PLoS ONE: Intrinsic radiosensitivitet og Cellular Karakterisering af 27. Canine Cancer Cell Lines

Abstrakt

Canine kræftceller har gradvist udviklet, men er stadig ikke optimalt ressourcer til stråling biologi forskning. Måling af den cellulære iboende radiosensitivitet er vigtigt, fordi forstå forskellen kan tilvejebringe en ramme for yderligere at belyse profiler til forudsigelse af stråleterapi respons. Vores undersøgelser har fokuseret på at karakterisere forskellige hunde kræft cellelinjer

in vitro

og forstå parametre, der kan bidrage til iboende radiosensitivitet. Først blev iboende radiosensitivitet af 27 hunde kræft cellelinier afledt fra ti tumortyper bestemmes under anvendelse af et klonogent assay. De 27 cellelinjer havde varierende radiosensitivities uanset tumortype (overlevelse fraktion ved 2 Gy, SF2 = 0,19-0,93). For at forstå parametre, der kan bidrage til iboende radiosensitivitet vurderede vi forholdet af cellulær radiosensitivitet med basiske cellulære karakteristika af cellelinier. Der var ingen signifikant korrelation af SF2 med S-fasen fraktion, fordoblingstid, kromosom nummer, ploidi, eller antallet af metacentriske kromosomer, mens der var en statistisk signifikant sammenhæng mellem SF2 og plating effektivitet. Dernæst valgte vi de fem mest radiosensitive cellelinier som radiosensitive gruppe og de fem mest radioresistente cellelinier som radioresistente gruppen. Derefter vurderede vi kendte parametre for celledrab ved ioniserende stråling, herunder strålingsinduceret DNA dobbeltstrengsbrud (DSB) reparation og apoptose, i radiosensitive gruppe sammenlignet med radioresistente gruppen. Høje niveauer af resterende γ-H2AX foci på stederne for DSB’er var til stede i fire ud af de fem radiosensitive hunde cancercellelinier. Vores undersøgelser antydet, at væsentlige forskelle i indre radiosensitivitet eksisterer i hunde cancer cellelinjer, og stråleinduceret DSB reparation var relateret til radiosensitivitet, hvilket er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser af mennesker. Disse data kan hjælpe yderligere undersøgelser med fokus på påvisning af DSB til at forudsige individuelle reaktion på strålebehandling for hunde, uanset tumortype

Henvisning:. Maeda J, Froning CE, Brents CA, Rose BJ, Thamm DH, Kato TA (2016) Iboende radiosensitivitet and Cellular Karakterisering af 27 Canine cancercellelinjer. PLoS ONE 11 (6): e0156689. doi: 10,1371 /journal.pone.0156689

Redaktør: Ying-Jan Wang, National Cheng Kung University, TAIWAN

Modtaget: Januar 14, 2016 Accepteret: 18. maj 2016 Udgivet: 3 juni 2016

Copyright: © 2016 Maeda et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Finansieringen blev leveret af Dr. Akiko Ueno Radiobiologi Fund (TAK). Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kræft er en væsentlig dødsårsag hos hunde såvel som hos mennesker. Menneskelige og hunde kræft har lignende egenskaber, ikke kun i anatomiske og histopatologiske udseende, men også biologisk adfærd, tumor genetik og respons på konventionel behandling [1, 2]. Canine kræftmodeller er dukket op som værdifulde ressourcer i studiet af human cancer [2]. I menneskelige kræftforskning, mange godt karakteriserede humane kræftceller er til rådighed for kræftforskning. Kræft cellelinjer er ofte blevet brugt som

in vitro

eksperimentelle modelsystemer og har vist sig at være nyttig for at udforske den underliggende biologi for kræft [3]. Canine cancercellelinier har gradvist udviklet og anvendt, men er ikke så fuldstændigt karakteriseret som humane cellelinier. Undersøgelse af cellebiologi gennem beskrivelser af hunde kræft cellelinjer kan give yderligere oplysninger om kræft biologi, nogle er specifikke for hunde, og nogle potentielt supplerer dem rapporteret for human cancer.

Tumorer selv med samme histopatologiske oprindelse kan vise en bred vifte af følsomhed over for strålebehandling [4, 5]. Måling af cellulære iboende radiosensitivitet er vigtigt, fordi forstå forskellen kan tilvejebringe en ramme for yderligere at belyse profiler til forudsigelse af strålebehandling (RT) reaktion. Iboende radiosensitivities målt ved

in vitro Salg kolonidannelse assays er udtrykt som SF2, fraktionen af ​​celler overlever en enkelt 2 Gy dosis af ioniserende stråling (IR). Dosen af ​​2 Gy er også en almindeligt anvendt dosis pr fraktion i klinisk RT i mennesker. Den SF2 hos mennesker har vist sig at forudsige tumor respons

in vivo

i tidligere undersøgelser [6, 7]. Sådanne undersøgelser har antydet, at forskelle i indre radiosensitivitet eksisterer og forstå de mekanismer, i væsentlig grad kan påvirke praksis for personlig RT [4, 5].

De mekanismer der ligger til grund forskellene i indre radiosensitivitet af tumorceller sandsynligvis multifaktorielle [5] . Reparation af DNA dobbelt-strengbrud (DSBs) er kendt som en af ​​de vigtigste elementer, der bestemmer iboende radiosensitivitet fordi disse læsioner, hvis ikke-udbedret, føre til celledød [8]. Tidligere har fordelingen af ​​cellerne i de faser af cellecyklus og DNA /kromosom indhold blevet foreslået som faktorer, der kan påvirke iboende radiosensitivitet af tumorceller [9, 10]. Endvidere kunne en del af forskellene kunne tilskrives de tendens til at undergå apoptose som reaktion på stråling som set i lymfoide tumorer [11]. Imidlertid har inkonsistente korrelationer med radiosensitivitet af humane tumorceller blevet rapporteret i målingen af ​​disse parametre, og etablering af et nyttigt assay, der forudsiger iboende radiosensitivitet er stadig under efterforskning [4].

Vores undersøgelser har fokuseret på at karakterisere diverse hunde cancer cellelinjer

in vitro

forståelse parametre, der kan bidrage til iboende radiosensitivitet. Denne grundlæggende karakteristik kan give oplysninger om disse cellelinjer til yderligere forskning i forudsigelse af strålebehandling respons. Vi undersøgte den iboende radiosensitivitet af 27 hunde kræft cellelinier afledt fra ti tumortyper. Hver cellelinje blev karakteriseret ved en kombination af data, der repræsenterer cellecyklusfordeling, cellulær fordoblingstid, kromosom nummer, DNA ploidi mønster og udpladningseffektivitet. De kendte parametre, herunder DNA DSB reparation effektivitet og apoptose efter udsættelse ioniserende stråling blev evalueret mellem udvalgte radiosensitive og radioresistente cellelinjer.

Materialer og metoder

Cell Culture

27 hunde tumorcellelinjer blev venligt leveret af Flint Animal Cancer center i Colorado State University (Fort Collins, CO, USA) (tabel 1) [12]. Klæbende tumorcellelinier blev dyrket i Minimum Essential Medium (MEM /EBSS, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 1% MEM vitaminer, ikke- essentielle aminosyrer, natriumpyruvat, penicillin, streptomycin og fungizon. Suspension tumorceller blev dyrket i RPMI 1640 medium (Gibco Life Technologies) suppleret med det samme som MEM. Cellelinjer blev opretholdt ved 37 ° C i en fugtig inkubator med 95% luft og 5% CO

2.

Cell Proliferation

For at bestemme de fordobling tider cellelinierne blev celler udpladet ved forskellige koncentrationer i 35 mm dyrkningsskåle. Cellerne blev inkuberet ved 37 ° C. Antallet af celler blev talt for hver 24 timer under anvendelse af en Coulter-tæller Z1 (Beckman Coulter, La Brea, CA). Cellular fordobling gange blev beregnet ved hjælp af Prism 5 software (Graph Pad Software, La Jolla, CA). Mindst tre uafhængige forsøg blev udført.

kromosom nummer

Celler blev dyrket med 0,1 ug /ml colcemid (Invitrogen, Carlsbad, CA) i 6 timer for at høste metafasekromosomer. Prøver blev behandlet i hypotonisk 75 mM KCI-opløsning i 20 minutter ved 37 ° C og fikseret i 3: 1 (methanol: eddikesyre) fiksering opløsning tre gange. Metafasespredninger blev farvet med Giemsa-opløsning, og blev observeret kromosomet nummeret under et Axioplan mikroskop (Carl Zeiss, Jena, Tyskland). Et minimum på 100 celler i metafase blev analyseret for at tælle kromosomer per celle. Mindst 50 celler i metafase blev analyseret for at tælle metacentriske kromosomer per celle.

Cell Cycle Analysis

Cellekulturer ved 60% til 70% konfluens blev fikseret i 70% ethanol ved -20 ° C natten eller længere. Celler blev derefter centrifugeret ved 1.500 rpm i 5 minutter og vasket en gang med PBS. Celler blev derefter resuspenderet i 1 ml farveopløsning (20 ug /ml propidiumiodid, 0,1% Triton X-100, 500 pg /ml RNase A) og inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur. Analyse blev udført ved hjælp af et FACSCalibur flowcytometer med Cell Quest Pro (BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ) og ModFit LT software (Verity, Topsham, ME). Tre uafhængige forsøg med hver cellelinje blev udført. Ploidi blev estimeret som DNA-indholdet i G1 celler i tumorcellerne normaliseret til diploide ovarieceller fra kinesisk hamster.

Bestråling

log-fase-kulturer blev bestrålet med forskellige doser af

137Cs gamma stråler ved hjælp af en JL Shepherd Model Mark i-68 nominelt 6000 Ci

137Cs strålerøret (JL Shepard, Carlsbad, CA), leveres på ca. 2,5 Gy /min ved stuetemperatur.

Klonogen Survival Assay

radiosensitivitet blev målt ved klonogenisk assay for nonsuspension cellelinjer. Tilfældigt delende celler i T-12.5 kolber blev bestrålet, trypsineret og udpladet in triplo på 100 mm eller 60 mm dyrkningsskåle ved passende celledensitet. Efter inkubering i 1-2 uger for at tillade kolonidannelse, blev retter skyllet med 0,9% NaCl, fikseret med 100% ethanol og farvet med 0,1% krystalviolet. Hver koloni bestående af mere end 50 celler blev scoret som en overlevende. Mindst tre uafhængige forsøg blev udført, så overlevelse kurver blev tegnet med lineære-kvadratisk regression ligninger med Prism 5-softwaren. Overlevelsen fraktionen ved 2 Gy stråling (SF2) og overlevelse fraktionen ved 5 Gy stråling (SF5) blev opnået ved interpolation af celle overlevelse som estimater for iboende radiosensitivitet af hver cellelinie.

For suspensionskulturer, en begrænsende fortynding assay blev anvendt som tidligere anvendt i humane cancercellelinier [13, 14]. Celler blev udpladet i 96-brønds mikrotiterplader ved densiteter på 1-200 celler per brønd ved to eller tre celledensiteter per dosis punkt. Efter bestråling blev pladerne inkuberet ved 37 ° C i 2-3 uger før lave som negative eller positive for vækst baseret på mikroskopisk undersøgelse (dvs. brønde, hvor cellevækst havde fundet sted er positive). Baseret på Poissonfordelingen blev overlevelse fraktioner beregnet som tidligere beskrevet [15].

γ-H2AX Foci i G1-bestrålede celler

Induktion af, og resterende DNA DSB’er af IR blev vurderet ved hjælp af den γ-H2AX assay. Vi udførte assayet med celler synkroniseret og vedligeholdes med G1 under bestråling ved anvendelse af isoleucin deprivation metoden [16]. Dette blev gjort, fordi ikke-bestrålede celler i S-fasen har meget højere niveauer af γ-H2AX foci, og også fordi antallet af foci per celle afhænger af DNA-indhold [17]. Celler blev dyrket i 24 timer på plast kammerobjektglas til ca. 50% konfluens og vaskes med PBS gang. Den normalt vækstmedium blev udskiftet to gange i 1,5 fordoblingstider med isoleucin-deficient MEM indeholdende 5% 3 × dialyseret FBS at synkronisere cellerne i G1-fasen. Efter G1 synkronisering og udsættelse for 0 Gy eller 1 Gy gammastråling, blev celler inkuberet med 5-ethynyl-2′-deoxyuridin (edu) i 30 minutter (enten direkte eller efter 5,5 timers inkubation til reparation). Edu-mærkning blev anvendt til at bedømme G1 synkronisering [18]. Cellerne blev derefter vasket i PBS og fikseret i 4% paraformaldehyd efterfulgt af permeabilisering med 0,5% Triton-X 100 og 0,1% SDS. Edu blev først farves som producentens anvisninger. Objektglas blev vasket tre gange i PBS, fikseret i 4% paraformaldehyd og blokeret i PBS med 10% gedeserum natten over ved 4 ° C. Efter inkubation natten over blev cellerne inkuberet med en phosphoryleret histon H2AX antistof (Ser139) (γ-H2AX) (Millipore, Billerica, MA) og efterfulgt af Alexa 594 Fluor-konjugeret gede-anti-muse-antistof (Molecular Probes, Eugene, OR) . Cellerne blev monteret i en opløsning med DAPI indeholdende langsom fade (Invitrogen). Digitale billeder blev taget med et Axioskop motoriseret Z-fase mikroskop (Carl Zeiss) med CoolSnapHQ2 (Photometrics, Tucson, AZ) og Metamorph software (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Billederne blev brugt til at tælle γ-H2AX foci per celle. Tre uafhængige forsøg blev udført og numre af γ-H2AX blev talt i minimum 50 edu farvning negative celler for hver prøve i hvert forsøg.

Analyse af apoptose

apoptoseinduktion ved IR blev vurderet ved hjælp af caspase 3/7 aktivering, Annexin V farvning og terminal deoxynucleotidyltransferase (TdT) -medieret deoxyuridintriphosphat nick ende-mærkning (TUNEL) assay. Logaritmisk fase voksende celler blev bestrålet med 0 Gy eller 5 Gy gamma-stråler. Efter 16 timers inkubation blev tidlig apoptose målt med aktiveringen af ​​caspase 3/7 af Caspase-Glo 3/7 kit (Promega, Madison, WI). Glød Luminesce på 10.000 celler blev målt ved Lumat LB9507 (Berthold teknologier, Oak Ridge, TN). Efter 24 timers inkubation blev tidlig /sen apoptose målt med Annexin V-farvning af FITC Annexin V apoptose afsløring kit med 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA). Annnexin V positive, men 7-AAD negative (tidlige apoptotiske celler) og Annexin V positive og 7-AAD positive (sent apoptose) blev bestemt ved Guava-PCA flowcytometer. Efter 48 timers inkubation blev sent apoptose målt med TUNEL-assay og fragmenteret cellekernemorfologi. De cytogentrifuged celler blev fikseret med 4% paraformaldehyd og iskold 70% ethanol. Cellerne blev inkuberet i reaktionsblandingen indeholdende 1,5 mM CoC

2, 12,5 U TdT, 1 mM 5-brom-2′-deoxyuridin-5′-triphosphat i TdT puffer (Br-dUTP, Sigma-Aldrich: de andre Roche, Indianapolis, IN) i 4 timer ved 37 ° C i mørke. Objektglassene blev inkuberet med et monoklonalt muse BrdU antistof og Alexa 488 Fluor-konjugeret gede-anti-muse-antistof. Endelig blev cellerne modfarvet med DAPI. Ca. 1.000 kerner fra hver dias blev talt, og TUNEL positive frekvenser blev beregnet. Apoptose forhold blev også bestemt ved at score DAPI farvning celler med fragmenteret nukleare morfologi.

Western Blotting

Celler blev lyseret med M-PER pattedyrprotein Extraction Reagent (Thermo Fisher Scientific) og proteasehæmmere. Proteinekstrakter (20 ug per prøve) blev størrelsesfraktioneret på NuPage 4-12% Bis-Tris-geler (Invitrogen), elektro-overført til nitrocellulosemembraner (Bio-Rad) i puffer (25 mM Tris, 192 mM glycin, 20% (vol /vol) methanol og 0,01% SDS) ved en strømtæthed på 3,0 mA /cm

2 i 16 timer ved 4 ° C. Filtrene blev blokeret med Tris-bufret saltvand med 0,05% Tween 20 indeholdende 2% (vægt /volumen) skummetmælk, og omsættes med et primært antistof i 2 timer ved stuetemperatur, efterfulgt af en inkubation med et sekundært antistof i 1 time ved stuetemperatur. De immunreaktive signaler blev påvist under anvendelse SuperSignal Western Blotting Detection Kit (Thermo Fisher Scientific) og en ChemiDoc XRS + System (Bio-Rad). Proteinekspression fra bånd styrke blev analyseret af Image Lab-software (Bio-Rad). De primære antistoffer anvendt i denne undersøgelse, var det muse-anti-DNA-PKcs monoklonalt antistof (Ab-4, NeoMarkers, Fremont, CA), kanin-anti-RAD51 polyklonalt antistof (H-92; Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA), kanin-anti-FANCD2 polyklonalt antistof (NB100-182; Novus Biologicals, Littleton, CO) og det monoklonale muse beta-actin antistof (Abram 8226; Abcam, Cambridge, MA). De sekundære antistoffer blev gede-anti-muse-IgG HRP-konjugeret antistof (1: 10.000) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA) og gede-anti-kanin IgG HRP-konjugeret antistof (1: 10.000) (cellesignalering, Boston MA ). Hver udtryk band blev estimeret ud fra molekylvægten af ​​hvert protein og påvist i human cancer cellelinje A549 band.

Statistisk analyse

For statistisk analyse, GraphPad Prism 5 software blev anvendt. D’Agostino-Pearson-test blev anvendt til at bestemme, om de værdier, der normalt blev uddelt. Forskelle med en P-værdi på mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Korrelationer af SF2 og andre parametre blev bestemt ved Pearson test. Statistiske sammenligninger af middelværdier i γ-H2AX assay (kontrol vs. 6 timer efter 1 Gy) blev udført under anvendelse Kruskal-Wallis test efterfulgt af Dunns multiple sammenligningstest. Statistisk sammenligning af middelværdier i SF2 /SF5 (radioresistente gruppe vs radiosensitive gruppe) og i apoptose assayet (0 Gy versus 5 Gy) blev udført under anvendelse af uparret tohalet t-test.

Resultater

Grundlæggende karakterisering af Canine kræftcellelinjer

Hver cellelinje blev karakteriseret af en kombination af data, der repræsenterer cellulære fordobling tid, cellecyklus distribution, ploidi mønster og kromosom nummer, med de data, der er sammenfattet i tabel 1. Den fordoblingstider af hver cellelinje varierede fra 15 timer (CML-6M, CTAC) til 40 timer (STSA-1), der viser stor variation. Vi målte cellecyklus distribution af hver cellelinje ved flowcytometri. Procentdelen af ​​celler i hver fase af cellecyklussen varierede fra 39,3% (CLBL1) til 69,6% (BR) for G1-fasen, fra 17,3% (Parker) til 50,1% (CLBL1) for S-fase, og fra 1,52% (BR ) til 29,9% (Parker og STSA-1) til G2 /M-fasen. Disse cellelinjer viste variable gennemsnitlige antal af kromosomer, der spænder fra 57 (1771) til 155 (17CM98). Hjørnetænderne cancercellelinier viste øget antal metacentriske kromosomer (X-formede kromosomer) som følge af Robertsonian translokation arrangementer [19], med undtagelse af to cellelinier (Jones og OSW) (tabel 1). Frekvenser metacentriske kromosomer varierede blandt cellelinjer fra mindre end to, den normale karyotype, til 43,2 (D17) per celle. Alle cellelinier med undtagelse BR havde større end den diploide mængde DNA. Vi fandt overordnede aftaler mellem unormal ploidi og øget kromosom tal, men ikke altid. Nike, for eksempel, havde et mindre antal kromosom per celle med 64,4, men ploidi mønstret var mellem diploidi og triploidy.

Klonogen Survival Efter Udsættelse for Gamma-stråling

Vi bestrålede hver af de 27 hunde cancercellelinier med 0, 1, 2, 3 eller 5 Gy gamma-stråler og målte kolonidannelse. Deres overlevelse kurver er vist i figur 1. SF2 og SF5 værdier, som blev beregnet fra den lineære kvadratisk regression overlevelse kurve samt udpladningseffektivitet, er rapporteret i tabel 1. Disse data viser størrelsesordenen af ​​hunde tumorcellelinier radiosensitivities tværs af forskellige tumortyper . Den SF2 varierede fra 0,19 til 0,93 og SF5 varierede fra 0,01 til 0,60. Udpladningseffektiviteten af ​​disse cellelinjer demonstrerede også en bred variation og varierede fra 4% til 65%. Den plating effektivitet BR (4%) var for lav til at opnå pålidelige overlevelse fraktioner; Derfor blev dens radiosensitivitet ikke bruges til yderligere analyser. Den radiosensitivitet af de fire hunde OSA cellelinier (D17, Moresco, Gracie og MacKinley) målt ved klonogene assay var i overensstemmelse med dem, som tidligere er blevet offentliggjort [20]. Derfor blev dataene for de grundlæggende cellulære karakteristika (fx fordobling tid, kromosomanalyse) vist i rapporten også anvendes til analysen i denne undersøgelse. Vi evaluerede korrelationer mellem de variable cellulære egenskaber og radiosensitivitet. I disse cellelinjer, var der ingen signifikant korrelation af SF2 med S-fase fraktion, fordoblingstid, kromosom nummer, eller antallet af metacentriske kromosomer, mens der var en beskeden, men statistisk signifikant korrelation mellem SF2 og udpladningseffektivitet (R

2 = 0,34, p = 0,002, Pearson test) (figur 2). Evaluering mod SF5 viste lignende resultater på disse fås fra SF2 (R

2 = 0,24, p = 0,01, Pearson test).

Eksperimenter blev udført mindst tre gange, og fejl søjler indikerer standardfejlen af midlerne. Vi valgte de mest radiosensitive cellelinjer (røde kurver) og de mest radioresistente cellelinier (blå kurver) for den følgende analyse.

Hver prik repræsenterer en cellelinie. Korrelationerne blev vurderet ved anvendelse af Pearson testen. Linjerne blev monteret af en mindste kvadraters metode.

Udvalg af radiosensitive og radioresistente Grupper

De 27 hunde kræft cellelinier blev rangeret som radiosensitivitet parametre, SF2 og SF5, og de fem mest følsomme eller resistente linjer for hver parameter blev defineret som de følsomme og resistente grupper (fig 3A og 3B). Den valgte radioresistente gruppe viste SF2 værdier fra 0,19 til 0,44 (Nike, CML-C2, Bliley, MacKinley, STSA-1). Den radiosensitive gruppe udviste SF2 værdier over 0,86 (CMT-12, K9TCC, DEN-HSA, CMT-27, Abrams). Forskellene i tumorcelle radiosensitivitet var bedre diskriminerede når radiosensitivitet af tumorceller blev udtrykt som overlevelse fraktioner af den højere dosis (SF5). De cellelinjer i de to grupper baseret på SF5 sammenligning var lidt forskellige fra dem, baseret på SF2 sammenligning. De overlevelse fraktioner mellem to grupper af cellelinier baseret på enten SF2 eller SF5 sammenligning var statistisk forskellige (p 0,001). (Fig 3C og 3D)

27 cellelinjer er rangeret baseret på SF2 (A) og SF5 (B). Rød cirkel: radiosensitive gruppe, blå cirkel: radioresistente gruppe. (C, D) Sammenligning mellem middelværdierne for to grupper baseret på SF2 (C) eller SF5 (D). Fejlsøjler indikerer standardafvigelse. * P. 0,001 versus følsomme og resistente gruppe (uparret t-test)

Forholdet mellem Intrinsic radiosensitivitet og DNA DSB’er i G1-Irradiatied Celler

For at undersøge, om respons af celler til DNA DSB’er korrelerer med radiosensitivitet i hundens cancercellelinier, anvendte vi γ-H2AX assay i fem mest radioresistente og fem mest radiosensitive cellelinier valgt blandt SF2 ranking. Nuklear foci af phosphoryleret histon H2AX (γ-H2AX) som følge af DNA-skader er følsomme markører for DNA DSB’er [21]. Vi målte antallet af γ-H2AX foci efter 1. Gy gammastråling i G1-fase synkroniseret celler efter 30-min eller 6 timers reparationstid (figur 4). I de isoleucin deficiente medier til at synkronisere celler i G1, fleste DEN-HSA-celler døde efter en 24 timers inkubation, og CMT-12 cellelinje blev ikke synkroniseret i medierne. Derfor blev disse to cellelinier ikke anvendes til denne analyse. De andre cellelinier viste G1 synkronisering med mindre end 16% i S-fase i isoleucin deficiente medier i 1,5 fordoblingstider. I nogle celler ikke i S-fase med 0 Gy behandling blev et stort antal endogene y-H2AX foci observeret i alle de hunde cancerceller. Vi ekskluderede celler med høje niveauer af foci uden for IR-induceret fordeling fra analyse til påvisning af niveauerne af foci induceret af IR. Baseret på analysen uden celler med høje niveauer af endogene γ-H2AX foci numre, 1 Gy gammastråling inducerede signifikant højere niveauer af γ-H2AX foci efter 30 min bestråling i alle cellelinier anvendt i denne analyse (p 0,05 vs 0 Gy, ikke vist i figuren) (fig 4B). Ved 30 minutter efter bestråling, den mediane antal γ-H2AX foci var afhængig af DNA-indholdet i hver cellelinie. Desuden Radiosensitivitet CML-10C2, Nike, STSA-1 og MacKinley havde højere antal γ-H2AX foci efter seks timer efter en Gy bestråling i forhold til deres kontrol niveauer (p 0,05 vs 0 Gy). På den anden side, alle tre af de radioresistente cellelinjer og en radiosensitive cellelinje, Bliley, viste ikke signifikante forskelle mellem kontrol- og celler med 6 timer efter bestråling.

Cellerne blev synkroniseret i G1 hjælp isoleucin mangelfulde medier og derefter bestrålet med en Gy af gammastråler. Efter 30 min eller 6 hr inkubationstid blev cellerne farvet med γ-H2AX. (A) Eksempler på γ-H2AX foci (grøn) i nukleare DAPI (blå) farvning i kontrol, 1Gy efterfulgt af 30 minutters inkubering og en Gy efterfulgt af 6 timers inkubation i edu negative celler. (B) Kvantitativ analyse af gamma-H2AX foci per celle. De samlede data fra tre uafhængige forsøg scorede 50 celler i hver forsøg er vist. Baren angiver middelværdien. Statistiske betydninger er vist for kun kontrol versus 6 timer efter en Gy (ikke-parametrisk Kruskal-Wallis test).

Forholdet mellem Intrinsic radiosensitivitet og apoptose Frekvens i bestrålede celler

De fem radioresistente celle linier og de fem radiosensitive cellelinier blev også vurderet for apoptose ved 18, 24 og 48 timer efter bestråling (0 Gy og 5 Gy) (fig 5). Caspase 3/7 aktivering blev analyseret 18 timer efter bestråling (fig 5A). Annexin V-ekspression blev analyseret ved 24 timer efter bestråling (fig 5B). Aktiviteten af ​​caspase 3/7 steg i mere end to gange blev observeret i CMT-12, Abrams, CMT-27, CML-10C2, Bliley, MacKinly, og STSA-1. Procentdelen af ​​apoptotiske celler steg markant med 5 Gy bestråling i CMT-12, Abrams, CMT-27, CML-10C2, Bliley, og MacKinley ved Annexin V-analyse. Apoptotiske celler blev talt ved TUNEL farvning (Fig 5C) og DAPI angivelse (Fig 5D) og rapporteres særskilt. Selvom apoptose blev set i alle kontrolkulturer spænder fra 0,1 til 3,4% af TUNEL-farvning og 0,37-3,3% af DAPI farvning af cellerne, afhængigt af cellelinien, der var ingen signifikant forskel mellem cellelinierne. Procentdelen af ​​apoptotiske celler steg markant med 5 Gy bestråling i Abrams, Nike, og CML-10C2 af DAPI farvning i forhold til 0 Gy prøver (p 0,05, uparrede t-test) (figur 5C). Brug af målingen af ​​apoptotiske celler ved TUNEL-assayet blev observeret lignende resultater som disse ved DAPI-farvning. En betydelig stigning i apoptose frekvens af IR blev observeret i en (Abrams) ud af de fem radioresistente cellelinjer og i tre (Nike, CML-10C2 og MacKinley) ud af de fem radiosensitive cellelinjer (Fig 5D).

(A) Caspase 3/7 aktivitet målt ved luminomator ved 16 timer efter bestråling. (B) Annexin V og 7AAD farvning målt ved flowcytometer 24 timer efter bestråling. (C) TUNEL-farvning og (D) DAPI-farvning målt ved fluorescerende mikroskop. Celler bestråles med 0 Gy og 5 Gy gammastråling. *, P 0,05 versus 0 Gy og 5 Gy for hver cellelinje (uparret t-test)

Protein Expression af DNA Repair vej hos radiosensitive og radioresistente Grupper

Da DNA. DSB-reparation veje er tæt relateret til celledrab ved IR, studerede vi proteinet status af de store veje i hundens cancerceller. Vi fokuserede på de to store ikke homolog ende sammenføjning (NHEJ) og homolog rekombination (HR) i DSB reparation og Fanconi anæmi (FA) vej, der muligvis bidrager til DNA-skader reparation for bestråling. Protein udtryk for de store spillere i hver sti, DNA-PKcs i NHEJ, RAD51 i HR og FANCD2 i FA vej blev påvist ved western blotting i radioresistente og radiosensitive grupper (Fig 6). Ekspressionen af ​​DNA-PKcs, FANCD2 og RAD51 var ikke ensartet blandt cellelinierne, og der var ingen klar tendens mellem ekspressionsniveauerne i de to grupper som vist i fig 6B. Ekspressionen af ​​de tre proteiner i hundens cancerceller var generelt højere end i normale hunde fibroblaster. Vi observerede mindre ekspression af DNA-PKcs proteiner i Nike (1,4 gange den normale) og den højeste ekspression i STSA-1 (5,4 fold af normal). På FANCD2 proteinet, den laveste ekspression var i DEN-HSA (0,8 fold af normal) og den højeste ekspression var i CMT-27 (7,2 fold af normal). For RAD51 protein, den laveste ekspression i DEN-HSA (0,4 fold af normal) og den højeste ekspression var i MacKinley (3,0 fold af normal). Sammenlignet mellem hunde og human cancer cellelinje (A549), ekspressionsniveauerne af DNA-PKcs i STSA-1, som viste den højeste ekspression af de hundecellelinjer, var 10 gange mindre end den for A549.

(A) Western blot-analyse af DNA-PKcs (460 kDa), FANCD2 (165 kDa) og RAD51 (37 kDa). β-actin (42 kDa) ekspression blev anvendt som kontrol. Hvert udtryk bånd blev estimeret ud fra molekylvægt. (B) Band intensiteten af ​​western blot. (C, D) Repræsentative billeder for RAD51 foci (C) og FANCD2 foci (D) co-lokaliseret med gamma-H2AX i Moresco celler.

Vi observerede også foci af RAD51 og FANCD2 som funktionelt co-lokaliseret med γ-H2AX på replikationen stress uden bestråling i alle 27 cellelinjer (fig 6C og 6D). En anden fordel til afprøvning RAD51 og FANCD2 var, at disse protein foci formationer kræver andre opstrøms proteiner, såsom fem RAD51 paralog proteiner og otte Fanconi anæmi proteiner [22-24]. Derfor detektering foci-dannelse muligt for os at screene for tilstedeværelsen af ​​disse opstrøms proteiner i alle de 27 hunde cancercellelinjer. Vi observerede funktionelle foci af RAD51 og FANCD2 i alle cellelinjer.

Diskussion

De 27 hunde kræft cellelinjer afledt fra ti forskellige tumortyper anvendes i den foreliggende undersøgelse havde varierende radiosensitivities uanset tumor skrive med SF2 værdier 0,17 til 0,94 (figur 1 og tabel 1). Fra tidligere radiosensitivitet data via en lang række humane tumorer, SF2 varierede fra 0.038-0.95 [13]. Den nedre område for SF2 rapporteret i den menneskelige studie var mest på grund af lymfoide tumorer, som ikke var meget radiosensitive i vores hunde resultat hvor SF2 blev målt ved hjælp af den samme assay. Lymfoide tumorer er kendt for at være følsomme over for strålebehandling i både human og veterinær onkologi [2]. Denne uoverensstemmelse kan skyldes variationen mellem lymfoide tumorcellelinjer som tidligere rapporteret [25], da kun fire cellelinier blev undersøgt i vores studie.

For at forstå parametre, der kan bidrage til iboende radiosensitivitet vurderede vi relationerne mellem cellulære radiosensitivitet med grundlæggende cellulære karakteristika i de 27 hunde kræft cellelinjer. En bred variation blev også observeret i cellulære karakteristika med hensyn til kromosom nummer, S-fase fraktion, fordoblingstid og udpladningseffektivitet i disse cellelinier (tabel 1). I vores undersøgelse fandt vi ikke en sammenhæng mellem radiosensitivitet og de cellulære karakteristika, herunder kromosom nummer, S-fasen fraktion, og fordoblingstid (figur 2).