PLoS ONE: Herpes Virus MicroRNA Expression og betydning i serøs kræft i æggestokkene

Abstrakte

serøs ovariecancer (SEOC) er den dødeligste gynækologisk malignitet. MikroRNA’er (miRNA) er en klasse af små ikke-kodende RNA, der regulerer genekspression og protein oversættelse. MiRNA er også kodet af vira med den hensigt at regulere deres egne gener, og de af de inficerede celler. Dette er den første undersøgelse, der vurderer virale miRNA i SEOC. MiRNA sekventering data fra 487 SEOC patienter blev hentet fra TCGA hjemmeside og analyseret igennem in-house sekventering pipeline. Til cross-validere TCGA analyse, målt vi udtryk for miR-H25 ved kvantitativ immunofluorescens i en ekstra kohorte af 161 SEOC patienter. Gen, miRNA ekspression, og cytotoksicitet assay blev udført på flere ovarian cancer cellelinjer transficeret med MIR-H25 og MIR-BART7. Outcome analyse blev udført ved anvendelse af multivariat Cox og Kaplan-Meier-metoden. Virale miRNA er mere udtrykt i SEOC end i normale væv. Desuden Herpetisk virale miRNA (MIR-BART7 fra EBV og miR-H25 fra HSV-2) er betydelige og prædiktive biomarkører for resultatet i multivariat Cox-analyse. MIR-BART7 korrelerer med resistens mod første linje kemoterapi og tidlig død, mens miR-H25 synes at give en beskyttende virkning og overlevelse på lang sigt. Integreret analyse af gen og virale miRNA udtryk antyder, at miR-BART7 inducerer direkte cisplatin-resistens, mens miR-H25 ændrer RNA behandling og påvirker ekspressionen af ​​skadelige menneskelige miRNA som miR-143. Dette er den første undersøgelse, der forbinder viral miRNA udtryk for æggestokkene resultat kræft. Virale miRNA kan være nyttigt at udvikle biomarkører for tidlig diagnose og som en potentiel terapeutisk redskab til at reducere SEOC dødelighed

Henvisning:. Pandya D, Mariani M, McHugh M, Andreoli M, Sieber S, han S, et al . (2014) Herpes Virus MicroRNA Expression og betydning i serøs kræft i æggestokkene. PLoS ONE 9 (12): e114750. doi: 10,1371 /journal.pone.0114750

Redaktør: Pierre Busson, Gustave Roussy, Frankrig

Modtaget: Juni 12, 2014, Accepteret: November 13, 2014; Udgivet: 8. december 2014

Copyright: © 2014 Pandya et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Analyse er udført på den TCGA datasæt, som er frit tilgængelig på TCGA data portalen (https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/). Niveau 3 data er tilgængelige uden restriktioner, mens niveau 1 data og kliniske oplysninger er tilgængelige efter at en ansøgning gennem den TCGA data portalen. Politikker for TCGA dataadgang forklares på https://cancergenome.nih.gov/abouttcga/policies/policiesguidelines

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist støttet af en bevilling fra AIRC (Associazione Italiana Ricerca sul Cancro, IG11975 ), Associazione OPPO e le sue stanze ONLUS ved Ruth C. Donovan Cancer Research Program og en liberal donation fra Mr. og Mrs. Ruggles. Dette arbejde er dedikeret til Monica DeFeo der mistede sin modige kamp mod kræft i den unge alder af 53. Sponsorer af undersøgelsen havde ikke nogen rolle i undersøgelsen undfangelse og ledelse

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret at der ikke findes konkurrerende interesser.

Introduktion

serøs ovariecancer (SEOC) er den mest dødbringende gynækologisk malignitet. På grund af sin kliniske magelighed, er størstedelen af ​​patienterne diagnosticeret sent stadium, når kirurgi alene er utilstrækkelig til helt at udrydde tumoren. Som følge heraf er kemoterapi normalt kræves til yderligere at kontrollere sygdommen. First-line kemoterapi for kræft i æggestokkene indeholder typisk et platin agent (normalt carboplatin) og et taxan (normalt paclitaxel) [1]. Biomarkører som fremadrettet prædiktiv for følsomhed eller resistens over for kemoterapi er desperat behov til korrekt individualisere behandlingsmuligheder og undgå giftige behandlinger for de patienter, der vil være refraktære over for kemoterapi. Opgaven med at udvikle sådanne biomarkører, problematisk for alle faste maligniteter, særligt vexing for kræft i æggestokkene, hvor ekstrem klonal heterogenitet er normen, og for hvilke der er identificeret nogen drivende mutationer [2].

MikroRNA’er (miRNA) er en klasse af små, ikke-kodende RNA, der regulerer genekspression og protein oversættelse og påvirker alle aspekter af cellulær fysiologi. Akkumulerende beviser tyder på, at mange miRNA afvigende udtrykkes i humane kræftformer, og miRNA udtryk profiler har augmented prognostiske oplysninger fra ordninger traditionelle klassifikationssystemer relateret til at iscenesætte og undertype [3], [4], [5]. Vira indkode også miRNA og dermed påvirker fungerer af inficerede celler. I pattedyr viral infektion er en potent udløser af interferon respons, som hæmmer viral replikation og afbøder viral skader. Infektion af mammale celler ved RNA-vira, undtagen retrovira, fører til dannelsen af ​​lange dsRNA’er løbet virus livscyklus. DNA-vira producerer dsRNA’er ved konvergent transkription af deres kompakte virusgenomer. Viral dsRNA er en potent udløser af interferon respons, der phosphorylerer oversættelsen faktor eIF2a og fører til global translationel anholdelse og apoptose [6], [7], [8]. Som en adaptiv strategi, har vira udviklet en bred vifte af modforanstaltninger til at blokere interferonproduktion, og nogle af disse er afhængige af virale miRNA som effektorer af cellulær kontrol. Alle herpesvira tiden kendte (humane og ikke-humane) indkode multiple miRNA [9]. Som et eksempel, hCMV MIR-UL112-1 hæmmer ikke kun viral IE1 udseende, men også cellulær MICB ekspression at fremme viral latens og undgå udryddelse af naturlige dræberceller [10]. Derfor fremgår det, at herpes vira er i stand til kapring den intracellulære kontrol af gen /protein-ekspression gennem virale miRNA.

herpesinfektioner er stædigt almindelige og udbredt i mennesker. EBV [11] og CMV [12] infektioner er til stede i mindst 80% af befolkningen. Worldwide satser af Herpes simplex virus (HSV) -infektion, optælling både forkølelsessår (HSV-1) og genital herpes (HSV-2), er mellem 65% og 90% [13]. Disse epidemiologiske data indebærer en høj sandsynlighed for, at æggestokkene kræftpatienter er bærere af mindst én eller flere herpesinfektioner. På grund af deres udbredte forekomst og vedholdenhed og evne til at påvirke transskription og translation i inficerede celler, vi hypotesen, at herpes virus miRNA er klinisk vigtige mediatorer af SEOC biologi med betydeligt potentiale som biomarkører og drug targets.

Resultater

Angivelse af virale miRNA er højere i SEOC end i normale væv

Cancer Genome Atlas (TCGA) projektet [14] analyserede og katalogiseret messenger RNA udtryk, miRNA udtryk (Illumina Hiseq), promoter methylering og DNA kopital i 489 avancerede serøse æggestokkene adenocarcinomer, og DNA-sekvenserne af exoner fra kodende gener i 316 af disse tumorer. Denne pionerarbejde er en fremragende ressource for udviklingen af ​​nye og innovative strategier for ovariecancer behandling. De TCGA miRNA undersøgelser offentliggjort til dato kun anvendes det niveau 3 data, som repræsenterer de kortlagte miRNA kun bruger det menneskelige (ikke viral) miRNAome som reference. For at overvinde denne begrænsning, downloadet vi det niveau 1 rå data, og vi udførte miRNA-seq kortlægning for 487 patienter refererer både menneskelige

og

virale miRNAomes. Vi var en succes i kortlægning 88,2% af læser. Det gennemsnitlige antal kortlagt læser for hver patient var 9,2 mio. Som forventet blev den største del af læser afbildet på den humane miRNAome. Men en detekterbar og temmelig anselig antal læser (n = 184.618) blev afbildet på det virale miRNAome, hvilket viser tilstedeværelsen af ​​virale miRNA i SEOC patienter. Resultater blev normaliseret for at tage hensyn til, at det samlede antal læser fra hver patient ikke var identiske, og at, i fravær af normalisering, variationer i antallet af læser individuelle miRNA kunne skyldes sekventering dybde. Derfor normaliseret vi data som TPM (udskrifter per million) læser. Det gennemsnitlige antal viral miRNA læser for hver patient var 45,6 TPM. De hyppigst forekommende virale miRNA blev kortlagt i HSV-1 (n = 128.701) og HSV-2 genomet (n = 51.709). HH6VB og EBV tegnede sig for 986 og 1260 lyder hhv. CMV (cytomegalovirus) og KSHV (Kaposis Sarkom Herpes Virus) var til stede med 96 og 178 lyder henholdsvis. TCGA inkluderer ikke normale ovarievæv kontrol for miRNA-seq. For at have et referenceinterval for ekspressionen af ​​virale miRNA i noncancerous væv, vi downloadede 607 normale væv fra TCGA herunder blære, bryst head hals, nyre, lever, lunge, placenta, thyroid, prostata og livmoder for i alt på 7,7 mia sekvenser. Prøver blev analyseret efter den samme procedure som beskrevet ovenfor. I noncancerous væv, de virale miRNA niveauer i gennemsnit signifikant lavere (TPM 11,8) sammenlignet med en TPM middelværdi på 45,6 i SEOC (fig. 1). Disse resultater viser, at ekspressionen af ​​virale miRNA er højere i SEOC end i noncancerous væv

Dobbelte stjerner angiver signifikant forskel (p 0,0001, t-test). Mellem ekspressionen af ​​virale miRNA i SEOC sammenlignet med noncancerous væv. Data udtrykkes til summen af ​​alle de virale miRNA. Data er udtrykt som TPM og baren på kortet svarer til gennemsnittet af noncancerous væv (11,8) og SEOC (45,6).

Derefter udførte vi en sammenlignende analyse af ekspressionsniveauerne af både miR -H25 og miR-BART7 og nogle menneskelige miRNA typisk udtrykt i epitel komponent i SEOC (miR-21) [15], [16] og i de røde blodlegemer (MIR-16) [17] (fig. 2). MIR-21 ekspressionsniveauer var signifikant højere end dem for MIR-16 (p 0,001, parret t-test). Et lignende mønster blev også observeret for både MIR-H25 og MIR-BART7, der blev udtrykt på signifikante lavere niveauer i forhold til MIR-21 (p 0,001, parret t-test). Sammenlignet med MIR-16, igen både virale miRNA var signifikant udtrykt ved lavere niveauer (p 0,001, parret t-test), selv om i dette tilfælde forskellen i ekspressionen var mindre konsekvent end der bemærket for MIR-21

Kvinder blev kategoriseret som negative eller positive for miR-BART7 og miR-H25 hvis TPM 0 eller TPM = 0 hhv. I hvert plot svarer den vandrette linje til medianen, boksen til 25

th-75

percentil og linjerne til konfidensintervallet (5

th-95

percentil).

prognostisk rolle af virale miRNA i SEOC

for at vurdere, om ekspression af virale miRNA var prognostisk, vi analyserede hver enkelt viral miRNA i en Cox regressionsmodel. Analyse blev udført i univariate og multivariat analyse, herunder alder og scene, da disse variable var signifikante univariate prædiktorer. Det endepunkt var samlet overlevelse (OS) i måneder. En hazard ratio (HR) 1 angivet en skadelig virkning på OS, mens HR 1 betød en beskyttende virkning. Analyse blev udført under anvendelse af ekspressionen af ​​virale miRNA (TPM) som en kontinuert variabel. Den samlede samlet analyse for hver virus ikke giver signifikant prædiktiv kapacitet i Cox multivariat model (

s

0,05). Kun HSV-1 trended mod en betydelig beskyttende effekt med en

s

-værdi i multivariat analyse af 0,053 (HR = 0,33; CI 0,03-1,01). Når begrænse pool imidlertid at omfatte kun de HSV-2 virale miRNA typisk til udtryk under produktiv infektion (miR-H9, miR-H11, miR-H12, miR-H13, miR-H19, miR-H20, miR-H21, miR-H22, miR-H23 og miR-H25 [9]), den beskyttende effekt nåede statistisk signifikans (HR = 0,2, CI 0,04-0,89,

s

= 0,032). Især blev ekspressionen af ​​virale miR-H25 (HSV-2) findes i 233/487 (48% med TPM 0) af prøverne. Multivariat analyse udnytte Cox modellen viste, at høj ekspression af denne virale miRNA var relateret til et bedre resultat (HR = 0,1; CI 0,01 til 0,55;

s

= 0,006). Derudover er ekspressionen af ​​MIR-H25 var højere hos patienter med komplet kemoterapi respons og lavere hos patienter med progressiv sygdom (fig. 3). Selv om mekanismen er ukendt, produktiv infektion af HSV-2 med tilhørende høj ekspression af MIR-H25 kan hæmme kræft cellereplikation direkte eller forøgelse drab af HSV-2 inficerede cancerceller af immunsystemet.

stjernerne markerer signifikant falder af ekspressionen af ​​mIR-H25 hos patienter med både PD og SD sammenlignet med patienter med CR. Dette fund understøtter en beskyttende rolle miR-H25 udtryk.

Derefter analyserede vi udtryk for miR-H25 i en ekstra kohorte af 161 SEOC patienter, hvis kliniske funktioner er sammenfattet i tabel 1. For hver patient, blev op til 12 vævskerner taget fra forskellige regioner i hver kræft (933 kerner i alt), og disse blev afhørt i et væv micro array (TMA) format. Udtrykket af miR-H25 (farvet med specialfremstillede Exiqon sonde) i hver kerne blev analyseret med AQUA-software, der udnytter et foruddefineret sæt algoritmer og uovervåget metode til at vurdere målniveauerne i forskellige cellulære undersektioner (eller “masker”). Cytokeratin og vimentin antistoffer farvning billede tumoren og stromale masker henholdsvis og DAPI tjente til at definere den nukleare maske. Et resumé af resultaterne af AQUA scoring er rapporteret i fig. 4. Det samlede intensitet MIR-H25 var højere i cytoplasmaet af cancerceller og lavere i det stromale masken. Negative og positive kontroller blev opnået under anvendelse af et oligonukleotid ikke målrettet mod enhver region i det humane genom (SiC) og U6 lille RNA hhv. SiC-probe udviste ingen farvning (fig 5 . 6A). Som forventet, U6 probe demonstreret nuklear ekspression i næsten 100% af cellerne (fig. 6B). Ekspression af U6 var højere i de epiteliale cancerceller sammenlignet med niveauerne bemærket i stromale celler (Fig. 6B). MIR-H25 probe blev påvist med to mønstre af ekspression. I den ene blev proben farvning begrænset til kernen af ​​tumorceller (fig. 6C). I et andet, der var diffus cytoplasmatisk farvning af både tumorceller og stromaceller (fig. 6D). Ekstra tal til at beskrive ved højere forstørrelse farvningen mønster leveres som S1, S2, S3, S4 og S5 Tal. Multivariat Cox-analyse, herunder alder og stadie afslørede, at ekspressionen af ​​nukleare miR-H25 ikke var prædiktiv for udfaldet (HR 0,91, CI 0,65-1,24), hvorimod udtrykket med en cytoplasmatisk farvning mønster var signifikant associeret med godt resultat (HR 0,56; CI 0,39-0,79;

s

= 0,0008). Dette AQUA analyse støtter fuldt ud vores opdagelse fra TCGA datasæt, nemlig at produktive HSV-2 infektion (med samtidig cytoplasmatisk miR-H25 overekspression) giver beskyttelse til SEOC patienter.

Hver prik svarer til værdien af ​​en individuel væv kerne. AQUA scoringer blev beregnet i det stromale masken (blå prikker), i den nukleare maske (røde prikker), i tumoren cytoplasmatiske maske (grønne prikker) og i tumor masken (gule pletter). De tilsvarende linjer refererer til den udglattede gennemsnit for hver patient og farve er den samme for prikkerne.

På toppen SiC sonde og nederst miR-H25 sonde. Blå signal = DAPI. Gul = Cytokeratin. Grøn = vimentin. Pink = MIR-H25 probe. Bar størrelse er lig 100 uM

Fra top til bund:. Fusionerede billede, nuklear farvning (DAPI), tumor maske (cytokeratin immunofarvningsprocedure), stromale maske (vimentin immunofarvningsprocedure) og RNA-probe. Prober er SiC (krypteret interfererende kontrol) (A), U6 (positiv kontrol) (B), og MIR-H25 (C 0) blev først identificeret i 7,9% af prøverne samlet, det var overrepræsenteret i patienter med refraktær og modstandsdygtige sygdom i forhold til kemo-sensitive gruppe (. Figur 7A og 7B) . Derfor udstillet miR-BART7 positive patienter forkortet samlet overlevelse i Kaplan Meier (fig. 7C) og Cox multivariat analyse (HR 3.4, CI 2,2-6,6,

s

= 0,002).

A : Patienterne blev mærket i henhold til PFI som refraktær (PFI 6 måneder), resistente (PFI 6-12 måneder) og følsom (PFI 12 måneder). Ekspression af miR-BART7 er betydeligt lavere i den følsomme i forhold til ildfaste og resistente grupper (to stjerner, s 0,001, t-test). B: Contingency analyse (mosaik plot) af patienterne grupperet for ekspression af miR-BART7 (TPM 0 er positiv (n = 38), blå søjler; TPM = 0 (n = 449) er negative, røde bjælker) og i henhold til respons på kemoterapi som beskrevet i A. dobbelte asterisker viser, at andelen af ​​følsomme patienter er højere i mIR-BART7 negative gruppe (Fisher exact test, p 0,001, dobbelt asterisk). C: Kaplan-Meier analyse af TCGA patienter (n = 487) ifølge ekspressionen af ​​MIR-BART7. Den tidlige dødelighed er betydeligt højere i MIR-BART7 positive patienter (Wilcoxon test, p = 0,01). OS (X-akse) repræsenterer den samlede overlevelse udtrykt i måneder.

Identifikation af ændringstaster mekanismer SEOC biologi

En af fordelene ved TCGA datasættet er dens inddragelse af både miRNA-seq og genekspression data. Denne funktion gør det muligt ydeevne integreret analyser formål at identificere kandidatgener reguleret af virale miRNA som tidligere beskrevet for humane miRNA [18]. Vi havde fokuseret vores analyser på de to individuelle virale miRNA (MIR-H25 og miR-BART7), som viste signifikans i kliniske effektstudier, som beskrevet ovenfor. Vi hentede niveauet 2 data rapportering genekspression analyser udnytte Affymetrix U133 chips. For 414 patienter (som var randomiseret til enten en uddannelse eller test sæt), vi med succes analyseret både gen og viral miRNA udtryk. Vi grupperet patienter efter ekspressionsniveauerne af de to virale miRNA af interesse (positiv = TPM 0 vs. negativ = TPM = 0). Generne markant forskellige mellem disse to grupper blev identificeret ved et konfidensniveau på

s

0,05 efter flere hypotese korrektion med Benjamini-Hochberg metoden. Under anvendelse af denne fremgangsmåde, fandt vi 262 gener udtrykkes forskelligt for MIR-H25. Ifølge DAVID bioinformatiske ressource [19], de grupperet i 12 selvstændige funktionelle grupper, med RNA-behandling, splejsning og transport som de mest signifikante (Fig. 8). Virkningen på RNA-bearbejdning blev ledsaget af en væsentlig modulation af ekspressionen af ​​visse humane miRNA. For eksempel kvinder med høje niveauer af MIR-H25 (fig. 9A), men ikke MIR-BART7 (fig. 9B) viste en signifikant reduktion i ekspressionen af ​​MIR-143. MIR-143 er en potent miRNA, som i TCGA undersøgelsen, var relateret til dårligt resultat i multivariat Cox model (HR 14,8, CI 5,9-37,9,

s Restaurant 0,001) og Kaplan-Maier analyse (fig. 9C). Virkningen af ​​MIR-H25 på MIR-143 synes relateret til ikke-specifik nedregulering af miRNA forarbejdning, som ingen signifikant forskel mellem MIR-H25 negative og positive patienter i den samlede ekspression af ikke-kodende RNA blev observeret (fig. 9D). Indflydelsen af ​​MIR-H25 på MIR-143 ekspression kan faktisk være specifikke og direkte; vi var i stand til at reproducere det samme fænomen in vitro anvendelse af to SEOC cellelinier (A2780 og SKOV-3) transficeret med et syntetisk MIR-H25. Over-ekspression af MIR-H25 blev testet ved tre koncentrationer (0,1, 1 og 10 nM) under anvendelse af transficerende medium, en kodet oligo ikke målrettet mod enhver region i det humane genom (SiC) og en viral miRNA ikke udtrykkes i SEOC (miR- UL112) som negative kontroller. Kun miR-H25 producerede en signifikant nedregulering af miR-143-ekspression (fig. 10).

MIR-H25 netværk viser 35 gener involveret i RNA behandling, splejsning og transport. Dækning af nettet i DAVID database er 15/35 (42%, sorte cirkler).

Box-whisker plot diagram, der viser ekspressionen af ​​MIR-143 (TPM) ifølge ekspression af miR- H25 (A) og mIR-BART7 (B). Patienterne blev defineret som positive for viral miRNA ekspression hvis TPM værdien var 0 (n = 233). Patienter med TPM = 0 blev defineret negativ (n = 254). Figuren viser en signifikant nedregulering af miR-143 hos kvinder positive for miR-H25 (p 0,001, t-test), men ikke hos patienter positive for miR-BART7. Kaplan-Meier-analyse af patienter i henhold til ekspressionen af ​​MIR-143 (C). Patienter med høj ekspression af MIR-143 udviser en væsentligt dårligere resultat i forhold til patienter med lav MIR-143-ekspression (P 0,001, Wilcoxon test). D: Analyse af ekspressionen af ​​ikke-kodende RNA (som TPM) hos patienter grupperet for miR-H25 udtryk. Grønne linjer og diamanter skildrer midlerne og intervallerne for hjælp af de to grupper tillid. Forskellen er ikke statistisk signifikant (

s

0,05, t-test).

I A-C og B-D udtryk for miR-H25 og miR-143, henholdsvis. I A-B og C-D, A2780 og SKOV-3-celler, hhv. Blå: kontrol med transfektion medium; Rød: Scrambled kontrol syntetisk sonde (SiC); Grøn: miR-UL112 syntetisk; Sort: miR-H25 syntetisk. Data viser, at ekspressionen af ​​MIR-H25 (10 nM) undertrykker MIR-143-ekspression i begge cellelinier.

I det vedrørende MIR-BART7 udførte vi det samme gen netværksanalyse beskrevet ovenfor for miR -H25. MIR-BART7 ekspression grupperet med 221 gener i 6 funktionelle grupper, den mest fremtrædende af disse er den T-celleaktivering pathway (fig. 11). Også vi identificeret en væsentlig opregulering af ADH1B genet. Dette gen koder for alkoholdehydrogenase 1B, nøglen enzym til omdannelse af ethanol til acetaldehyd, et stof, som interfererer med DNA-reparation [20]. ADH1B var signifikant forøget hos kvinder, der udtrykker miR-BART7 (fig. 12A), mens den var uændret hos kvinder, der udtrykker miR-H25 (fig. 12B). Støtte til miR-BART7 prognostisk data præsenteret i fig. 5, kvinder med høj ekspression af ADH1B var relativt overrepræsenteret blandt patienter refraktære eller resistente over for første-line kemoterapi (fig. 12C). For at undersøge forbindelsen mellem MIR-BART7 ekspression og resistens mod kemoterapi, transficerede vi A2780 og Hey celler (to cellelinjer cisplatin-sensitive) med en syntetisk MIR-BART7 (10 nM, fig. 13), eller et kodet kontrol (SiC ). Effektivitet af transfektion blev bekræftet med qPCR (fig. 13A). Virkningerne af miR-BART7 blev også vurderet i forhold til ADH1B induktion på protein niveau med western blot teknik (fig. 13B). MIR-BART7 frembragte en signifikant forøget ekspression af ADH1B i både cellulære modeller. Stigning blev kvantificeret med densitometrisk analyse i tre uafhængige forsøg og var 4,5 og 3,2 i A2780 og Hey celler, henholdsvis (

s

0,001 t-test). Efter 12 timer fra transfektion blev celler inkuberet med cisplatin i 72 timer og derefter talt. For at kvantificere resultaterne brugte vi cisplatin aktive område (%) som for nylig beskrevet af Barretina og coll. [21]. Transfektion med MIR-BART7 frembragte en signifikant stigning i cisplatin-resistens i begge cellelinier (fig. 13C og fig. 13D). Som bemærket hos patienter på genniveau, MIR-BART7 inducerede en signifikant forøgelse af ADH1B ekspression i begge cellelinier. Desuden testede vi virkningen af ​​fomepizole, en kendt specifik inhibitor af ADH1B aktivitet [22]. Fomepizole helt ophævet effekten af ​​miR-BART7 på cisplatin toksicitet (fig. 13E, 13F og 13G), hvilket viser, at miR-BART7 formindsker cisplatin effekt ved at øge ADH1B aktivitet.

MIR-BART7 netværk viser 67 gener involveret i T-celleaktivering. Dækning af netværket i DAVID-databasen er 47/67 (70%, sorte cirkler).

Box-knurhår plot diagram, der viser udtryk for ADH1B ifølge ekspressionen af ​​miR-BART7 (A) og mIR-H25 (B). Asterisk angiver en signifikant overekspression af ADH1B i miR-BART7 positive patienter (

s

= 0,02, t-test), men ikke i miR-H25-positive patienter. Uforudsete analyse (C) (mosaik plot) af patienterne stratificeret efter ADH1B ekspression (blå og rød er for høj og lav ekspression, henholdsvis) og følsomhed over for kemoterapi (refraktær, resistente og følsomme kategorier som beskrevet i fig. 5A). ADH1B udtryk er markant højere i refraktære og resistente patienter (

s

0,05, Fisher eksakte test). I forhold til den følsomme gruppe (svarende til miR-BART7)

Repræsentative qPCR analyse af A2780 celler transficeret med et syntetisk miR (10 nM) svarende til sekvensen af ​​mIR-BART7 (grøn linje) (a). Kontroller blev repræsenteret af celler behandlet med kun det transficerende medium (blå linie) og en sekvens målretter ikke mod det humane genom (SiC, rød linje). Repræsentative western blot i celler behandlet som i (A). Behandling med det syntetiske MIR-BART7 inducerede ekspressionen af ​​ADH1B på proteinniveauet i begge cellelinier. GAPDH tjente som ladningskontrol (B). Linjediagram der viser virkningen af ​​cisplatin i A2780 (C) og Hey (D) celler transficeret som beskrevet i (A). Linjediagram der viser virkningen af ​​cisplatin plus fomepizole (10 uM) i A2780 (E) og Hey (F) celler transficeret som beskrevet i (A). Søjlediagram (G), der viser det aktive område af cisplatin i A2780 og Hey celler. Celler blev behandlet som i (D-E). Cisplatin effekter blev overvåget efter 72 timers dyrkning med forekomst (eller ikke) af fomepizole 10 uM. Barer og fejlsøjler svarer til middelværdi og SD af tredobbelte prøver udført i dobbeltbestemmelse. Dobbelt stjernerne markerer en signifikant effekt på en

s

. 0,001 niveau (t-test)

Diskussion

SEOC er den dødeligste gynækologisk malignitet. Patienterne vil drage fordel af identifikation af biomarkører nyttige til diagnosticering af tidlig (mere behandles) sygdom, og fra udvikling af målrettede terapi. Denne undersøgelse er, at vi ved, den første detaljerede undersøgelse af den rolle, viral miRNA udtryk i kræft i æggestokkene. Først viser vi, at ekspressionen af ​​de samlede virale miRNA er højere i SEOC sammenlignet med normale væv. Som en del af de strategier, der er vedtaget af ovariecancerceller at undslippe anerkendelse af immunsystemet, der er hæmning af endogen interferon respons [23], [24], [25]. Den utilstrækkelige interferon respons skaber et cellulært miljø understøttende for viral vækst og replikation [8], og dermed forklare de øgede niveauer af virale miRNA i SEOC væv. Da miRNA er resistente over for nedbrydning og kan påvises i perifert blod [26], vi hypotesen, at cirkulerende totale virale miRNA vil være højere i ovariecancer population sammenlignet med kontroller. En begrænsning ved vores undersøgelse er, at i TCGA datasæt er der ingen normale kontroller fra ovariale væv. Men vi tog i betragtning de normale ekspressionsniveauer opnået i et stort panel af væv. På tværs af alle disse noncancerous væv var der ingen signifikant forskel i ekspressionen af ​​virale miRNA. Mener vi derfor yderst usandsynligt, at i æggestokkene normalt væv for nogle årsager er der en forøget udtryk for viral miRNA.

For det andet, rapporterer vi, at to individuelle viral miRNA miR-H25 og miR-BART7, fungere som modulatorer af SEOC biologi. HSV-2 produktiv infektion inducerer et højt niveau af MIR-H25 [27], som korrelerer med et bedre resultat. Vi dokumenterer denne tilsyneladende beskyttende effekt i to uafhængige kliniske kohorter udnytte to uafhængige metoder, miRNA-sekventering (TCGA) og kvantitativ immunofluorescens (AQUA). AQUA tillader cellulær underkammer analyse, og denne metode viser, at den beskyttende virkning af MIR-H25 er tydelig, når dets ekspression er cytoplasmatisk (og karakteristisk for produktive HSV-2 infektion) snarere end nuklear (indebærer latent HSV-2-infektion). MIR-H25 kan udøve sin virkning ved at kapre vært RNA behandling og nedregulere human miR-143, en potent miRNA i human cellulær funktion [28]. Faktisk giver vi direkte bevis for dette fænomen i celler transficeret med en syntetisk miR-H25. Selv anvendelsen af ​​onkolytiske HSV-stammer som en behandling for patienter med ovariecancer er tidligere blevet beskrevet [29], [30], [31], strategien medførte vaccination med det formål at begrænse produktiv HSV-infektion. Vore observationer antyder derimod, at produktive HSV-2 infektion er potentielt fordelagtig og kunne udnyttes til at øge effektiviteten af ​​onkolytiske HSV-stammer.

de MIR-H25 tilvejebringer en tilsyneladende beskyttende virkning, MIR-BART7 er forbundet med høj tidlig mortalitet. I tråd med de seneste resultater i nasofaryngealt karcinom [32], viser vi en rolle for miR-BART7 inducere forkortet platin interval (PFI) i en lille undergruppe af patienter, hos hvem denne miRNA udtrykkes. Transfektionsundersøgelser med et syntetisk MIR-BART7 frembragte en signifikant stigning i cisplatin-resistente celler, som er fuldt tilbageført med anvendelse af fomepizole, en kendt inhibitor af ADH1B. I vores analyse, er begge miR-BART7 og ADH1B forhøjet hos patienter refraktære eller resistente over for første linje kemoterapi. Forholdet mellem miR-BART7 og ADH1B er af interesse på grund af rapporten fra ADH1B som en potentiel kilde til kemoresistens i ovariecancer [33]. Fomepizole er i dag godkendt til behandling af methanol og ethylenglycol forgiftninger med en tilsyneladende fremragende toksikologisk profil [22]. Således ser det plausibelt, at hos patienter med høje niveauer af miR-BART7 kan ADH1B hæmning resultere i en bedre respons på cisplatin.

Vores undersøgelse er den første rapport, der viser en potentiel inddragelse af viral miRNA som drivkraft for kræft i æggestokkene biologi. Vi kan forklare vores fund med tre non-eksclusiv patogenetiske modeller. I den første, virusinfektion forekommer i de ovariecancerceller med samtidig produktion af viral miRNA. Vi mener, at denne mulighed usandsynligt, for den store forskel i ekspressionsniveauerne af de virale miRNA sammenlignet med human miRNA udtrykt i cancerceller som MIR-21. I den anden, den infektion forekommer i æggestokkene væv i stromale celler, hvor det er kendt, at virusset kan replikere såsom B og neurale celler til EBV og HSV-2. En tredje model er, at infektionen ikke forekommer i æggestokkene væv, men i et fjernt sted, og den virale miRNA træffes af kræft gennem cirkulation.

Som konklusion, vi leverer overbevisende dokumentation til rollen som herpesvirus kodede miRNA i SEOC. Vores observationer, at de samlede viral miRNA og mindst to specifikke virale miRNA øges i æggestokkene kræftpatienter kan støtte i udviklingen af ​​biomarkører for tidlig sygdom og formulering af nye anticancer-strategier.

Materiale og metoder