PLoS ONE: Transketolase-Ligesom en Expression moduleres under Kolorektal Cancer Progression og Metastase Dannelse

Abstrakt

Baggrund

Transketolase-lignende 1 (TKTL1) inducerer glukose nedbrydning gennem anaerobe veje, selv i tilstedeværelse af ilt, begunstige den maligne aerobe glykolytisk fænotype karakteristisk for tumorceller. Som TKTL1 synes at være et gyldigt biomarkør for kræft prognose, formålet med den aktuelle undersøgelse var at korrelere sin udtryk med tumor fase, sandsynligheden for tumor tilbagefald og overlevelse, i en serie af patienter med tarmkræft.

Methodolody /vigtigste resultater

tumorvæv fra 63 patienter diagnosticeret med tyktarmskræft på forskellige stadier af progression blev analyseret for TKTL1 ved immunhistokemi. Farvning blev kvantificeret af beregningsmæssige billedanalyse, og sammenhænge mellem enzym udtryk, lokal vækst, lymfe-knude engagement og metastaser blev vurderet. De højeste værdier for TKTL1 udtryk blev påvist i gruppen af ​​scenen III tumorer, som viste signifikante forskelle fra de andre grupper (Kruskal-Wallis test,

P

= 0,000008). Dybere analyser af T, N og M klassifikationer afslørede en svag korrelation mellem lokal tumorvækst og enzym ekspression (Mann-Whitney-test,

P

= 0,029), en signifikant association af enzymet udtryk med lymfe-knude inddragelse ( Mann-Whitney test,

P

= 0,0014), og et betydeligt fald i TKTL1 udtryk forbundet med metastase (Mann-Whitney test,

P

= 0,0004).

konklusioner /betydning

Så vidt vi ved, har kun få studier undersøgt sammenhængen mellem variationer i TKTL1 udtryk i den primære tumor og metastase-dannelse. Her rapporterer vi nedregulering af enzym udtryk, når metastaser vises, og en korrelation mellem enzym udtryk og regionale lymfe-knude involvering i tyktarmskræft. Dette fund kan forbedre vores forståelse af metastaser og føre til nye og mere effektive behandlingsformer mod kræft

Henvisning:. Diaz-Moralli S, Tarrado-Castellarnau M, Alenda C, Castells A, Cascante M (2011) Transketolase- ligesom en Expression moduleres under Kolorektal Cancer Progression og Metastase Formation. PLoS ONE 6 (9): e25323. doi: 10,1371 /journal.pone.0025323

Redaktør: Michael Lisanti, Thomas Jefferson University, USA

Modtaget: August 24, 2010; Accepteret: September 1, 2011; Udgivet: 27 September, 2011

Copyright: © 2011 Diaz-Moralli et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af den regionale autonome regering i Catalonien (Generalitat) gennem “Agencia de gestio ad’juts Universitaris i de Recerca” (2009 SGR 849 og 2009 SGR 1308), Ministerio de Ciencia e Innovación-spanske regerings og den Europæiske Fond for Regionaludvikling (EFRU) “Una manera de hacer Europa” (SAF2010-19273 og SAF2011-25726), “Instituto de Salud Carlos III” gennem ISCIII-RTICC (RD06_0020_0046) og CIBEREHD, og ​​”Asociación Española contra el kræft” ( “Fundación Científica y Junta de Barcelona “). MC anerkender den modtagne støtte gennem prisen “ICREA Academia” for fremragende forskning, finansieret af ICREA fundament-Generalitat de Catalunya. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

tumorudvikling er forårsaget af en sekventiel akkumulering af genetiske og epigenetiske ændringer, der fører celler gennem en flertrinsproces, der gør sunde celler malign [1] – [4]. I hele denne proces, ændringer, som favoriserer dannelsen af ​​primære tumorer normalt adskiller sig fra de nødvendige tilpasninger til avanceret carcinogenese [5] – [7]. Carcinogenese indtræden skyldes deregulering af vækst celle-celle- og celle-matrix hæmmende interaktioner og akkumuleringen af ​​yderligere genetiske ændringer, der fører til aktivering af proto-onkogener og inhibering af tumorsuppressorgener [7], [8]. Efter disse tidlige begivenheder, skrider malign transformation, styret af en proces med darwinistisk udvælgelse hvorunder fænotyper, snarere end genotyper, udvælges. Dette giver tumorceller en fordel frem for ikke-transformerede celler. Denne udvælgelse af fænotyper, uafhængigt af de tilknyttede genotyper, er grundlaget for høj genetisk heterogenitet af cancerceller, da forskellige (EPI) genetiske mekanismer kan konvergere i lignende fænotyper [7], [9]. Et af de vigtigste fænotypiske karakteristika cancerceller er den aerobe glycolyse forbundet med forhøjet, men ineffektiv, ATP-produktion, samt høj produktion af NADPH og syrer (H

+), såsom lactat [10]. Dette fænomen, kendt som “Warburg effekten”, blev beskrevet af Otto Warburg i 1924 [11]. Den danner grundlag for positronemissionstomografi (PET), en teknik, der er almindeligt anvendt til at detektere ændringer i glucose forbrug hos cancerpatienter. Den høje glykolytisk sats er ikke begrundet i energiske krav, da mere end 80% af ATP-syntese i tumorceller sker gennem oxidativ fosforylering, og kun omkring 17% sker gennem Embden-Meyerhof-vejen (EMP). Disse andele svarer til dem, der findes i ikke-tumorceller [12]. På den anden side, NADPH-dannelse er vigtig for tumor-celle metabolisme, da det beskytter dem mod oxidativ stress og giver brændstof til forøget fedtsyresyntese karakteristisk for cancerceller. Endelig, lactat produktion og mikromiljø forsuring giver tumorceller en fordel i forhold raske celler, ved at øge deres invasionsevne og metastase [7], [13] – [16]. Overraskende, forsuring af miljøet er uafhængig af EMP, da der i glycolyse-nedsat celler dette fænomen er stadig observerbar [17], [18].

Ud over aerobe glycolysen, pentosephosphatvejen (PPP) er vigtig for tumorens metabolisme, da mere end 85% af ribosen er nødvendig for nukleinsyresyntese i tumorceller genereres direkte eller indirekte fra den ikke-oxidative gren af ​​PPP [19]. Derfor PPP ligger til grund for tumor stofskifte regulering. G6PDH og TKT, der styrer vejen, er nok til at forklare de grundlæggende metaboliske funktioner erhvervet af tumorceller i løbet af deres forvandling. Gennem PPP, celler ikke kun syntetisere nukleinsyre-forstadier nødvendige for at opretholde den fremskyndede proliferationshastighed karakteristisk ved cancer. G6PDH regulerer fluxen af ​​den oxidative gren hvorigennem NADPH syntetiseres og CO

2 frigives, hvilket fører til matrix forsuring af carbonanhydrase. Den thiamin-afhængige enzym TKT viser den højeste kontrol koefficient over ikke-oxidative gren af ​​vejen, afslører dens centrale rolle i reguleringen af ​​PPP [20], [21]. TKT er postuleret at forbinde PPP og EMP i kræftceller, så ilt-uafhængig glukose nedbrydning [22]. På den anden side har den rolle, TKT i tumor-celle metabolisme blevet understreget af rapporter om et signifikant fald i tumor-celle proliferation efter behandling med specifikke TKT hæmmere, både

in vitro

in vivo

[21] – [30]. Desuden, når TKT aktiveres ved tilsætning af dets cofaktor, thiamin, tumorvækst stimuleres [31].

En TKT og to transketolase-lignende gener (TKTL1 og TKTL2) er blevet beskrevet i det humane genom [32 ]. Dette fund førte til at undersøge ekspressionen af ​​alle tre enzymer i cancerceller og konkluderer, at TKTL1 var den eneste specifikt opreguleret i tumorer [33]. Efterfølgende undersøgelser viste, at TKTL1 er ansvarlig for omkring 60% eller 70% af transketolase aktivitet i humane hepatomaceller og colon-cancerceller [33] – [35] viser den vigtige rolle, som dette isoenzym i disse tumorer spillet. Det er blevet antaget, at TKTL1 kunne generere acetylCoA for fedtsyresyntese, hvilket ville forbinde anaerob glucose nedbrydning og lipogenese [32]. Desuden overekspression af enzymet er blevet rapporteret i flere tumorceller og -væv, fx i tyktarmen og urotelial kræft [33], [36], mavekræft [37], diverse gynækologiske kræftformer (æggestokkene, granulose celle i æggestokkene og livmoderhalsen) [38] – [40], brystkræft [41], [42 ], papillary skjoldbruskkirtlen karcinomer [43] og ikke-småcellet lungecancer [44]. Det er også påvist, at den specifikke inhibering af TKTL1 ekspression ved shRNA udløser apoptose og undertrykker tumorvækst [35]. Denne korrelation mellem overekspression af TKTL1 og tumorvækst, ringe overlevelse og tumortilbagevenden, ud med den transkriptionelle opregulering af enzymet ekspression forårsaget af promotor demethylering [45] førte Smith og kolleger at foreslå enzymet som en potentiel protoonkogen [46 ]. Endvidere er det også blevet foreslået, at TKTL1 inducerer den maligne aerob glycolytiske fænotype ved at øge fructose-6-phosphat og glyceraldehyd-3-phosphat, hvilket resulterer i forhøjede flusmidler til pyruvat og lactat [16], [46]. Ikke desto mindre, er der behov for en mere detaljeret undersøgelse af korrelationen mellem TKTL1 med tumor progression i kolorektal cancer, at belyse dets rolle i lymfe-knude hengivenhed og metastase. Desuden til dato billede kvantificering af enzym udtryk i væv er blevet udført af semikvantitative metoder baseret på ekspert observation og subjektiv vurdering [38], [47] at bevise behovet for en forbedring af evalueringssystemet, der tillader at opnå objektive resultater.

Her præsenterer vi et nyt billede analyse kvantificering metode til vurdering af immunostains der tillader os at undersøge, hvordan TKTL1 udtryk varierer med progression etape i en serie af kolorektale karcinomer. Prøver er inddelt i fire grupper eller stadier af progression (I-IV) i henhold til amerikanske Blandede Cancer (AJCC) iscenesættelse manual (sjette udgave), der tager hensyn til transmural forlængelse, lymfeknude engagement og tilstedeværelse af fjernmetastaser. Mulige sammenhænge mellem TKTL1 udtryk og tumorprogression udforskes, for at bestemme dens rolle under tumor udvikling.

Resultater

Patienter

Angivelse af TKTL1 blev analyseret ved immunhistokemi i 63 patienter med primær kolorektal cancer (CRC). Demografiske, kliniske og tumorrelaterede egenskaber er anført i tabel S1 og tabel S2. Efter en median opfølgning på 49 måneder havde 26 patienter døde.

immunhistokemisk påvisning af TKTL1 udtryk

Primære tumorer inkuberet med anti-TKTL1 antistof viste signifikant mærkning, mens kontrolprøver ikke viste enhver uspecifik mærkning (figur 1 og figur 2). Levene og Cochrand tests ikke fastslå, at vores data normalt fordelte (resultater ikke vist), så vi udførte parametriske tests for at vurdere betydningen af ​​forskellene. Ved at anvende Mann-Whitney U eller Kruskal-Wallis test, bekræftede vi, at TKTL1 ekspression ikke var køns- eller aldersbetinget (resultater ikke vist). Klinisk-patologisk og immunhistokemiske data er sammenfattet i tabel S1.

Disse farve mikrofotografier afslører cytoplasmatisk immunhistokemisk farvning (brune aflejringer) for transketolase-lignende 1 (TKTL1) i kolorektale tumorer (original forstørrelse × 200). I den højre kolonne (E-H) der er farvede væv på forskellige stadier af progression og i venstre spalte (A-D) homologe områder i negative kontroller. Farvning for TKTL1 kan observeres i alle positive prøver, hvilket indikerer dens udtryk i tumorvæv; den højeste intensitet detekteres i fase III prøver.

Disse monokromatiske mikrofotografier blev analyseret med ImageJ software til at kvantificere immunfarvning og evaluere TKTL1 udtryk (original forstørrelse × 200). I den højre kolonne (E-H) er farvede væv på forskellige stadier af progression og i venstre kolonne (A-D) homologe områder i negative kontroller.

TKTL1 variationer i henhold til tumor stadie

udtryk for TKTL1 varierede: 1,8-26,4 au (Gennemsnit, 13,3 ± 7,9) i fase I tumorer, 4,0-37,3 A.U. (Gennemsnit, 20,8 ± 9,9) i fase II, 17,3-50,0 A.U. (Gennemsnit, 32,9 ± 11,5) i fase III og 3,7-41,3 A.U. (Gennemsnit, 13,7 ± 8,7) i trin IV (figur 3A). Disse data viser, at ekspressionen af ​​TKTL1 i fase III tumorer var højere end i nogen anden fase (Kruskal-Wallis test,

P

= 0,00003, figur 3B). Men en prøve (id. # 7118) viste et unormalt højt værdi (41,3) sammenlignet med resten af ​​prøverne i denne gruppe. Den Dixons Q-test identificeret denne værdi som en outlier med et konfidensniveau på 99,9%, og derfor blev det udelukket fra analysen. Efter udelukkelsen af ​​denne prøve, TKTL1 udtryk i fase IV tumorer varierer fra 3,7 til 20,8 A.U. (Gennemsnit, 12,0 ± 5,1) og ekspressionen af ​​TKTL1 i fase III tumorer blive endnu mere forskellige (Kruskal-Wallis test,

P

= 0,000008).

Disse diagrammer viser udtryk for transketolase- ligesom en (TKTL1) i CRC analyserede væv, divideret med grupper efter deres fase af progression. (A) Hvert punkt svarer til en prøve. I trin IV gruppen korset repræsenterer en outlier. Gennemsnit er markeret med en vandret sort streg i hver gruppe. (B) Denne boks-og-knurhår plot viser forskellene mellem grupperne. Den outlier af stadie IV gruppe er repræsenteret ved en sort firkant. Stage III gruppe er signifikant forskellig fra resten af ​​grupperne (Kruskall-Wallis test,

P

= 0,000008).

TKTL1 udtryk i trin III tumorer var signifikant højere end på noget andet progression fase. Desuden, når betragtet hver for sig, viste næsten hver enkelt etape væsentligt forskellige værdier for TKTL1 udtryk fra både den tidligere og den efterfølgende etape: fase I viste en tendens til at være lavere end fase II (Mann-Whitney U test,

P

= 0,06). Enzym udtryk i fase II tumorer var signifikant lavere end i fase III tumorer (Mann-Whitney test,

P

= 0,02) og fase III værdier var væsentligt højere end for trin IV (Mann-Whitney U test,

P

= 0,000003).

Sammenhæng mellem tilstedeværelse af fjernmetastaser og tumor TKTL1 udtryk

der blev observeret en stærk nedgang i primær tumor TKTL1 udtryk hos patienter, som præsenteres med fjernmetastaser. Faktisk prøver fra patienter uden metastaser (M0) udstillet udtryk værdier mellem 1,8 og 50,0 A.U. (Gennemsnit 23,5 ± 12,4), mens værdier for prøver fra patienter, som udviklede fjernmetastaser (M1) varierede fra 3.7 til 20.8 A.U. (Gennemsnit 12,0 ± 5,1) (Mann-Whitney U test,

P

-værdi = 0,0004) (figur 4A). Under hensyntagen til forskellene mellem M0 (ikke-metastatisk) og M1 (metastatisk) tumorer, vi udførte følgende sammenligninger kun for prøver fra M0 gruppen.

Disse Søjlediagrammerne viser overensstemmelsen mellem transketolase-lignende 1 ( TKTL1) udtryk og tumor klassificering værdier. (A) Tumor TKTL1 udtryk i patienter, der ikke præsentere med fjernmetastaser (M0) er betydeligt højere end udtrykket hos patienter, som havde udviklet metastaser (M1) (Mann-Whitney U test,

P

= 0,0004) . (B) Hos patienter, som ikke havde udviklet metastaser, udtryk for TKTL1 tendens til at være lavere i fase tumorer tidligt i forhold til transmural invasion (T1-2) end i mere avancerede tumorer (T3-4) (

P

= 0,029, Mann-Whitney U-test). (C) Lymfeknude invasion korrelerer med en stigning i TKTL1 udtryk i den primære tumor (Mann-Whitney U test,

P

= 0,0014).

TKTL1 involvering i tumor progression

med hensyn til transmural progression, stage tumorer tidligt (T1 og T2) præsenterede TKTL1 ekspressions-værdier mellem 1,8 og 45,5 au (Gennemsnit 16,5 ± 12,6), mens ekspression af enzymet i mere avancerede primær tumor (T3 og T4) varierede fra 4.0 til 50,0 A.U. (Gennemsnit 25,5 ± 11,8). Disse data viser en svag stigning i TKTL1 udtryk, når den lokale udvikling af tumor stiger (Mann-Whitney U test,

P

= 0,029, figur 4B).

TKTL1 udtryk i prøver uden regional lymph- node involvering (n0) varierede fra 1,8 til 37,3 au (Gennemsnit 18,6 ± 9,8), mens de tilsvarende værdier for dem med regionale lymfe-knude involvering (N1 og N2) varierede fra 17,3 til 50,0 A.U. (Gennemsnit 32,9 ± 11,5) (Mann-Whitney U test,

P

= 0,0014) (figur 4C).

TKTL1 udtryk og overlevelse

univariate Kaplan-Meier analyse gjorde ikke afsløre signifikant sammenhæng mellem TKTL1 farvning og overlevelse i CRC vævsprøver (Mantel-Cox log-rank test,

P

= 0,37) (figur 5A). På den anden side, opstår, når behandlingen anses forskelle. Vores data viser en signifikant sammenhæng mellem TKTL1 udtryk og overlevelse hos patienter behandlet med 5-fluoroacyl (Mantel-Cox log-rank test,

P

= 0,017) (figur 5B), er denne sammenhæng ikke observeret i ubehandlede patienter (Mantel-Cox log-rank test,

P

= 0,993) (figur 5C).

(A) Kaplan-Meier plot korrelerer TKTL1 udtryk og overlevelse hos patienter med ikke-metastaserende CRC. (B) Kaplan-Meier plot korrelerer TKTL1 udtryk og overlevelse i ubehandlede patienter. (C) Kaplan-Meier plot korrelerer TKTL1 ekspression og overlevelse hos patienter med CRC behandlet med 5-fluoroacyl. Solid linje repræsenterer dem med TKTL1 udtryk under middelværdien, og stiplede linje repræsenterer dem med TKTL1 udtryk over middelværdien for hver gruppe.

Validering af billedet analyse baseret immunfarvning kvantificering metode

til validering af billedanalyse kvantificering metode blev 5 prøver, der tilhører fase i, II og III i progression, og med forskellige TKTL1 ekspressionsniveauet analyseret af western blot. Immunodetektion af TKTL1 og actin som ladningskontrol viste en klar korrelation mellem TKTL1 ekspression bestemt ved western blot og ved immunohystochemical analyse (figur 6).

TKTL1 protein og actin blev analyseret ved western blot ved anvendelse af specifikke monoklonale antistoffer. TKTL1 /Act repræsenterer kvantitativ analyse af TKTL1 korrigeret af actin. TKTL1 IHC er udtryk værdier af TKTL1 bestemt ved immunohystochemical analyse. Alle kræft prøve 5 tyktarm homogenater analyserede Vis lignende udtryk værdier for TKTL1 i begge analyser.

Diskussion

Der er registreret Udtrykket af TKTL1 og korreleret med flere former for kræft hidtil . De fleste af forfatterne rapportering disse korrelationer følge en protokol analog med den beskrevet i den aktuelle papir under anvendelse af samme antistof og kit til immunologisk farvning. Men til dato evalueringen af ​​immunfarvning var unøjagtige, da det er blevet udført at anvende en semikvantitativ system baseret på tildeling af scoringer af observatører. Den nuværende manuskript beskriver en ny og mere objektivt system at kvantificere farvning gennem beregningsmæssige billedanalyse. Denne teknik muliggør opnåelse af kvantitative data fra immunohystochemical farvning fører til en mere præcis vurdering af enzymekspression. Derfor den rapporterede metode er afsløret som et virkelig stærkt værktøj til immunohystochemical kvantificering af protein udtryk, der giver objektive numeriske data i stedet for vilkårlige scoringer.

Vores resultater dokumenterer, at TKTL1 udtryk i primær kolorektal cancer er stærkt korreleret med tumor progression . Kapaciteten til at nedbryde glucose under anaerobe betingelser er kritisk for tumorvæksten, især da den primære tumor ekspanderer og de interne celler føres bort fra basalmembranen og deres iltforsyning. I denne situation, TKTL1 overekspression indebærer en fordel for maligne celler og giver dem mulighed for at vokse hurtigere. Vores data viser, at TKTL1 udtryk korrelerer stærkt med lokal progression (T) og regional lymfeknude hengivenhed (N). Det er første gang, at sammenhængen mellem TKTL1 udtryk og N klassifikation er blevet rapporteret i CRC. Endvidere viser vi, at korrelationen er stærkere end mellem TKTL1 ekspression og T klassificering (figur 4B og C), hvilket indikerer, at virkningen af ​​enzymet forøges tumoren skrider frem. Denne opførsel er konsistent med den konklusion, at overekspression af TKTL1 favoriserer anaerob metabolisme af glucose, øget lactat produktion og inducere miljøet forsuring, der forbedrer lokal invasionsevne. Selvom vores data ikke afslører nogen signifikant sammenhæng mellem tumor TKTL1 farvning og patient overlevelse, den univariate Kaplan-Meier analyse afbildet i figur 5A vil have tendens til at foreslå, at en større prøve kan afsløre en signifikant sammenhæng. Selv antallet af prøver er lille, korrelation mellem TKTL1 ekspression og overlevelse hos patienter, som får kemoterapi synes klart. Den observerede korrelation antyder, at 5-fluoroacyl kan være effektiv i behandling af tumorer med høje niveauer af TKTL1, dem med en høj grad af lokal progression (Figur 5B). Men kemoterapi ikke viser nogen effekt på overlevelse af patienter med tumorer, der indeholder lave niveauer af enzymet, de mest metastatiske dem (figur 5C). Disse data antyder, at TKTL1 niveauer kunne være en potentiel biomarkør til forudsigelse tumor respons på kemoterapi.

Den nuværende undersøgelse viser også en anden interessant opdagelse, den meget signifikant fald i TKTL1 ekspression observeret ved sammenligning ikke-metastatiske patienter (M0) med metastatiske dem (M1). Denne nedregulering af enzymet, når metastaser opstår, ligesom sammenhængen med de regionale lymfe-knude engagement, er ikke blevet rapporteret før. Det er første gang, at ekspressionen af ​​TKTL1 er blevet korreleret med tumor staging og metastase-dannelse i CRC. Interessant, har lignende adfærd blevet beskrevet i forekomsten af ​​muterede

ras

i CRC: forekomsten af ​​mutation stiger fra ca. 7% i begyndelsen af ​​adenom til ~55% i mellemliggende og til -60% i slutningen af ​​karcinomer, men falder til ~45% i invasive karcinomer, hvilket indikerer en implikation af denne mutation i celle aggressivitet, men ikke i metastaseret celler [7], [48].

reguleringen af ​​TKTL1 udtryk i tumorceller er stort set uudforsket, men det er blevet foreslået, at den kunne opreguleret i respons på hypometylering [46]. Mekanismen ansvarlig for den globale demethylering i cancerceller forbliver ukendt, selv om Ras familiemedlemmer er blevet impliceret i reguleringen af ​​methylering [49] – [52]. I de fleste tilfælde har Ras-signalering været relateret til hypermethylering og inhibering af tumorsuppressorgener. Det har imidlertid også været relateret til demethylering i nogle undersøgelser [53] – [56]. Her foreslår vi en ny rolle for Ras-signalering i tumor transformation, der består af aktivering ved hypometylering forskellige onkogener, herunder TKTL1 i CRC.

Især har Ras superfamiliemedlemmerne været impliceret i reguleringen af ​​aerob glykolyse ved stigende glukoseoptagelse og 6-phosphofructo-2-kinase /fruktose-2,6-bisphosphates 3 (PFKFB3) udtryk [57] – [59]. PFKFB3 aktivitet bevirker akkumulering af fructose-2,6-bisphosfate (F26BP) og den efterfølgende opregulering af 6-phosphofructo-1-kinase (PFK-1) aktivitet, hvilket til sidst fører til forhøjet produktion af lactat. Den metaboliske substrat for PFKFB3 og PFK-1 reaktioner, som er afgørende for laktat produktion, er fructose-6-fosfat (F6P), et af de produkter af TKTL1. Endvidere TKTL1 overekspression begunstiger normoxisk stabilisering af malignitet-fremmende transkriptionsfaktor hypoxi-inducerbar faktor-1α (HIF-1α) [16], og opregulering af downstream glycolytiske enzymer såsom glucose transporter 1 (GLUT1) og PFKFB3 [16], [ ,,,0],60]. Som vi har set, TKTL1 spiller en vigtig rolle i pyruvat og lactat produktion via sin endelige produkter, fructose-6-phosphat og glyceraldehyd-3-phosphat. Eftersom pyruvat og lactat regulere hypoxi-inducerbar genekspression og inaktivere HIF-1α henfald [61], [62], TKTL1 overekspression kan stimulere akkumuleringen af ​​HIF-1α i en hypoxisk-uafhængig måde og fremme ekspressionen af ​​HIF-1 -regulated gener involveret i glykolytisk stofskifte, angiogenese og celle overlevelse.

kort sagt, under carcinogenese debut, kunne mutationer i Ras medlemmer ophobes og føre til TKTL1 promotor demethylering og aktivering af sit udtryk. Dette fænomen vil blive valgt, fordi TKTL1 aktivitet ville tillade transformerede celler til at forbruge glukose i fravær af ilt, producerer lactat og forsure deres mikromiljø, hvilket vil styrke sin invasiv. TKTL1 kan også føre til hypoxisk-uafhængig HIF-1α stabilisering og den efterfølgende overekspression af flere glycolytiske og angiogene gener, der giver en passende miljø for tumorprogression. Vedrørende metastasedannelse to mulige mekanismer kan forklare observerede data: i) TKTL1 overekspression ikke blot føre til tumorprogression, men også kunne muliggøre metastasedannelse, og når metastase er etableret, TKTL1 ikke længere nødvendig, og ligesom forekomsten af ​​muterede

ras

, det falder. ii) TKTL1 er nødvendig for tumor progression in situ og lokal invasiv, men tumorer, der ikke har overekspression enzymet er i stand til at vokse i sin lokale miljø og inducere metastatiske adfærd som en tumor overlevelsesstrategi gennem et darwinistisk udvælgelsesproces.

Denne rapport belyser rolle TKTL1 i tumor progression, og sigter mod at være det første skridt i retning af en ny tilgang til studiet af metastaser og kræftbehandling.

Materialer og metoder

etik Statement

etik godkendelse til undersøgelsen blev opnået fra den etiske komité på Hospital Clinic i Barcelona, ​​skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter og alle kliniske undersøgelser er blevet udført i henhold til principperne i erklæringen fra Helsinki.

Patienter

i den aktuelle undersøgelse, 46 mænd og 17 kvinder (70 ± 11 år) med colorectal carcinom (CRC), der blev opereret mellem november 2000 og oktober 2001, inkluderet. Ifølge TNM klassifikation af tyktarmen og endetarmskræft af amerikansk fælles udvalg om kræft (AJCC), 9 patienter præsenteret med fase I tumorer, 21 med trin II, 16 med stadium III og 17 med stadie IV.

Alle patienter blev rekrutteret ved Gastroenterology Institut Hospital Clinic i Barcelona, ​​og var en del af EPICOLON projekt, et prospektivt, multicenter, landsdækkende, blev befolkning-baseret undersøgelse med henblik på oprettelse af forekomsten og egenskaber nedarvede og familiære kolorektal cancer former i Spanien [63]. I dette projekt blev alle nydiagnosticerede CRC patienter i enhver deltagende center i løbet af et år indgår i undersøgelsen.

Efter kirurgisk resektion, patienter gennemgik standard terapeutiske og opfølgende foranstaltninger i overensstemmelse med anbefalede retningslinjer. Faktisk var postoperativ adjuverende behandling med 5-fluorouracil og leucovorin rutinemæssigt gives til patienter med stadie II og III tumorer og strålebehandling blev indiceret til patienter med endetarmskræft. Postoperativ overvågning bestod af sygehistorie, fysisk undersøgelse, og laboratorieundersøgelser, herunder serum carcinoembryonisk antigen (CEA) niveauer hver tredje måned, abdominal ultralyd eller computertomografi hvert halve år, og røntgenundersøgelse af thorax og total koloskopi gang om året. Desuden blev alle tumor gentagelser fundet under opfølgningen histologisk bekræftet.

immunhistokemisk farvning

Umiddelbart efter kirurgisk resektion, tumorer var snap-frosne og opbevares i flydende nitrogen. Til udførelse af farvning blev opnået CRC dele med vibrotom udskæringer, blev udtørret at forhindre nedbrydning og holdes ved omgivelsesbetingelser laboratorieforhold indtil anvendelse.

endetarmskræft prøver blev skåret i sektioner på 2 til 5 um, placeret på objektglas og fikseret med paraformaldehyd. Objektglassene blev hydreret ved at skylle dem i faldende koncentrationer af ethanol. For antigen demaskerende Prøverne blev opvarmet til 65 ° C aprox. i 10 mM natriumcitratbuffer (pH 6,0) i 5 minutter. Efter skylning i destilleret H

2O, inhibering af endogen peroxidase blev udført med en 10 minutters inkubation med 3% H

2O

2. Objektglas blev vasket med PBS og inkuberet med 3% BSA i PBS i 15 minutter for at blokere uspecifik farvning. Bagefter blev snit inkuberet med et monoklonalt muse-anti-TKTL1 antistof (klon JFC12T10) tidligere beskrevet af Coy [32] ved en koncentration på 4 pg ml

-1 i 60 minutter i et fugtigt kammer ved stuetemperatur. Efterfølgende blev objektglassene vasket med PBS, inkuberet med biotinyleret anti-muse immunglobuliner (Biotinyleret Link, LSAB + -kit, DakoCytomation, Hamborg, Tyskland) i 25 min, og efter en ny vask med PBS, behandlet med streptavidin-peroxidase (Streptavidin-HRP , LSAB + -kit, DakoCytomation, Hamburg, Tyskland) i 25 min mere. Endelig prøver blev inkuberet med 3-3′-diaminobenzidin (DAB + kromogen, DakoCytomation, Hamburg, Tyskland) i 20 minutter ved stuetemperatur til opnåelse af farvning.

TKTL1 ekspression blev vurderet med billedanalyse under anvendelse af et Leica DM 4000 B mikroskop (Leica Microsystems, Tyskland), en monokromatisk IEEE-1394 CFW-1312M kamera (Scion Corporation, Frederik, MD, USA) og det offentlige domæne NIH Imaging software program ImageJ, tilgængelig via internettet fra URL: http: //rsbweb .nih.gov /ij /. Intensiteten blev målt som “relativ intensitet /område” og kvantificeres ved interpolation i en kalibreringskurve plottet under anvendelse af en gråskala. For hver prøve 3 eller 4 billeder fra forskellige områder blev indfanget og farvningen af ​​en homolog område med en negativ kontrol, inkuberet med 3% BSA i PBS uden anti-TKTL1 antistof blev subtraheret. Værdier er præsenteret som “Relativ værdi × 1000” arbitrære enheder (A.U.). Denne form for Informatik kvantificering af farvningen kræver 8-bit monokromatiske billeder (figur 2) og kvantificerer grå intensitet inden en kalibrering skala [64], [65] giver en evaluering af TKTL1 udtryk, der giver meget mere objektive sammenligninger mellem prøver end klassificeringer af tilfældige scoringer.

protein Extraction

Samlet protein blev renset 6-19 mg af frosne kirurgiske prøver. Prøver blev sonikeret ved 4 ° C med en titanium probe i lysepuffer indeholdende 20 mM HEPES pH 7,5, 10% (vol /vol) glycerol, 0,4 M NaCl, 0,4% (volumen /volumen) Triton X-100, 10 mM EGTA, 5 mM EDTA, 25 mM NaF, 25 mM Na p-glycerophosphat, 1 mM DTT, 1 × proteasehæmmere, 0,4 mM Pefabloc SC og 20 ug /ml pepstatin. Efter sonikering prøver blev centrifugeret ved 4 ° C og 16.000 rcf i 20 minutter.