PLoS ONE: MIR-200C Øger radiosensitivitet af ikke-småcellet lungekræft cellelinje A549 ved Målretning VEGF-VEGFR2 Pathway

Abstrakt

MikroRNA’er (miRNA) har vist sig at deltage i mange vigtige cellulære processer herunder radiosensibilisering. VEGF familie, en vigtig regulator af angiogenese, spiller også en afgørende rolle i reguleringen af ​​kræftcellen radiosensitivitet. VEGFR2 medierer de store vækst- og permeabilitet aktioner af VEGF i en parakrin /autokrin måde. MIR-200c, på sammenhængen af ​​epitelial-mesenkymale overgang (EMT), forventes at målrette VEGFR2. Formålet med denne undersøgelse er at teste hypotesen om, at reguleringen af ​​VEGFR2 vej af miR-200C kunne modulere radiosensitivitet af kræftceller. Bioinformatisk analyse, luciferase reporter assays og biokemiske assays blev udført for at validere VEGFR2 som et direkte mål for MIR-200C. De strålingssensibiliserende virkninger af MIR-200c på A549-celler blev bestemt ved klonogene assays. Den nedstrøms reguleringsmekanisme af MIR-200C blev undersøgt med western blotting assays, FCM, kanaldannelse assays og migration assays. Vi identificerede VEGFR2 som en ny mål for miR-200c. Den ektopisk miR-200C forøgede radiosensitivitet af A549 mens miR-200C nedregulering faldt det. Desuden har vi bevist, at miR-200c radiosensitized A549 celler ved at målrette VEGF-VEGFR2 vej specifikt, hvilket fører til hæmning af sin nedstrøms pro-overlevelse signalering transduktion og angiogenese, og tjener som et potentielt mål for radiosensitizition forskning.

citation: Shi L, Zhang S, Wu H, Zhang L, Dai X, Hu J, et al. (2013) MIR-200C Øger radiosensitivitet af ikke-småcellet lungekræft cellelinje A549 ved Målretning VEGF-VEGFR2 Pathway. PLoS ONE 8 (10): e78344. doi: 10,1371 /journal.pone.0078344

Redaktør: Junming Yue, The University of Tennessee Health Science Center, USA

Modtaget: Juli 3, 2013; Accepteret: September 11, 2013; Udgivet: 30 oktober 2013

Copyright: © 2013 Shi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Hubei Provincial Natural Science Foundation projekt (No: 2009CDA061). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Patienter lidt fra ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) tegner sig for ca. 85% af alle tilfælde lungekræft [1], [2]. Strålebehandling (RT) er en kraftig modalitet udbredt i klinikken mod kræftceller. Men mange af dem udviser iboende eller erhvervet radioresistance til RT fører til behandlingssvigt [3]. Akkumulerende beviser for, at radioresistance er ikke kun af iboende egenskaber, men et resultat af interaktioner mellem kræftceller og microenvironment faktorer. Den parakrine /autokrin rolle vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) ved binding til dets receptorer er en vigtig komponent i tumormikromiljøet og dens selvregulering. Undertrykkelse af VEGF-genekspression kan øge radiosensitivitet af cancerceller [4], [5]. Og VEGFR2 anses normalt for at mægle hovedfunktionen tilskrives VEGF. Strålebehandling kombineret med VEGFR2 og EGFR blokade forårsagede en betydelig forøgelse af antitumor virkninger i en ortotopisk model for lungekræft [6]. Molekylær hæmning af VEGFR2 kan øge tumor stråling reaktion ved hjælp af molekylær målretning af tumorvaskulatur [7]. Så parakrin signalering fra vært VEGF til kræftcelle VEGFR2 kan være en væsentlig del af RT fiaskoer [8].

MikroRNA’er (miRNA) er en gruppe af små ikke-kodende RNA, som undertrykker deres mål udtryk ved at binde til 3 ‘utranslaterede region (3’UTR). En undersøgelse, der er konstateret rottelunge-specifikke miRNA af miRNA microarray afslørede, at MIR-200C udtrykt specifikt i normale rotter lungevæv [9]. Og tab af miR-200C udtryk kunne fremkalde en aggressiv, invasive og kemoterapi fænotype i ikke-småcellet lungecancer [10]. Desuden viste uafhængige undersøgelser, at restaurering af miR-200C kunne øge følsomheden over for kemoterapeutiske stoffer i forskellige tumorer [11], [12]. Så gør miR-200c spille en lignende rolle i strålebehandling af ikke-småcellet lungekræft?

Bioinformatik analyse viste, at VEGFR2 var en god forudsagt mål for miR-200C med to bindingssteder. I dette eksperiment undersøgte vi, om VEGFR2 kunne reguleres af MIR-200c, hvilket fører til modulering af radiosentivitiy af A549-celler.

Resultater

VEGFR2 er et direkte mål for MIR-200C

Bioinformatik analyse afslørede, at VEGFR2 (vaskulær endotel vækstfaktor receptor 2) er en forudsagt mål for mIR-200C, som direkte kan inhibere dets gen-ekspression (fig. 1A). A549-celler blev transficeret med MIR-200C efterligner (50 nM) eller MIR-200C-inhibitorer (100 nM) til at øge eller mindske MIR-200C-ekspression. Efterligner kontroller (50 nM) eller inhibitorer kontroller (100 nM) blev transficeret ind A549 celler som negative kontroller. Realtime PCR viste, at miR-200C efterligner og miR-200C-hæmmere i væsentlig grad kan øge eller mindske miR-200C udtryk for A549 (data ikke vist). For yderligere at bekræfte, om miR-200c direkte kunne binde sig til 3’UTR af VEGFR2, vi udført dobbelt luciferasereportergen under anvendelse pLuc-VEGFR2-3’UTR plasmid i A549 celler. Forbigående transfektion af A549 celler med pLuc-VEGFR2-3’UTR plasmid og miR-200C efterligner førte til et signifikant fald i luciferase aktivitet sammenlignet med kontrollerne (fig. 1B). For at undersøge, om miR-200c kan påvirke VEGFR2 proteinekspression i A549 celler, vi udført vestlige bolt analyser og fandt, at miR-200C efterligner reducerede protein udtryk for A549 væsentligt i forhold til kontrollerne (fig. 1C).

(A) miR-200C target stedet resterne ved 3′-UTR af gen VEGFR2 inspiceres af bioinformatik. (B) The pLuc-VEGFR2-3’UTR konstruktionen indeholder en vildtype-sekvensen af ​​3’UTR of VEGFR2. Den pLuc-VEGFR2-3’UTR konstruktion blev co-transficeret med MIR-200C efterligner i A549-celler. Luciferaseaktivitet blev detekteret 48 timer efter transfektion. Og forholdet mellem normaliseret luciferase værdi vises. (C) VEGFR2 proteinekspression i A549-celler blev målt ved Western blot 48 timer efter transfektion. Hvert eksperiment blev gentaget tre gange. Standardfejl af middelværdien er vist ved fejlsøjler. * Angiver p. 0,05 sammenlignet med kontrolgruppen

MIR-200C Efterligner Øget radiosensitivitet af A549 celler, mens miR-200C hæmmere Nedsat Det

For at undersøge om miR-200c påvirket celle radiosensitivitet blev A549-celler transficeret med mIR-200C efterligner eller inhibitorer. Colony overlevelse analyser, en guld standard for radiosensitivitet estimering, blev vurderet efter 0-8 Gy stråling. Transfektion af A549 celler med miR-200C efterligner (50 nM) faldt betydeligt celle overlevelse efter stråling eksponering (SER

0,5 1,47, fig. 2A). Omvendt transfektion af A549-celler med MIR-200C-inhibitorer (100 nM) forårsagede en signifikant forøgelse af celleoverlevelse efter 0-8 Gy stråling sammenlignet med kontrollerne (SER

0,5 0,79, fig. 2B).

Overekspression af mIR-200C (A) forøgede radiosensitivitet af A549-celler til IR behandling, mens mIR-200C inhibering (B) viste den modsatte virkning. SI-VEGFR2 konstruere inhiberede VEGFR2 proteinekspression 48 timer efter transfektion (C), hvilket resulterer i radiosensibilisering af A549-celler (D). Efterligner kontrol, inhibitorer kontrol og siRNA kontrol blev transficeret ind A549-celler henholdsvis som negativ kontrol. De klonogene overlevelse assays blev gentaget tre gange med lignende resultater. Standard fejl middelværdien er vist med fejl barer.

VEGFR2 knockdown blev gjort ved RNA-interferens hjælp lipo2000 transfektion reagens. Kolonioverlevelse assay viste knockdown af VEGFR2 proteinekspressionsniveauer (fig. 2C) resulterede i en stigning i radiosensitivitet af A549 (SER

0,5 1,34) (fig. 2D).

VEGF Neutralisering afskaffet radiosensibilisering virkning af mIR-200C

Vi undersøgte variationen af ​​VEGF secreation i det ekstracellulære medium efter ektopisk mIR-200C-ekspression under anvendelse af VEGF ELISA-assay. Og ingen væsentlige ændringer af VEGF secreation følgende miR-200C indgreb er blevet bevist efter duplikerede tests (Fig. 3A). Bevacizumab (Bev, 1 mg /ml), en VEGF-specifik blokerende monoclony antistof, blev derefter tilsat til dyrkningsmediet af A549-celler at falde ekstracellulær VEGF koncentration 1 time før transfektion. Kolonioverlevelse assays blev udført for at undersøge den radiosensibilisering effekt af MIR-200C med eller uden VEGF neutralisering. Resultaterne viste, at MIR-200C ikke kunne falde post-stråling overlevelse fraktion uden VEGF-induceret aktivering (fig. 3B).

(A) Elisa assay blev anvendt til at påvise VEGF-sekretion ændringer efter transfektion af miR- 200C efterligner i A549-celler. Bevacizumab (B) og su1498 (C) blev anvendt til at blokere VEGF-VEGFR2-vejen. Så klonogene assays blev udført for at undersøge strålingssensibilisering effekt af miR-200C efter VEGF-VEGFR2 blokering. Hvert eksperiment blev gentaget tre gange. Standard fejl middelværdien er vist med fejl barer.

VEGFR2 blokering afskaffet radiosensibilisering Effekt af miR-200C

VEGFR2 blev blokeret af su1498, en tyrosin kinase inhibitor af vaskulær endotel vækst factor receptor 2 (VEGFR2). Su1498 blev tilsat i vækstmediet af A549-celler til en endelig concerntration af 5 uM en time før transfektion. Klonogene assays blev udført for at få adgang overlevelsen af ​​A549-celler efter forskellige doser af stråling. Resultaterne viste, at rdiosensitization af VEGFR2 inhibering blev signifikant blokeret af inhibering VEGFR2 pathway (fig. 3C). Så miR-200C forøgede radiosensitivitet af A549 hovedsageligt ved at målrette VEGFR2 vej.

MIR-200C hæmmede Aktivering af ERK1 /2 og Akt

For yderligere at undersøge, om de nedstrøms signaltransduktionsveje af VEGFR2 var involveret i radiosensibilisering af A549, vi undersøgte MAPK og AKT-veje, der var de vigtigste downstream pro-overlevelse veje for VEGFR2. A549-celler blev transficeret med MIR-200C efterligner eller inhibitorer. Derefter undersøgte vi ekspressionsniveauet og aktivering af ERK1 /2 og Akt som er de effecter molekyler af MAPK og AKT pathway. Sammenlignet med celler behandlet med efterligner kontroller, aktiveringen af ​​ERK1 /2 og Akt angivet med p-ERK1 /2 og p-Akt var signifikant nedreguleret i A549-celler behandlet med MIR-200C efterligner (Fig. 4). Tværtimod MIR-200C-inhibitorer øgede aktivering af ERK1 /2 og Akt sammenlignet med inhibitor kontroller. Disse data antyder, at aktivering af ERK1 /2 og Akt modulere radiosensibilisering effekt af MIR-200c (fig. 4).

Ektopisk ekspression af MIR-200C inhiberede phosphorylering af Akt og ERK1 /2, inhibering af miR- 200c øget aktivering af Akt og ERK1 /2-vejen. Hvert forsøg blev gentaget tre gange.

MIR-200C Hæmmet angiogenese og Migration af HUVEC Celler

Vi undersøges yderligere, at uanset om miR-200c, en direkte regulator af VEGFR2, kunne regulere angiogenese af endotelceller. 48 timer efter transfektion blev HUVEC-celler udsultet natten over og podet i plader med 96 brønde, der blev præ-coatet med Matrigel. Efter inkubation i 16 timer, viste MIR-200C-transficerede celler en væsentlig forringelse af formationen rør evne. Desuden, nedregulering af VEGFR2 ved si-VEGFR2 kunne også inhibere angiogenese af HUVEC-celler. Da migration er et vigtigt skridt af angiogenese, vi har registreret også virkningen af ​​miR-200C på migration af HUVEC celler. Som vist i figur 5, ektopisk ekspression af MIR-200C signifikant hæmmet angiogenese og migrering af HUVEC-celler. På den anden side, undertrykkelse af miR-200C øget rør dannelse og migration med omkring 30% for HUVEC celler.

HUVEC’er blev transficeret med miR-200C efterligner, miR-200C-hæmmere eller si-VEGFR2. (A) HUVEC’er blev dyrket på Matrigel 48 timer efter transfektion. Repræsentative billeder af kapillære-lignende strukturer dannet og (B) længden af ​​kapillære struktur blev kvantificeret. (C) De transficerede HUVEC’er blev også podet på det øvre kammer af 8,0-mm porestørrelse 24 brønde transwell plader at undersøge cellemigration evne. (D) De migrerende celler blev talt og statistisk analyseret. Hvert eksperiment blev gentaget tre gange. Standardfejl af middelværdien er vist ved fejlsøjler. * Angiver p 0,05 sammenlignet med kontrolgruppen

Diskussion

Tidligere arbejde fra vores gruppe, og andre har foreslået, at VEGF modulerer tumor overlevelse gennem en række forskellige måder, herunder strålingssensibilisering [13]. – [15]. VEGF inducerer biologiske effekter i en parakrin /autokrin måde ved binding til dens receptorer, især VEGFR2 (KDR, FLK-1). Nogle prækliniske undersøgelser har vist, at terapeutiske fordele ved strålebehandling kan forbedres ved kombination med inhibitorer af VEGFR2 [16]. Målretning VEGFR2 pathway tilvejebringer en ny måde at overvinde radioresistance i strålebehandling af forskellige kræftformer. For nylig blev nogle miRNA påvist at modulere strålebehandling af kræftceller. MIR-200C er nøglen regulator af epitel-til-mesenchymal overgang (EMT), som er forbundet med embryogenese, cancer progression og metastase. Og MIR-200C udtrykkes specifikt i normale rotter lungevæv [9], mens tab af MIR-200C-ekspression fremkaldte en aggressiv, invasiv og kemoterapi fænotype i ikke-småcellet lungecancer [10]. VEGFR2 er en forudsagt mål for miR-200C med bioinformatik analyse (https://www.targetscan.org). Så det er vigtigt at finde ud af, om miR-200C kunne modulere radiosensitivitet af kræftceller ved at målrette VEGFR2 vej.

Ved dobbelt luciferasereportergen assays og western blot analyse, viste vi VEGFR2 som et direkte mål for miR-200C . Så vi testede effekten af ​​ektopisk udtryk for miR-200C på radiosensitivitet af A549 celler. Vi fandt, at opregulering af MIR-200C med MIR-200C efterligner signifikant reduceret VEGFR2 proteinekspression og øget radiosensitivitet af A549-celler efter forskellige doser af stråling. Men nedregulering af miR-200C udtryk med miR-200C-hæmmere øget celle overlevelse og nedsat radiosensitivitet. Vi yderligere konstrueret si-VEGFR2 at inhibere VEGFR2 proteinet af A549-celler. Resultaterne viste, at faldende VEGFR2 udtryk ved hjælp si-VEGFR2 kunne øge radiosensitivitet i A549 celler, som var consistant med virkningerne af VEGFR2 nedregulering i andre tumorcellelinjer [17], [18]. Så miR-200c kan øge radiosensitivitet af A549 ved at hæmme VEGFR2 udtryk.

Men en enkelt miRNA kunne regulere hundredvis af målgener. Så gør miR-200C radiosensitize A549 celler primært gennem målrettet VEGFR2 vej? Su1498 er en tyrosinkinaseinhibitor specifikt for VEGFR2. Vi fandt, at MIR-200C ikke kunne radiosensitize A549 mens VEGFR2 blev inhiberet af su1498. Da VEGF er den vigtigste ligand af VEGFR2 fungerede i en parakrin /autokrin måde, vi først undersøgt variation af VEGF-sekretion efter MIR-200C transfektion og fandt, at MIR-200C efterligner ikke kunne påvirke VEGF sekretion af A549. Så neutraliseret vi udskilt VEGF udenfor A549 celler med bevacizumab før transfektion af miR-200C, og fik et negativt resultat ligesom VEGFR2 hæmning. Så dette tyder på, at miR-200c kunne radiosensitize A549 celler ved at målrette VEGF-VEGFR2 vej.

Så vi yderligere undersøgte efterfølgende mekanismer miR-200C radiosensibilisering. MAPK og PI3K /AKT signaling transduktion pathways er to vigtige nedstrøms signalveje af VEGFR2 [19]. Direkte målretning og hæmning af disse to veje kan øge radiosensitivitet af cancerceller. Phosphorylering af p44 /42-MAPK (Thr202 /Tyr204) og Akt (Ser473), som er centrale molekyler af MAPK og PI3K /AKT signalveje, øger normalt overlevelsen af ​​cancerceller efter strålebehandling. I vores undersøgelse blev Western blot analyser taget for at undersøge ændringerne i Akt og ERK1 /2 (P44 /42-MAPK) fosforylering niveau efter tansfection af miR-200C efterligner eller inhibitorer i A549 celler. Vi fandt, at mens forøget ekspression af MIR-200c førte til en inhibering af Akt og ERK1 /2 phosphorylering, nedsat ekspression af MIR-200C forstærket Akt og ERK1 /2 phosphorylering i A549.

Hypoksisk mikromiljø ydre for cancerceller bidrager væsentligt til radioresistance af strålebehandling [7]. Undertrykkelse af angiogenese signifikant forøget radiosensitivitet af cancerceller. Og VEGFR2, en vigtig mediator af angiogenese, kan påvirke tumor microenviroment (TME), der modulerer kræftcelle radiosensitivitet. Vores data tyder på, at ektopisk udtryk for miR-200C undertrykt angiogenese af HUVEC celler.

Desuden har vi også undersøgt andre mekanismer i miR-200c-VEGFR2 interaktion. Med FCM eller MTT-assays, vi fandt ingen signifikant virkning af MIR-200c på cellecyklus, apoptose eller proliferation af A549-celler (data ikke vist).

Tilsammen vores resultater viser, at MIR-200C-medieret inhibering af VEGF-VEGFR2 signaleringskaskade kunne radiosensitize human NSCLC cellelinie A549-celler for stråling, som er et terapeutisk mål for radiosensibilisering.

konklusioner

Vores data tyder på, at mIR-200c kunne signifikant radiosensitize A549 celler ved at målrette VEGF-VEGFR2 vej.

Materialer og metoder

Cell Culture

A549 celler, opnået fra Cell Bank of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina), blev dyrket i RPMI 1640 medium indeholdende 10% føtalt bovint serum ved 37 ° C i en fugtig 5% CO

2 atmosfære. HUVEC-celler fra American Type Culture Collection (ATCC) blev dyrket i endotelcelle medium (ECM; Sciencell, USA). Dyrkningsmediet blev fornyet hver 2-3 dage. Og cellerne blev passeret ved 1:6 hver 4 dage efter trypsinisering med 0,05% trypsin-EDTA.

transient transfektion og Cell Behandlinger

MIR-200C efterligner, MIR-200C-inhibitorer, Si- VEGFR2, efterligner kontrol, hæmmere kontrol, og siRNA kontroller blev syntetiseret ved Ribobio (Guangzhou, Folkerepublikken Kina). Celler blev podet ved 4 × 10

5 per celle i 6-brønds plader en dag før transfektion. Lipofectamine 2000 (Invitrogen) transfektionsreagens blev anvendt til transfektion af celler med MIR-200C efterligner (50 nM), MIR-200C-inhibitorer (100 nM) eller VEGFR2 lille interfererende (si) RNA (100 nM). Ingen målretning efterligner kontroller (50 nM), inhibitorer kontroller (100 nM) eller siRNA kontroller (100 nM) blev transficeret ind i celler som negative kontroller, henholdsvis. 6 timer efter transfektion blev cellevækst fjernes mediet og inkuberet i medier indeholdende 5% FBS i yderligere 24-72 timer. Yderligere forsøg blev udført med transficerede celler eller cellelyse. Su1498 (Santa Cruz Biotechnology) eller Bevacizumab (Roche) blev administreret 60 minutter før transfektion.

Identifikation af miR-200C Mål

Brug lipofectamin 2000 (Invitrogen) blev A549-celler transficeret med luciferase reporter konstruktioner indeholdende 3’UTR af VEGFR2 eller den negative kontrol vektorer (Promega). Transfektionen blandinger indeholdt 100 ng fireflyluciferase reporterplasmid og 50 nM af syntetisk MIR-200C duplex. A549-celler blev opsamlet 48 timer efter transfektion, og luciferaseaktiviteten blev målt ved anvendelse af Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega).

klongenicitetsassayet

Følsomhed af A549-celler for bestråling blev bestemt ved klongenicitetsassayet efter de variable doser af stråling (0Gy, 2Gy, 4Gy, 6Gy, 8Gy) ved hjælp af en lineær accelerator (Primus K, Siemens, München, Bayern, Tyskland). Efter inkubering i 10-14 dage blev kolonier dannet fikseret med methanol og farvet med 1% krystalviolet. Kun kolonier, der består af mere end 50 celler blev talt. Dataene blev tilpasset til lineær-kvadratisk model ved hjælp Sigmaplot software, hvor overlevelseskurver blev dannet og radiosensitivitet parametre blev beregnet. Forsøg blev gentaget tre gange

Måling af VEGF Level

Niveauet af VEGF secreation af A549-celler blev vurderet med human VEGF-ELISA-kit (R 0,05 blev betragtet som signifikant

.