PLoS ONE: cir-ITCH Afspiller en hæmmende effekt på kolorektal cancer ved Regulering af Wnt /β-Catenin Pathway

Abstrakte

kodende RNA (ncRNAer) er det dominerende produkt af eukaryot transskription. Disse produkter spænder fra korte microRNA (miRNA) til lange intergeniske ikke-kodende RNA (lincRNAs). Cirkulære RNA består af exon sekvenser udgør en dublerede form for ncRNA der blev opdaget mere end 20 år siden. Ved hjælp af en TaqMan-baseret revers transkriptase polymerasekædereaktion assay analyserede vi forholdet mellem

cir-ITCH

ekspression og kolorektal cancer (CRC) i alt 45 CRCs og parrede hosliggende ikke-tumor vævsprøver. Vi fandt, at

cir-ITCH

udtryk blev typisk nedreguleret i CRC i forhold til den peritumoral væv. Dette resultat, samt flere opfølgende eksperimenter, viste, at

cir-ITCH

kan øge niveauet af

ITCH

, som er involveret i hæmning af Wnt /β-catenin vej . Derfor viste vores resultater, at

cir-ITCH

spiller en rolle i CRC ved at regulere Wnt /β-catenin vej

Henvisning:. Huang G, Zhu H, Shi Y, Wu W, Cai H, Chen X (2015)

cir-ITCH

Afspiller en hæmmende effekt på kolorektal cancer ved Regulering af Wnt /β-Catenin Pathway. PLoS ONE 10 (6): e0131225. doi: 10,1371 /journal.pone.0131225

Redaktør: Yifeng Zhou, Medical College of Soochow University, KINA

Modtaget: April 24, 2015; Accepteret: 30. maj 2015; Udgivet: 25 juni 2015

Copyright: © 2015 Huang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra Wenzhou Videnskab og Teknologi Bureau Natural Science Foundation (Y20140700 Dr. XC). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er en ondartet svulst, der er beliggende i tyktarmen eller endetarmen [1, 2]. CRC er fortsat en væsentlig årsag til dødelighed af kræft i den udviklede verden, hovedsagelig på grund af sin tilbøjelighed til at metastaserer [3]. CRC udgør et stort problem for folkesundheden, da det er den tredje mest almindeligt diagnosticeret kræft hos mænd og den næsthyppigste hos kvinder. Der har været mange sammenlignende undersøgelser påviser epigenetiske ændringer tæt forbundet med forekomsten og udviklingen af ​​CRC. Selvom CRC forskningsresultater er bemærkelsesværdige, de ætiologiske faktorer og de sygdomsfremkaldende mekanismer der ligger til grund CRC udvikling synes at være komplekse og heterogene.

For nylig, cirkulære RNA, en form for ikke-kodende RNA, der typisk ikke handler med koder for et protein, viste sig at være nært beslægtet med tumor udvikling [4]. Cirkulære RNA er normalt sammensat af mere end én exon og er normalt beriget med funktionelle microRNA (miRNA) bindingssteder; for eksempel,

CDR1

indeholder flere bevarede bindingssteder for miRNA-7 (miR-7). For nylig en undersøgelse rapporterede, at

cir-ITCH

er en cirkulær RNA, som spænder over flere exons af Ubiquitin (Ub) protein ligase (E3) (ITCH) [5-7]. Artiklen viste, at

cir-ITCH

huser mange miRNA bindingssteder der kan binde til 3′-UTR af

ITCH

, herunder for miR-7, miR-17, miR-214 , mIR-128 og mIR-216b [5, 8]. Studiet af miRNA er mere moden end cirkulær RNA; miRNA er 21-nukleotid-lange ikke-kodende RNA, der har vigtige roller i en lang række biologiske processer i både planter og dyr [9]. Ældre miRNA spiller vigtige regulatoriske roller i cellevækst, proliferation, differentiering og celledød.

cir-ITCH

spiller en vigtig rolle i udviklingen og progressionen af ​​ESCC [7].

kløe

‘s mål, herunder P63, P73, og Notch1, er normalt forbundet med tumordannelse og kemosensitivitet, viser tilslutningen af ​​ITCH til kræft biologi [10]. Tidligere forskning diskuteret cirkulære RNA anti-cancer aktiviteter i maligne melanom cellelinjer [11]. Men der er ikke rapporteret undersøgelser af de funktionelle roller cirkulære RNA i CRC.

I denne undersøgelse har vi en hypotese, at

cir-ITCH

spiller en lignende rolle i CRC. For at teste denne hypotese, vi udviklet en metode til at afgrænse de transkriptionelle forskelle i

cir-ITCH

mellem CRC og parret tilstødende ikke-neoplastiske væv.

Materialer og metoder

Study fag

Alle emner i denne undersøgelse var homogene han-kinesere. Fyrre-fem CRC og tilsvarende paracancerous vævsprøver blev opnået fra patienter på The First Affiliated Hospital i Wenzhou Medical College (Wenzhou). Der var ingen restriktioner for alder, etape af CRC, køn eller histologi. Ved rekruttering, gav hvert emne skriftligt informeret samtykke ved at planlægge et interview, hvor de fik et struktureret spørgeskema. Denne undersøgelse blev godkendt af institutionelle gennemgang bestyrelse Wenzhou Medical College. De kliniske karakteristika for alle patienter er anført i tabel 1.

Cellekultur

Den humane CRC cellelinjer HCT116 og SW480 blev erhvervet fra Cell Bank of Type Culture Collection i Chinese Academy of Sciences, Shanghai Institute of Cell Biology og blev passeret i mindre end 6 måneder.

Konstruktion af det cirkulære RNA plasmid

Vi bygget det cirkulære RNA plasmid anvendt i denne undersøgelse. Konstruktionen metode er tidligere blevet offentliggjort [8]. Den resulterende konstruktion (

pcDNA3

.

1-cir-ITCH

) blev bekræftet ved direkte sekventering.

RNA ekstraktion og real-time kvantitativ polymerasekædereaktion

Totalt RNA blev isoleret fra celler og væv under anvendelse af TRIzol reagens ifølge producentens anvisninger. Den relative genekspression af

cir-ITCH

blev bestemt under anvendelse qPCR, som er baseret på den TaqMan metoden.

GAPDH

blev anvendt som en indre standard kontrol, og alle reaktioner blev udført i tre eksemplarer [12, 13]. Primerne anvendt til qPCR amplifikation er den forreste GCAGAGGCCAACACTGGAA, den omvendte TCCTTGAAGCTGACTACGCTGAG, proben CCGTCCGGAACTATGAACAACAATGGCA.

RNase R fordøjelse

RNase R digereringsreaktionen udførtes ifølge tidligere offentliggjorte procedurer. Fordøjelse og udfældningsreaktioner blev gentaget to gange med et forhold på 3 U enzym /mg RNA [14].

Forbigående transfektioner og luciferaseassays

HCT116 og SW480-celler blev transficeret med reporter plasmider beskrevet ovenfor ved anvendelse af Lipofectamine 2000. Celler blev co-transficeret med de miRNA ifølge producentens anvisninger [15]. Hver gruppe omfattede 6 replikater, og tredobbelte udførtes uafhængige forsøg.

actinomycin D assay

HCT116 og SW480-celler blev transient transficeret under anvendelse af Lipofectamine 2000 og blev co-transficeret med mRNA’er som angivet i 24 timer . Cellerne blev derefter udsat for actinomycin D. Cellerne blev høstet, og stabiliteten af ​​

cir-ITCH

mRNA blev analyseret ved anvendelse af kvantitativ revers transkription-PCR (QRT-PCR). Assayet blev udført ifølge den tidligere artikel.

Western blot-

Western blot-analyse for at vurdere Wnt3a, β-catenin og β-action-ekspression blev udført som tidligere beskrevet [16].

cellelevedygtighed assay

cellelevedygtighed blev målt under anvendelse af Cell Counting Kit-8 (CCK-8) ifølge producentens instruktioner. Der var 6 gentagelser for hver gruppe, og forsøgene blev gentaget mindst 3 gange.

statistiske analyser

Sammenhængen mellem ekspression af

cir-ITCH

og

ITCH

gen i CRC væv blev bestemt ved anvendelse af envejs variansanalyse og lineær regressionsmodeller. Forskelle mellem grupperne blev vurderet ved en parret, 2-tailed t-test. En

P

-værdi af. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Identifikation af cirkulære RNA

To sæt

ITCH Salg primere blev udformet til denne undersøgelse: en divergerende sæt til amplifikation kun den cirkulære form, og en konvergent indstillet til amplifikation de lineære former. Vi bekræftede, at den cirkulære form, blev amplificeret under anvendelse af de divergerende primere. cDNA og genomisk DNA blev anvendt som kontroller. Som forventet blev ingen amplifikation observeret ved anvendelse af de divergerende primere på genomisk DNA. GAPDH blev anvendt som den lineære kontrol (Fig 1A).

(A) Konvergent primere kan amplificere cirkulære RNA’er og lineære RNA’er. Divergerende primere opformere cirkulære RNA’er kun i cDNA sammenlignet med genomisk DNA (gDNA). GAPDH er lineær styring. (B)

cir-ITCH

blev udtrykt på et højere niveau i ca. 75,6% af CRC tilstødende væv i forhold til at matche CRC væv. Udtrykket niveau af

cir-ITCH

blev analyseret ved QRT-PCR baseret på Taq-mand og normaliseret til

GAPDH

. Data er repræsenteret som middelværdi ± SEM fra tre uafhængige forsøg. (C) Tilfældige primere og oligodT primere blev anvendt henholdsvis i revers transkription eksperimenter. Den forudsagte

cir-ITCH

er fraværende i poly (A) beriget prøver. (D) Den forudsagte

cir-ITCH

er reagerer mod at RNase R behandling. 2-tailed t-test blev anvendt i test forskellene mellem grupperne * p 0,05 sammenlignet med kontrol.

Angivelse af

cir-ITCH

i CRC og det omgivende væv

Vi brugte divergerende sæt primere og udnyttet en TaqMan-baserede QRT-PCR-assay til at validere tilstedeværelsen af ​​den cirkulære RNA i 45 CRC væv og parret ikke-kræft væv.

cir-ITCH

blev udtrykt på et højere niveau i ca. 75,6% af CRC væv sammenlignet med de matchede ikke-kræft prøver (figur 1B).

Karakterisering af

cir -ITCH

i CRC celler

Vi konstruerede en vektor til at udtrykke

cir-ITCH

i celler efter den tidligere undersøgelse, og derefter udførte eksperimenter. De konstruerede plasmider blev transient transficeret ind i HCT116 og SW480 celler.

I revers transkription eksperimenter anvendte vi tilfældige primere og oligo (dT) primere. De cirkulære produkter blev udtømt i polyA-berigede prøver sammenlignet med de lineære produkter. Ved brug af oligo (dT) primere, udtrykket mængde (normaliseret til GAPDH) af lineære

ITCH

var signifikant højere end for cirkulær

ITCH

(Fig 1C) [11].

Vi brugte enzymet RNase R, en højt processiv 3′-5 ‘exoribonuclease, at teste vores forudsigelser af de cirkulære RNA egenskaber. Denne exonuclease nedbryder lineære RNA molekyler i en 3’-5 ‘retningen, men det virker ikke på cirkulære RNA [17, 18]. Som forventet i modsætning til de lineære kontrol RNA’er, som blev nedbrudt, den forudsagte cirkulære RNA var resistent over for RNase R behandling (Fig 1D).

Interaktion mellem

cir-ITCH

og miRNA

for nylig har cirkulær RNA blevet identificeret som en rigelig klasse af regulatoriske udskrifter, der fungerer som miRNA svampe [5, 8]. Miranda software blev brugt til at forudsige målet miRNA. Sekvensen af ​​de forudsagte microRNA bindingssteder blev præsenteret i tabel 2. Vi fandt, at MIR-7, MIR-20a, og MIR-214 kan binde til 3′-utranslaterede region (UTR) af

ITCH

og

cir-ITCH

. Derfor vi indsat

ITCH

bindende sekvens i psiCHECK-2 og fremstillet luciferase reportere for disse 3 miRNA ved forbigående co-transfektion dem i HCT116 celler. Konstruktionen havde signifikant reduceret luciferaseaktivitet for miR-7, miR-20a, og miR-214 i en koncentrationsafhængig måde i kontrol HCT116 celler (1 pmol miRNA-7: 1,02 ± 0,028 versus 1,236 ± 0,068,

P

= 0,05; 40 pmol miRNA-7: 0,808 ± 0,052 versus 1,236 ± 0,068,

P

= 0,02; 1 pmol miRNA-20a: 2,09 ± 0,123 versus 2,498 ± 0,068,

P

= 0,02; 40 pmol miRNA-20a: 1,887 ± 0.11versus 2,498 ± 0,068,

P

= 0,006; 1 pmol miRNA-214: 1,511 ± 0,059 versus 1,88 ± 0,043,

P

= 0,03; 40 pmol miRNA-214: 1,38 ± 0,058 versus 1,88 ± 0,043,

P

= 0,006). Lignende resultater blev fundet, når vi gentog de samme eksperimenter i kontrollen SW480 celler.

Vi udførte det samme eksperiment i

cir-ITCH

hyper-ekspression celler. Resultaterne viste, at der ikke var signifikante forskelle i luciferaseaktivitet når psiCHECK-2-

ITCH

-bindingssite med miR-7 og miR-20a blev transficeret i HCT116 og SW480 celler, men at der var en signifikant forskel for miR-214 (1 pmol miRNA-7: 1,147 ± 0,041 versus 1,236 ± 0,042,

P

= 0,069; 40 pmol miRNA-7: 1,138 ± 0,015 versus 1,236 ± 0,042,

P

= 0,12; 1 pmol miRNA-20a: 2,424 ± 0,017 versus 2,526 ± 0,058,

P

= 0,11; 40 pmol miRNA-20a: 2,345 ± 0,04 versus 2,526 ± 0,058,

P

= 0,069 ; 1 pmol miRNA-214: 1,539 ± 0,038 versus 1,877 ± 0,039,

P

= 0,001; 40 pmol miRNA-214: 1,407 ± 0,051 versus 1,877 ± 0,039,

P

= 0,004) ( fig 2A).

(A) Relativ luciferaseaktivitet af psiCHECK-2-ITCH konstruerer cotransficeret med mIR-20a, mIR-7, mIR-214 og inhibitor i HCT116 og SW480 celler. I

cir-ITCH

hyper-ekspression celler, var der ingen signifikante forskelle i luciferase aktivitet, når psiCHECK-2-

ITCH

-bindingssite med miRNA blev cotransficeret ind i HCT116 og SW480 celler. Seks gentagelser for hver gruppe og forsøget gentages mindst tre gange. Data er gennemsnit ± SEM. (B) HCT116 og SW480 celler efter transficeret med

cir-ITCH Salg og Kontrolceller blev henholdsvis transficeret med MIR-20a, MIR-7 og inhibitor i 24 timer og blev derefter yderligere eksponeret for actinomycin D i 1, 2 og 3 timer. Celler blev høstet og stabiliteten af ​​

cir-ITCH

mRNA blev analyseret ved QRT-PCR i forhold til tid 0 efter blokering nye RNA-syntese med actinomycin D; data er gennemsnit ± SEM, normaliseret til

GAPDH

.

HCT116 og SW480 celler transficeret med konstruerede plasmid blev behandlet med actinomycin D i tilstedeværelse af en eller 40 pmol af miR-7 og mIR-20a, og det totale RNA blev høstet ved de angivne tidspunkter. Resultaterne viser, at i kontrol- celler,

cir-ITCH

niveauer forblev på 20-30%; men der var en lille ændring i den

cir-ITCH

niveauer i HCT116 celler efter inkubation med actinomycin D. Vi gentog disse eksperimenter i SW480 celler med de samme resultater (Fig 2B).

Foreningen af ​​

cir-ITCH

ITCH

i CRC

for nylig

cir-ITCH

blev rapporteret at regulere genekspression gennem sin rolle som miRNA svamp, og dermed beskytte de miRNA ‘target gener. Derfor testede vi sammenhængen mellem

cir-ITCH

ITCH

i yderligere 15 par CRC adjuvans ikke-kræft væv. Resultaterne viste, at patienter med højere

cir-Kløe

ekspressionsniveauerne i CRC væv havde en væsentlig opregulering af lineære

ITCH

(R

2 = 0,32,

P

0,01;. figur 3A)

(A) de lineære korrelationer mellem de

cir-kløe

ekspressionsniveauerne og lineær

ITCH

blev testet. Den relative udtryk værdi blev normaliseret ved

GAPDH

udtryk niveau. (B) En TCF luciferase reporter assay blev udført. Luciferaseaktiviteten blev normaliseret til Renilla luciferaseaktivitet. (C) De proteinniveauer af Wnt3a og β-catenin blev vurderet i CRC celler (HCT116-celler og SW480 celler) ved Western blot. (D) mRNA niveau af

c-myc

cyclinD1

blev påvist ved kvantitativ RT-PCR efter transficeret med

cir-Kløe

eller kontrol celler i CRC celler. (Den øverste er

c-myc

og den nederste er

cyclinD1

) Dataene er gennemsnit ± SEM og repræsentant for tre uafhængige forsøg. (E) HCT116 og SW480-celler blev podet i plader med 96 brønde efter blevet transficeret, og celleproliferation blev udført dagligt i 3 dage under anvendelse af CCK-8 assay. Seks replikater for hver gruppe og eksperimentet gentaget tre gange. Data er gennemsnit ± SEM. *

P

. 0,05 sammenlignet med kontroller

cir-ITCH

er involveret i reguleringen af ​​Wnt /β-catenin signalvejen in vivo

ITCH protein ubiquitinerer den phosphorylerede form af Dvl2 og fremmer dens nedbrydning, derved hæmmer kanonisk Wnt signalering [19]. For yderligere at kontrollere, om

cir-ITCH

regulerer Wnt /β-catenin signalvejen i CRC celler, brugte vi en β-catenin /TCF-responsiv luciferase reporter assay. Resultaterne viste, at overekspression af ITCH inhiberede TOP flash aktivitet på en dosis-afhængig måde (figur 3B). Den β-catenin og Wnt3a niveauer blev analysised anvendelse af Western-blot i celler med

ITCH

hyperekspression, og som vist i fig 3C, der var helt klart fald i β-catenin-niveauer, mens der ikke var nogen ændring i Wnt3a ekspression. Vi derefter testet udtryk for

c-myc

cyclinD1

, to målgener af Wnt /β-catenin signalvej, i celler transficeret med

cir-ITCH

. Deres udtryk blev også undertrykt (figur 3D).

cir-ITCH

modulerer cellevækst

Vi udførte CCK-8 analyser til at teste effekten af ​​

kreds ITCH

på celleproliferation i CRC celler. Vi observerede en konsekvent fald i celle spredning af HCT116 (28% -39% fald) og SW480-celler (15% -33% fald), når

cir-ITCH

blev overudtrykt på fysiologiske niveauer gennem CCK-8 analyser sammenlignet med kontrolgruppen (fig 3E).

diskussion

i denne undersøgelse identificerede vi

cir-ITCH

i CRC og fandt, at det var dramatisk down- reguleret i CRC væv under anvendelse af en TaqMan-baseret revers transkriptase polymerasekædereaktion assay, hvilket indikerer den potentielle funktion

cir-ITCH

i CRC. En række forsøg illustrerede sammenhængen mellem

cir-ITCH

og miRNA, demonstrerer, at

cir-ITCH

spiller en vigtig rolle som miRNA svamp i processen med CRC udvikling.

Tusinder af lincRNAs er blevet identificeret hos mennesker og mus, og mange er tæt knyttet til udviklingen af ​​forskellige typer af cancer, såsom esophageal pladecellecarcinom (ESCC) og endometrisk carcinom [20, 21]. Cirkulære RNA er en type af lincRNA der spiller en rolle i tumorudvikling. Så vidt vi ved,

ITCH

er en af ​​de E3 ubiquitin protein ligaser der specifikt målrettes p73 [22], Dvl2 [19], og Notch1 [23], som alle er normalt forbundet med tumordannelse og kemosensitivitet.

Selvom funktionerne af miRNA er langt fra at være fuldt forstået, det forudses, at ca. 30% af protein-kodende gener styres af miRNA [24], og nogle undersøgelser har antydet, at miRNA kan binde til 3 ‘-UTR af

ITCH

at mindske sin udtryk [25]. Memczak et al. (2013) og Hansen et al. (2011) foreslog, at cerebellar degeneration-relateret protein 1 (CDR1) locus huser 70 bevarede kampe til miR-7 frø. Denne slående træk foreslået, at cirkulær RNA har en mulig funktion som miRNA svamp [5, 8, 26]. Tidligere forskning har vist, at

cir-ITCH

virker som en svamp for miR-7, miR-17, og miR-214, mens der i den foreliggende undersøgelse, fandt vi, at i CRC-cellelinjer, miR-7 og mIR-20a nedregulere

ITCH

ekspression ved binding til dets 3′-UTR. Endvidere er disse miRNA altid næret af

cir-ITCH

. I vores undersøgelse,

cir-ITCH

ikke virke som en svamp for miR-214. Til vores viden, ektopisk udtryk for miR-214 undertrykker proliferation, migration og invasion in vitro, mens miR-214 knockdown fremmer proliferation, migration og invasion i CRC-cellelinjer [27].

miRNA har længe været forbindelse med cancer. Forhøjet MIR-7-ekspression er blevet beskrevet i en række forskellige tumortyper, herunder CRC, og har været impliceret i onkogenese, klassificering og cancer progression [28]. MIR-20a bidrager til forøget proliferation og invasivitet af CRC-celler [29]. Baseret på denne information, vores data kontrollere vores forgængere arbejde. Ud fra ovenstående data, blev det vist, at

cir-ITCH

deltager i udviklingen af ​​CRC gennem regulering af miRNA-aktivitet.

Aberrant regulering af Wnt signalvejen er opstået som en fremherskende tema i cancer biologi, og det er afgørende for indtræden og progression af human CRC. Ca. 90% af sporadiske coloncancerformer viser afvigende Wnt signalering [30].

cir-ITCH

virker som en miRNA svamp og øger niveauet af

ITCH

, som er involveret i Wnt /β-catenin vej. Ifølge tidligere forskning, kan ITCH fremme ubiquitinering og nedbrydning af phosphoryleret Dvl2 og dermed hæmme kanonisk Wnt signalering [19]. En β-catenin /TCF-responsive luciferase reporter assay blev anvendt til at undersøge, om et enkelt gen regulerer Wnt /β-catenin-signalvejen. Vores undersøgelse og andre tidligere resultater rapporteret, at overekspression af

cir-ITCH

betydeligt undertrykt den relative TCF transkriptionel aktivitet.

De onkogener

c-myc

cyclinD1

er effektor proteiner af karyomitosis signal, som kan udløse og regulere transkriptionen af ​​gener relateret til proliferation. De er ofte overudtrykt i flere humane tumorer, herunder CRC [31]. Vores resultater viste, at i celler transficeret med

cir-ITCH

, ekspressionen af ​​

c-myc

cyclinD1

blev markant nedsat. Vi foreslår derfor, at

cir-ITCH

har en hæmmende effekt på den kanoniske Wnt-vejen.

cir-ITCH

spiller en anti-tumor rolle ved at kontrollere miRNA aktivitet, og det har en hæmmende effekt på den kanoniske Wnt vej, hæmme

c-myc

cyclinD1

udtryk.

sammenfattende vores nuværende undersøgelse viser, at miRNA svamp

cir-ITCH

repræsenterer en ny generation af teknologi til miRNA hæmning.

cir-ITCH

er involveret i Wnt /β-catenin vej, og ved at hæmme denne vej, det spiller en rolle i CRC.

Tak

Dette arbejde blev støttet ved bevilling fra Wenzhou Videnskab og Teknologi Bureau Natural Science Foundation (Y20140700).