX2 som potentielle Drug Mål i prostatakræft

abstrakt

Prostatacancer er en heterogen gruppe af sygdomme, og der er et behov for mere effektive og målrettede behandlingsmetoder. I denne undersøgelse blev potentialet af genekspression data og RNA-interferens teknik kombineret for at fremme fremtidige personlige prostatacancerlægemidler. For at skelne de mest lovende

in vivo

prevalidated mål prostatakræft narkotika, et bioinformatisk analyse blev udført ved hjælp af genom-dækkende genekspression data fra 9873 humane vævsprøver. I alt blev 295 gener udvalgt til yderligere funktionelle studier i dyrkede prostatacancerceller grund af deres høje mRNA-ekspression i prostata, prostatacancer eller i metastatisk prostatacancer prøver. For det andet blev RNAi baseret celleviabilitetstest udført i VCap og LNCaP-prostatacancerceller. Baseret på siRNA resultater, genekspression mønstre i humane væv og nyhedsværdi, endoplasmatisk reticulum funktion er forbundet mål

aim1

,

ERGIC1

og

TMED3

, samt mitose regulerende

TPX2

blev udvalgt til yderligere validering.

aim1

,

ERGIC1

, og

TPX2

viste sig at være stærkt udtrykt især i prostata cancer væv, og høj mRNA udtryk for

ERGIC1

TMED3

forbundet med

AR

og

ERG

onkogen udtryk.

ERGIC1

tavshed specifikt reguleret spredning af

ERG

onkogen positive prostatacancerceller og hæmmede ERG mRNA-ekspression i disse celler, hvilket indikerer, at det er et potent stof mål i ERG positiv undergruppe af prostatakræft.

TPX2

udtryk i forbindelse med PSA fiasko og

TPX2

lyddæmpning reduceret PSA udtryk, hvilket indikerer, at TPX2 regulerer androgen receptor medieret signalering. Konklusionen er, at kombinatorisk brug af microarray og RNAi teknikker gav i et stort antal potentielle nye biomarkører og terapeutiske mål, for den fremtidige udvikling af målrettede og personlige tilgange for prostatakræft management

Henvisning:. Vainio P, Mpindi JP , Kohonen P, Fey V, Mirtti T, Alanen KA et al. (2012) High-Throughput transkriptom og RNAi Analyse Identificerer

aim1

,

ERGIC1

,

TMED3

og

TPX2

som potentielle Drug Mål i prostatakræft. PLoS ONE 7 (6): e39801. doi: 10,1371 /journal.pone.0039801

Redaktør: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, USA

Modtaget: 28 oktober, 2011; Accepteret: 31. maj 2012; Udgivet: 28 juni 2012

Copyright: © 2012 Vainio et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse er blevet støttet af Marie Curie Canceromics (MEXT-CT-2003-2728), EU-PRIMA-projektet (kontrakt # LSHC-CT-204-504.587), TIME samarbejdsprojekt, Cancer Organisationer Finland, Sigrid Juselius Foundation, Finlands Akademi og Drug Discovery Graduate School på University of Turku. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft er den mest almindeligt diagnosticeret malignitet og den næstmest almindelige dødsårsag kræft i den vestlige male [1] befolkning. Men prostatakræft udgør en heterogen gruppe af sygdomme og nogle mænd er stadig diagnosticeret med høj kvalitet sygdom udføre mislykkede behandling [1], [2]. Trods fænotypiske og molekylære heterogenitet af sygdommen er der mangel af robuste og specifikke prognostiske biomarkører til at skelne mellem indolent og aggressive cancere på tidlige faser af sygdommen. På grund af manglen på effektive prognostiske og terapeutiske biomarkører, samt målrettede lægemidler, den kliniske ledelse er stadig langt fra personlig.

Udover at regulere udviklingen og vedligeholdelsen af ​​prostata, androgener støtte udvikling og vækst af de fleste primære prostatakræft og androgen receptor (AR) spiller rollen som et onkogen i prostatacancer [3] – [7]. Derfor androgen ablation er i øjeblikket til behandling af valg for fremskreden prostatacancer. Selv androgen blokering oprindeligt resulterer i en god behandlingsrespons, er det næsten aldrig kurativ [2]. Androgen-uafhængig kræftceller typisk begynder at dukke under behandlingen, i sidste ende fører til tilbagevendende, hormon-refraktær sygdom [8], [9]. Ud over at fremherskende ændringer i AR udtryk og funktion, ca. halvdelen af ​​prostata cancer prøver huser et onkogen gen fusion kombinerer androgen-regulerede transmembrane protease serin 2 (

TMPRSS2

) med onkogene ETS transkriptionsfaktorer [10]. Oftest er fusionspartneren

ERG

(v-ets erythroblastosis virus E26 onkogen homolog, aviær), efterfulgt af

ETV1

(ETS variant 1),

ETV4

, og

ETV5

[11] – [13]. ERG mRNA udtrykkes ikke hos raske prostatavæv, men som følge af den

TMPRSS2-ERG

genfusion tidligt i carcinogenese, kan detekteres en betydelig stigning i ERG transkriptniveauer i prostatakræft. ETS genfusioner fremme multiple signalveje, der er forbundet med dannelse og fremadskriden kræft, og ektopisk

ERG

onkogen ekspression er blevet associeret med en specifik molekylær signatur i prostatacancer [14] – [19]. Selvom

ERG

aktivering medieret onkogene processer kan blive omgået i fremskreden prostatacancer, hormon-reguleret udtryk for

ERG

er blevet beskrevet også at fortsætte i kastrationsresistent prostatacancer, støtte betydningen af ​​denne omlægning også i fremskreden sygdom [15], [20], [21]. Tilsammen ETS fusioner er centrale molekylære forandringer driver udviklingen og progressionen af ​​en særskilt klasse af prostatakræft, og kunne derfor drage fordel af målrettet terapi.

I de senere år avancerede molekylærgenetiske teknikker kombineret med udvikling af nye bioinformatiske analyse værktøjer har tilbudt effektive måder at undersøge tumor genekspression profiler, hvilket letter biomarkør opdagelse, samt identifikation af potentielle nye lægemiddelkandidater. Genekspression profilering giver bedre diagnose og stadieinddeling af sygdommen, giver oplysninger om behandlingsreaktioner og fører til reducerede bivirkninger [22], [23]. RNA-interferens (RNAi) teknik muliggør udforskning af den funktionelle effekt af individuelle gener på kræft celle egenskaber, såsom vækst og overlevelse, yderligere at fremme udviklingen af ​​målrettede og personlige terapi [24] – [26]. I denne undersøgelse blev potentialet af disse teknikker kombineres ved forvælge generne for RNAi funktionelle assays under anvendelse genekspression data. For at identificere potentielle svagheder stede i prostatacancere blev en bioinformatik-mRNA-ekspression analyse først udført baseret på 9873 humane vævsprøver, herunder 349 prostatakræft og 147 ikke-maligne prostata prøver, at skelne prostata og prostatakræft vævsspecifikke gener. For det andet, en RNAi high-throughput (HT) funktionel profilering af de udvalgte

in vivo Salg prevalidated mulige lægemiddelmål blev udført i VCap og LNCaP prostatakræft-cellelinier for at identificere gener og pathways essentielle for prostatakræft celleproliferation og overlevelse. Resultaterne beskrives potentialet for at målrette endoplasmatiske reticulum (ER), oxidation, aktincytoskelettet og mitose i prostatakræft management, og yderligere validering identificeret

aim1 Hotel (fraværende i melanom 1),

ERGIC1

( endoplasmatisk reticulum-Golgi mellemliggende rum protein 1),

TMED3

(transmembrane emp24 protein transport domæne, der indeholder 3) og

TPX2

(målrettet protein til Xklp2) som potentielle roman lægemiddelkandidater i prostatakræft.

Metoder

I Silico

data Mining

GeneSapiens databasen [27] blev anvendt til bioinformatically udforske genekspressionsniveauer tværs 9783 humane vævsprøver. Kort fortalt GeneSapiens (https://www.genesapiens.org/) er en samling af 9873 Affymetrix microarray eksperimenter. Alle prøver reannotated og normaliseret med en brugerdefineret algoritme. Data er indsamlet fra forskellige offentligt tilgængelige kilder, herunder Gene Expression Omnibus og Array-Express og dækker 175 forskellige vævstyper. Betyde ekspression af hvert gen blev bestemt i prostatacancer (n = 349), sund prostata (n = 147), og alle normale vævsprøver (n

=

1476). Data fra prostatakræft prøver tilgængelige i GeneSapiens databasen blev udnyttet også i

i silico

co-ekspression analyser. De funktionelle gen ontologi anmærkninger blev analyseret for de co-udtrykte gener (R 0,5 og P 0,001) ved hjælp af DAVID funktionel annotation værktøj [28] og Ingenuity Pathway Analysis (IPA) Software (Ingenuity Systems Inc., Redwood City, CA, USA).

Cell Culture

VCAP prostatacancerceller blev modtaget fra Kenneth Pienta (University of Michigan, MI) eller købt fra American Type Culture Collection (LGC Promochem AB, Borås, Sverige) og dyrket i RPMI-1640-medium (Invitrogen, Carlsbad, CA). LNCaP-celler blev modtaget fra dr Marco Cecchini (University of Bern, Schweiz) og opretholdt i T-medium (Invitrogen, Carlsbad, CA). PC-3 blev DU145 og MDA-PCa-2b celler købte fra American Type Culture Collection (LGC Promochem AB), og 22Rv1 celler fra Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ, Braunschweig, Tyskland). De ikke-maligne EP156T prostata epitelceller blev modtaget fra Dr. Varda Rotter (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel) og RWPE-1 celler købt fra American Type Culture Collection (LGC Promochem AB). Primære prostata epitelceller (PrEc) blev indkøbt fra Lonza (Lonza Group Ltd, Basel, Schweiz). Androgen-uafhængige LNCaPs og deres parentale modstykker blev modtaget fra dr Zoran Culig (Innsbruck Medical University, Østrig) og blev dyrket i RPMI-1640 (Invitrogen) indeholdende trækul strippet eller normal føtalt bovint serum, hhv. Syntetisk androgen R1881 blev købt fra PerkinElmer.

Gene Knock-down Brug RNA Interference

Inden screeningen celle nummer blev titreret til både VCAP og LNCaP celler separat for at sikre, at celleproliferationen forblev i en lineær -exponential fase hele eksperimentet. For RNAi undersøgelser blev fire siRNAs pr gen (HP GenomeWide, Qiagen) udpladet på 384 brønde (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Tyskland) efterfulgt af tilsætning af transfektionsblandingen middel (siLentFect lipid reagens, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) i Opti-MEM-medium (Invitrogen) og en passende mængde af celler (1500-2000 per brønd) ved anvendelse automatiseret væske håndteringsrobot (Hamilton) og væskedispenser (ThermoFisher). Den endelige siRNA-koncentrationen var 13 nM. AllStars negativ kontrol (krypteret siRNA, Qiagen) og lipid kun blev brugt som negative kontroller, siRNA’er mod

KIF11

(kinesin familiemedlem 11 SI02653770) og

PLK1

(polo-lignende kinase 1; SI02223844) blev anvendt som positive kontroller. For Valideringsforsøg celler blev transficeret med to siRNAs pr gen (

aim1

: SI03126704, SI03212846;

ERGIC1

: SI03164763, SI04302872;

TMED3

: SI00746711, SI00746718;

TPX2

:. SI00097188, SI00097195) som beskrevet ovenfor i de relevante plader

Cell levedygtighed og Apoptose Assay

CellTitre-Blå (CTB) og CellTiter-Glo (CTG) celle levedygtighed assays (Promega), og ApoONE apoptose (induktion af caspase -3 og 7 aktiviteter) assay (Promega) blev udført ifølge producentens instruktioner som respons på 48 timer eller 72 timer siRNA behandling. Resultaterne blev scannet med EnVision Multilabel pladelæser (PerkinElmer /Wallac).

Normalisering og statistisk analyse af siRNA Screen Resultater

De rå resultater fra rentabilitet celle og apoptose assays blev normaliseret ved hjælp af

B

-Score [29], og siRNAs reducere levedygtighed celle ved -2 ​​SD fra medianen af ​​kontrollerne (svarende til P 0,05) i mindst to af skærmene eller inducere apoptose med 3 SD (svarende til P 0,01) blev anset antiproliferativt eller pro-apoptotiske hit siRNA’er.

Klinisk prostata vævsprøver

De 33 primære prostata tumor prøver (19 ERG onkogen positive og 14 ERG negative) og 3 ikke-maligne prostata prøver anvendes i denne undersøgelse er tidligere blevet beskrevet [30].

kvantitativ revers transkriptase PCR

valideringen af ​​mRNA ekspressionsniveauer blev udført under anvendelse af TaqMan kvantitativ revers transkriptase PCR (QRT-PCR) analyse ( Finsk mikromatrice Center, Center for Biotechnology, University of Turku). RNA-prøver ekstraheret med RNeasy Mini Kit (Qiagen) blev omvendt transkriberet til cDNA (høj kapacitet cDNA Reverse Transcription Kit, Applied Biosystems) og PCR-reaktionsbetingelser prøver blev analyseret i 96-brønd eller 384-brønd format. Kvantitativ RT-PCR blev udført under anvendelse af ABI Prism 7900 (Applied Biosystems) og kvantificering blev udført under anvendelse af

ΔΔCT metode med RQ Manager 1.2 software (Applied Biosystems). Tre replikat-prøver blev undersøgt for detektion af mål-mRNA-ekspression og β-actin blev anvendt som en endogen kontrol. Primerne og proberne er designet og udvalgt med hjælp af Universal ProbeLibrary Assay Design Center (Roche Diagnostics) (Støtte tabel S1). Salg

Western blot-analyse Salg

helcellelysater blev fremstillet under anvendelse lysis puffer (62,5 mM Tris, 1% SDS, 5%, β-mercaptoethanol 10% glycerol, bromphenolblåt). Anvendte antistoffer omfattede anti-AR (1:1,000, NeoMarkers, Thermo Fisher Scientific Inc., Fremont, CA), anti-PSA (1:1,000, A0562, DakoCytomation, Glostrup, Danmark), og sekundær Alexa Fluor (1: 4.000, Molecular Probes, Invitrogen) antistoffer. β-actin (1:5,000, antistof fra Sigma) blev anvendt som en loading kontrol. Signalet blev detekteret ved anvendelse Odyssey Infrarød Imaging System (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) ifølge producentens instruktioner.

Statistical Analysis

Resultaterne er vist som middelværdi ± SD. Statistiske analyser blev udført ved hjælp af t-test (*, P 0,05, **, P 0,01, ***, P 0,001) og Pearson korrelationskoefficient

Resultater

Høj. -throughput Screening Resultater Fremhæv rolle endoplasmatisk reticulum og Mitose gener i Regulering prostatakræft cellevækst og overlevelse

for at vælge

in vivo

prevalidated potentielle lægemiddelvirkninger og biomarkører for yderligere undersøgelser i dyrkede prostata cancerceller de genekspression data i GeneSapiens database blev anvendt. I alt blev der udvalgt 295 prostata og /eller prostatacancer specifikke gener baseret på høj mRNA-ekspression i prostata, prostatacancer eller i metastatisk prostatacancer vævsprøver, og et siRNA-bibliotek blev konstrueret for funktionelle studier (figur 1). For RNAi studier 4 siRNAs pr genet, blev købt og plade baseret HT siRNA skærme blev udført med VCap og LNCaP prostatacancercellelinjer. VCAP er en model for TMPRSS2-ERG positiv prostatacancer, der udtrykker vildtype AR, mens LNCaPs huser en mutant

AR

(T877A) med udvidet ligand specificitet. At identificere terapeutisk relevante gener og veje i prostata carcinogenese, ændringer i cellernes levedygtighed og induktion af apoptose (caspase -3 og 7 aktivering) blev undersøgt som de endelige punkter (Støtte tabel S2).

En Heatmap præsentation af de gennemsnitlige genekspressionsniveauer af de 295 gener (x-akse) udvalgt til yderligere RNAi udforskning i alle vævene (raske og maligne) til stede i GeneSapiens database (y-aksen). Positionen af ​​prostatacancer (øvre asterisk) og sund prostata (lavere asterisk) er blevet indikeret. Farven illustrerer niveauet af ekspression i forskellige væv og grå manglende værdier. Den Heatmap tegnes på grundlag af ukontrollerede hierarkisk klyngedannelse.

cellelevedygtigheden siRNA skærm blev udført i tre gentagelser og apoptose analysen en gang i begge cellelinier. De positive kontrol siRNA’er rettet mod kendte nøgleregulatorer af den mitotiske progression samt prostatacancer celleproliferation, KIF11 og PLK1 [31], [32], var i stand til sænke cellernes levedygtighed (figur 2A) bekræfter således transfektionseffektivitet. De levedygtighed replikere celle skærme positivt korrelerede (0,67 R 0,78 i LNCaP og 0,36 R 0,66 i VCAP) i begge cellelinier understøtter funktionaliteten af ​​de primære skærme (figur 2B og Støtte tabel S2).

A. Oversigt over den normaliserede LNCaP og VCap cellelevedygtighed screen resultater (B-score). Resultaterne fra de positive kontrol siRNA’er (KIF11 og PLK1) er angivet i blå, negative kontrolbrønde (AllStars negativ scrambled siRNA og buffer kun) i grøn, og target gen siRNAs i gråt. B. En Heatmap præsentation af resultaterne cellernes levedygtighed skærm (B-score). Assayet blev gentaget tre gange i både LNCaP og VCAP prostata cancercellelinjer. Blå farve angivet nedsat cellelevedygtighed, rød forøget cellelevedygtighed. Den Heatmap tegnes på grundlag af ukontrollerede hierarkisk klyngedannelse. C. Overlapningen mellem RNAi skærmen hit gener (nedsat cellelevedygtighed som reaktion på at lukke munden) i LNCaP og VCap cellelinier. D.

I silico

co-ekspression analyse af rentabilitet celle hit gener i prøver prostatakræft. Generne er organiseret i den samme rækkefølge i både y- og x-aksen, og korrelationerne (R) mellem generne er angivet med farver. Rød indikerer positiv korrelation, blå negativ korrelation.

De siRNA skærme resulterede i 94 potentiel spredning fremme (hits i mindst to af de levedygtighed celle-skærme) og 97 anti-apoptotiske gener i LNCaP celler. Ud af de 94 gengivet levedygtighed celle hit gener 45 (47,9%) var også anti-apoptotiske. I VCap celler den endelige hit rate var 35 gengivne proliferation fremme og 34 anti-apoptotiske hit gener, 9 (25,7%) heraf fremmes cellelevedygtighed og beskyttet mod apoptose. Silencing af 17 gener resulterede i en anti-proliferativ respons i begge LNCaP og VCap celler. (Figur 2B-C og støtte tabel S2).

i silico

co-ekspression analyse af spredning hit gener (n = 112) foreslog tre store prostatakræft undergrupper med forskellige mekanismer for cellevækst regulering. Den største sæt gener havde en rolle i ER og Golgi-apparatet, prostata udvikling, såvel som i reduktion oxidation. De øvrige undergrupper af prostatakræft levedygtighed regulerer gener var involveret i aktincytoskelettet og mitose (figur 2D).

Novel Formodede Prostata Cancer Drug Mål

aim1

,

ERGIC1

,

TMED3

, og

TPX2

blev udvalgt til yderligere validering

RNAi skærme bekræftede den rolle af flere tidligere offentliggjorte prostata cancer drug mål som vækst og apoptose regulerer gener i dyrkede prostatakræft celler. Blandt andet, disse gener inkluderet

CLDN3

,

CYP4F8

,

EPHX2

,

FAAH

,

FOXA1

,

MTDH

,

ODC1

,

PLA2G2A

,

PLA2G7

,

SIM2

UBE2C

[30], [33] -. [41] (Støtte tabel S2)

Fire nye kandidat lægemiddeltargets,

aim1

,

ERGIC1

,

TMED3

, og

TPX2

, blev udvalgt til yderligere studier baseret på den høje ekspression i prostatakræft sammenlignet med normale prostata og alle andre normale væv indgår i GeneSapiens database (Støtte fig S1), såvel som deres nyhed som regulatorer af prostatacancer celleproliferation og apoptose.

aim1

,

TMED3

og

TPX2

var blandt de 17 gener, undertrykkelse som inducerede antiproliferative effekter i både VCAP og LNCaP celler samt apoptose i mindst én af cellelinierne. Silencing af

ERGIC1

induceret antiproliferativ virkning specifikt i ERG onkogen positive VCAP celler (Støtte tabel S2).

aim1

,

ERGIC1

TMED3

var co-udtrykt i sæt gener funktionelt kommenterede til ER og Golgi apparater og redoxreaktioner, mens

TPX2

blev udtrykt mellem de involverede i mitose (figur 2D) gener.

aim1 protein er et medlem af βγ-krystallinske superfamilien. I modsætning til andre p- og y-krystallinske, der vides at være specifikt udtrykkes i forlængede celler linse fiber, der er under store ændringer i cytoskeletal arkitektur og sammensætning, aim1 har en ikke-linse rolle. Men aim1 protein sekvens har en svag lighed med endeløse eller actin-bindende proteiner, hvilket indikerer en mulig rolle i forvaltningen af ​​cellens morfologi og form [42].

aim1

gen lokaliseres i 6 Q21, inden det formodede tumor suppressor region for humant melanom, og aim1 ekspression er blevet vist at blive ændret i association med tumorsuppression i et humant melanom-model [43]. Men de seneste undersøgelser indikeret, at

aim1

er ikke det vigtigste tumorsuppressorgen i del6q21 i naturlige dræberceller celle cancerformer [44], [45]. Støtte til eventuelle rolle

aim1

som en tumor suppressor har aim1 methylering blevet associeret med nasopharyngeal karcinom og primær tumor invasion af blærekræft [46], [47]. På den anden side har aim1 ekspression blevet vist at være høj i TRAIL resistente cancercellelinier [48].

ERGIC1 er en cykel membranprotein bidrager til trafik membran og selektiv transport af gods mellem ER, den mellemliggende rum, og Golgi apparat [49], mens TMED3 er en bestanddel af de belagte vesikler, der er involveret i transport af fragt molekyler fra eR til Golgi-komplekset og fungerer som receptorer for specifik sekretorisk last [50]. Selvom forbliver den præcise rolle ERGIC1 og TMED3 i cancer at blive belyst, er dysfunktion af proteostasis og ER vides at inducere et stressrespons (udfoldet protein reaktion), der fører til apoptose i cancerceller [51], [52].

TPX2 udelukkende udtrykkes i prolifererende celler fra overgangen G1 /S frem til udgangen af ​​cytokinesen. Mitose er en større biologisk proces dereguleret i kræft og de vigtigste biologiske proces rettet af cytotoksiske lægemidler. Interessant er TPX2 kendt for at være højt udtrykt i forskellige cancervæv, og det er blevet foreslået som en biomarkør for dårlig prognose [53] – [55]. Som en vigtig regulator af cellecyklus og en bindingspartner for Aurora A kinase, har TPX2 også blevet foreslået som et potentielt mål lægemiddel i flere maligniteter [56] – [58]. Imidlertid har TPX2 ikke blevet undersøgt i prostatakræft tidligere. Det er blevet foreslået, at TPX2 målrettede lægemidler kunne være mere effektiv end anvendelsen af ​​Aurora A kinaseinhibitorer grund af uspecifik natur konventionelle kinaseinhibitorer [58]. Desuden kombinerer TPX2 og Aurora A kinase målrettede lægemidler kunne hæmme udviklingen resistens [59], [60].

Validering af

aim1

,

ERGIC1

,

TMED3

, og

TPX2

Expression og siRNA induceret Target Gene Silencing i dyrkede prostata celler

mRNA udtryk for

aim1

,

ERGIC1

,

TMED3

, og

TPX2

blev undersøgt i seks prostatakræft (VCAP, PC-3, MDA-PCa-2b, LNCaP, DU145 og 22Rv1) og tre ikke-maligne prostata epitelcelle linjer (RWPE-1, Prec, EP156T) (figur 3A). Især

ERGIC1

og

TMED3

viste sig at være stærkt til udtryk i kræft, men ikke i de ikke-maligne cellelinjer. Blandt de maligne cellelinjer

aim1

,

ERGIC1

, og

TMED3

blev mest udtrykt i VCAP, og

TPX2

i LNCaP celler. To siRNAs pr gen, valgt baseret på målet lyddæmpende effekt, blev udvalgt til valideringsundersøgelser (figur 3B og støtte Figur S2). Resultaterne fra 72 timer cellelevedygtighed og apoptose assay bekræftede antiproliferative effekt af

TMED3

TPX2

nedregulering i begge cellelinjer. Som forventet baseret på screening resultater,

ERGIC1

havde en rolle specifikt i ERG onkogen udtrykker VCap cellelevedygtighed. Men selv om aim1 siRNAs kunne sænke VCAP cellelevedygtighed, blev der ikke konsistente effekter observeret i LNCaP-celler (figur 3C). Den caspase 3/7 aktivitet blev forbedret primært som reaktion på

TPX2

og

TMED3

nedregulering i LNCaP celler, mens

TPX2

og ERGIC1 silencing induceret apoptose i VCAP celler med både siRNA’er (figur 3D).

A. MRNA ekspression af målgener i 6 prostatacancer (VCap, PC-3, MDA-PCa-2b, LNCaP, DU145 og 22Rv1) og 3 ikke-maligne (RWPE-1, Prec, EP156T) prostatacellelinjer. For hvert gen den relative mRNA-ekspression i RWPE-1-cellelinien blev sat til 1. B. Validering af target gendæmpning. MRNA-niveauet af hvert gen i kontrol prøven er sat til 100%. C. Effekten af ​​målgen lyddæmpning på VCAP og LNCaP cellernes levedygtighed på 72 timer tidspunkterne. D. Virkningen af ​​målgen silencing på induktion af apoptose i VCap og LNCaP-celler ved 72 timer tidspunkterne. Resultaterne er blevet sammenlignet med scrambled siRNA inducerede ændringer og betydningen af ​​de anti-proliferative og pro-apoptotiske virkninger er blevet angivet. KIF11 siRNA er blevet brugt som den positive kontrol.

aim1

,

ERGIC1

, og

TPX2

er stærkt udtrykt i Clinical prostatakræft prøver

Validering af target genekspression mønstre i kliniske prostata prøver bekræftede, at aim1 blev ERGIC1 og TPX2 mRNA-niveauer signifikant forhøjet i prostatakræft væv (n = 33), sammenlignet med ikke-maligne kontrol vævsprøver (n = 3). Alle cancer prøver udtrykt aim1 mRNA i højere niveauer end nogen af ​​de ikke-maligne prøver; mens ERGIC1 blev overudtrykt i 94% (n = 31), og TPX2 i 64% (n = 23) af kræft prøver. Men på trods af de lovende resultater af TMED3 ekspressionsmønstre i dyrkede prostata celler blev TMED3 mRNA udtryk på lige niveauer i ikke-maligne og kræft væv (Figur 4A). Til sammenligning blev mRNA-niveauer for nøglen prostatacancer onkogener AR og ERG også bestemt i de samme kliniske prøver, og resultaterne er præsenteret som en Heatmap i figur 4B. Ud af de fire mulige roman målgener,

ERGIC1

(R = 0,51) og

TMED3

(R = 0,69) ekspressionsmønstre korreleret mest markant med

AR

udtryk (figur 4C). Desuden, selv om ERGIC1 og TMED3 blev højt udtrykt i både ERG negativ og positiv prostatakræft, deres mRNA ekspressionsniveauer positivt korreleret med ERG ekspressionsniveauer i ERG positive prøver (P = 0,002 og P = 0,007 henholdsvis) (figur 4D). Sammenligning af target genekspression med kliniske parametre viste, at

aim1

korreleret signifikant (P = 0,03) med ung alder ( 60 år) (Figur 4E). Desuden høj

TPX2

udtryk korreleret med prostata-specifikt antigen (PSA) svigt (P = 0,02), og forbundet med høj WHO grad og ung alder (Figur 4F). Ingen sådanne foreninger blev fundet med ERG1C1 eller TMED3 mRNA-ekspression.

A. MRNA ekspression af målgener i 33 primær prostatacancer og 3 ikke-maligne prostata vævsprøver. Det betyder udtrykket ikke-maligne prøver er blevet sat som 1. B. Heatmap visualisering af gen-wise skalerede relative mRNA ekspression værdier for

aim1

,

ERGIC1

,

TMED3

,

TPX2

,

ERG

, og

AR

i 33 primære prostata cancer væv. Den Heatmap tegnes på grundlag af ukontrollerede hierarkisk klyngedannelse af udtrykket værdier. Relativ middelværdi ekspressionsniveau i normale kontrolprøver blev sat som 0. C. Co-ekspressionsmønstre mellem ERGIC1 og AR mRNA, samt TMED3 og AR mRNA i 33 primære prostatacancer prøver. D. Foreningen af ​​ERGIC1 og TMED3 mRNA udtryk med ERG mRNA ekspression i ERG positive primære prostata tumorer (n = 19). E. Relativ mRNA udtryk for

aim1

i primær prostatakræft prøver i forhold til patientens alder. F. Relativ mRNA udtryk for

TPX2

i primære prostatakræft prøver i forhold til forekomsten af ​​PSA fiasko, WHO tumor kvalitet og patientens alder.

aim1

,

ERGIC1

,

TMED3

, og

TPX2

er alle Reguleret af

ERG

Oncogene og androgener i dyrkede Prostata Cancer Cells

Til evaluere potentielle rolle ERG og AR i reguleringen af ​​disse prostatakræft cellevækst fremme gener, effekten af ​​

ERG

AR

lyddæmpning, samt androgen deprivation og stimulering på target-gen ekspression blev analyseret. Overraskende,

ERG

silencing faldt betydeligt mRNA ekspression af alle fire målgener i VCAP celler (figur 5A). Desuden

AR

lyddæmpning faldt mRNA ekspressionen af ​​

aim1

i LNCaP celler og

TPX2

i både VCAP og LNCaP celler, mens ekspressionen af ​​TMED3 mRNA blev forøget (figur 5B). Overraskende, selv om

ERG1C1

udtryk var forbundet med

AR

og AR drevet

ERG

udtryk i kliniske prostatakræft, blev der ikke observeret væsentlige ændringer i ekspressionen af ​​ERGIC1 mRNA-ekspression i respons på AR lyddæmpning. På trods af de forskellige virkninger af AR silencing på målgenekspression, androgen deprivation faldt og det syntetiske androgen R1881 inducerede ekspression af alle de målgener i LNCaP-celler i sammenligning med de ekspressionsniveauer påvist i androgen berøvet betingelser (figur 5C). Ekspressionen af ​​målgenerne blev også undersøgt i LNCaP derivater dyrket i stabil androgen ablerede betingelser efterligner kastrationsresistent tumorer. Resultaterne viser en signifikant stigning i aim1 ekspression i de ablerede celler i sammenligning med de parentale celler dyrket i normalt medium (figur 5D).

A. Effekten af ​​48 h

ERG

tavshed på ekspressionen af ​​målgener i VCap celler. B. Effekten af ​​48 h

AR

lyddæmpende på ekspressionen af ​​målgener i VCAP og LNCaP celler. C. Virkningen af ​​24 timer androgen deprivation og sekventiel 24 h androgen stimulation (10 nM R1881) på ekspressionen af ​​målgener i LNCaP-celler. D. Niveauet af mål-mRNA-ekspression i LNCaP-celler dyrket i normale medier (FBS) og i chargoal-strippet (CS-FBS) androgen ablateret medier. E. Effekten af ​​72 timer

TPX2

tavshed på proteinet udtryk for AR og PSA. β-actin er blevet anvendt som en loading kontrol. Den statistiske signifikans af resultaterne i forhold til at styre eksperiment er blevet angivet.

Tilsammen disse resultater tyder på, at ekspressionen af ​​de potentielle roman lægemiddelkandidater

aim1

,