PLoS ONE: Overekspression af MEOX2 og TWIST1 er forbundet med H3K27me3 Niveauer og Bestemmer lungekræft kemoresistens og Prognosis

Abstrakt

Lungekræft er den hyppigste dødsårsag fra maligne sygdomme på verdensplan, med ikke-småcellet ( NSCLC) subtype tegner sig for de fleste tilfælde. NSCLC er præget af hyppige genomiske ubalancer og kopi nummer variationer (CNVs), men de epigenetiske afvigelser, der er forbundet med klinisk prognose og terapeutisk svigt forbliver ikke helt identificere. I nærværende undersøgelse, blev i alt 55 lungekræftpatienter inkluderet, og vi gennemførte genomisk og genetisk ekspression analyser, immunhistokemisk protein afsløring, DNA methylering og kromatin immunopræcipitationsanalyser at opnå genetiske og epigenetiske profiler forbundet til prognose og chemoresponse af NSCLC-patienter. Endelig siRNA transfektion-medieret genetiske lyddæmpning og cisplatin cellulær cytotoksicitet analyser i NSCLC cellelinjer A-427 og iner-37 blev vurderet til at beskrive kemoresistens involverede mekanismer. Vores resultater identificeret høje frekvenser af CNVs (66-51% af tilfældene) i de 7p22.3-p21.1 og 7p15.3-p15.2 cytogenetiske regioner. Men overekspression af gener, såsom

MEOX2

,

HDAC9

,

TWIST1

og

AhR

på 7p21.2-p21.1 locus forekom trods manglende CNVs og lidt ændringer i DNA-methylering. I modsætning hertil promoter sekvenser af

MEOX2

TWIST1

vises væsentligt lavere /fald i undertrykkende histon-mærket H3K27me3 og steg i den aktive histon-mærket H3K4me3 niveauer. Endelig disse resultater korrelerer med dårlig overlevelse i NSCLC patienter og cellulære kemoresistens til onkologiske lægemidler i NSCLC-cellelinjer i en

MEOX2

og

TWIST1

overekspression afhængige-måde. Afslutningsvis vi rapporterer for første gang, at

MEOX2

deltager i kemoresistens uanset høj CNV, men det er væsentligt afhængig af H3K27me3 berigelse sandsynligvis forbundet med aggressivitet og kemoterapi fiasko i NSCLC patienter skal dog yderligere kliniske studier være udført for at bekræfte vores resultater som nye sandsynlige kliniske markører i NSCLC patienter

Henvisning:. Ávila-Moreno F, Armas-López L, Álvarez-Moran AM, López-Bujanda Z, Ortiz-Quintero B, Hidalgo-Miranda A, et al. (2014) Overekspression af

MEOX2

TWIST1

er forbundet med H3K27me3 Niveauer og Bestemmer lungekræft kemoresistens og Prognose. PLoS ONE 9 (12): e114104. doi: 10,1371 /journal.pone.0114104

Redaktør: Santosh Patnaik, Roswell Park Cancer Institute, USA

Modtaget: August 12, 2014 Accepteret: 29 oktober 2014; Udgivet: December 2, 2014

Copyright: © 2014 Ávila-Moreno et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information tal og filer. Array oplysninger er indsendt til GEO-databasen (GSE62407)

Finansiering:. FAM forfatter blev støttet af Det Nationale Råd for Videnskab og Teknologi (CONACYT), Midler til forskning i Basic Science, Project 0.053.643; Forskning Retning af Statens Institut for luftvejssygdomme (iner); og nationale selvstyrende universitet Mexico, UNAM, Projekter IACOD-PAPIIT IA201611, PAPIIT IB202512 og PAPIIT RR282512. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er stadig den hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald i både USA [1] og i hele verden, med ikke-småcellet (NSCLC) undertype tegner sig for de fleste tilfælde i rygere og ikke-tobaks- relaterede patienter [2]. Sene diagnoser og ineffektive terapi bidrager til fattige prognoser og til de gennemsnitlige 5-års overlevelsesraten mindre end 15% [1], [3], [4], [5].

NSCLC er præget af genomiske abnormiteter, som omfatter almindelige somatiske DNA kopital variationer (CNVs). Sammenlignende genomisk hybridisering (CGH) ved spektral karyotypebestemmelse [6] eller lav opløsning genomisk DNA microarray-analyser [7], [8], [9] har fremhævet tab /sletninger på 2q36-37, 3p21, 8p22, 9p21-22, 9q22 , 13q22 og 17p12-13, og gevinster /amplifikationer på 1q23, 1q31, 3q25-27, 5p13-14, 6p, 7q og 8q23-24; Men kun få af disse forandringer har vist sig at være involveret i tumor aggressivitet [9] eller den kliniske progression af NSCLC.

For nylig har de internationale konsortier til studiet af lungekræft brugte high-density SNP arrays (250 K) til at beskrive CNVs, såsom 5p15.33, 7p11.2, 14q13.3 og 17q12, samt mikrodeletioner på 5q11.2, 7q11.22 og 9p23 [10]. Nogle af disse CNVs, såsom gevinster på 14q13.3 der indeholder

NKX2-8

[11] og

NKX2-1

gener [10], har vist sig at være funktionelt involveret i vækst , overlevelse og tumorigen aktivitet i NSCLC [10], [11]. Stigninger i CNV ved de 5p13.2 locus er blevet foreslået som en ny molekylær markør for tidlig pre-invasionsevne [12]. Desuden en genetisk signatur af mRNA overekspression fra 7q11.23, 14q23.2 og 17q21.2 (

STX1A

,

HIF1A

CCR7

henholdsvis) har været identificeret som en prædiktiv progression-prognose signatur i de tidlige kliniske stadier af NSCLC-patienter [13].

Dårlige prognoser er blevet forbundet med den 7p locus, som kan skyldes til dels, at øget CNV og overekspressionen af potentielle onkogener ved 7p15.3-11.2, der er beskrevet 56% af NSCLC cellelinier [14]. Desuden har gevinster på 7p12-21 blevet identificeret i næsten 50% af NSCLC patienter med metastatisk sygdom [15], som kan udgøre en af ​​de karyotypic evolution modeller af NSCLC baseret på gevinster på kromosom 7 [16]. Desuden kan epigenetiske afvigelser, såsom DNA hypermethylering på 7p15.2 [17], udgør relevante regulerende mekanismer og /eller markører, ikke kun for lungekræft biologi [16], men også for NSCLC progression, på grund af deres tilstedeværelse i den tidlige [ ,,,0],17] og sene kliniske stadier [10], [11], [15]. Men til dato, de molekylære forbindelser mellem højfrekvente CNVs, epigenetiske afvigelser, patientforeninger prognoser og onkologisk svigt i NSCLC er endnu ikke fuldt undersøgt.

I den foreliggende undersøgelse, vi har forsøgt at korrelere potentielle epigenetiske ændringer med mønstret for DNA kopi antal ændringer i NSCLC gennem brug af høj opløsning fliser SNP arrays (500 K). Vi identificerede amplifikationer ved de 7p22.3-p22.1, 7p21.3-p21.1 og 7p15.3-p15.2 cytogenetiske regioner i intervallet 66-51% af vores sager. Disse amplifikationer resulterede i

MEOX2

,

HDAC9

,

TWIST1

og

AhR

overekspression trods den lille øgede niveauer af DNA methylering. Men den betydeligt lavere berigelse af den undertrykkende histon markør H3K27me3 og signifikant øget aktivering af H3K4me3 på både

MEOX2

TWIST1

promotorområder blev korreleret med dårlige kliniske prognoser. Derfor, som vi viste i NSCLC cellelinje modeller, cisplatin kemoresistens korrelerer med en overekspression af

MEOX2

TWIST1

gener, hovedsagelig på grund af tabet af histon repressive mærker H3K27me3. Vores resultater tyder på, at epigenetiske mekanismer overstige genetiske (CNV) aberrationer ved 7p21 og supplere dem, og derved bidrage til aggressivitet og svigt af onkologisk behandling i NSCLC patienter.

Materialer og metoder

Sample Selection

i alt 55 lungetumorer (LT), 15 tilstødende ikke-involverede lunge matchede væv (LNAT) og 20 lunge prækursorer læsioner (LP) fra Fresh Frozen (FF) og formalin-fikseret og Paraffin Embedded (FFPE) væv forarbejdning metoder, blev indsamlet fra bryst- Kirurgisk service og Patologi service på Statens Institut for luftvejssygdomme (iner). Derudover NSCLC cellelinier SK-MES-1, A-549, A-427, blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) og iner-37, iner-51 blev opnået fra Mexicansk Mestizo patienter, som tidligere rapporteret [18], [19].

Etik Statement

Institutional Review Board (IRB) for Statens Institut for luftvejssygdomme (iner) godkendte protokoller med register B17 -07 og B09-08, og fra Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), FES-Iztacala, biomedicin Forskningsenhed og godkendt protokollerne for disse genetiske og molekylærbiologiske undersøgelser. Informeret samtykke blev opnået fra patienter med diagnosen LT og undergår kirurgiske indgreb. Alle emner underskrevet informeret samtykke brev til disse undersøgelser på thoraxkirurgi tjeneste, iner, og de godkendte opbevaring af deres biologiske prøver ved iner og UNAM depoter til dette og fremtidige studier. I denne undersøgelse har vi ikke indsamlet prøver fra mindreårige /børn, kun unge voksne ældre end 18 år blev inkluderet.

SNP Mapping Array 500 K hybridisering og Bioinformatik Analyser

I alt 30 LNAT, LT, blev LP og NSCLC cellelinie DNA-prøver indeholdt i arrayet hybridisering platform (SNP 500 K) og i nogle tilfælde for SNP 6,0 arrays, ifølge producentens anbefalede instruktioner (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) og analyseres ved hjælp af den tidligere beskrevne metode [20] ved at sammenligne 300 humane raske donorer fra den mexicanske Mestizo befolkning Haplotype Kort database tidligere beskrevet [21]. Affymetrix SNP arrays data (Affymetrix Console Version 4.1.3), blev importeret, normaliseret og stigninger i CNV blev identificeret ved hjælp af Partek Genomics Suite Program Defaults og Partek Genome View Tools (Partek, Saint Louis, MI, USA), når gennemsnittet af 20 SNP overskredet en kopi antal forhold på 2,5 eller mindre end 1,5 (

FDR

≤0.02). Pathway forudsigelse analyser fra generne med kopi nummer ændringer i vores NSCLC prøver (File S1) blev udført ved hjælp af softwaren Ingenuity System Program (Version 7.0). Listen af ​​afvigende gener indgår i vores cellulære vej forudsigelse analyser, blev udvalgt på grundlag af tilgængeligheden af ​​udtryk profiler i humane lungevæv og lungecarcinom væv, ved hjælp af data i EntrezGene browsing (https://www.ncbi.nim.nih.gov /genet) og web browser GeneCards human Gene Database (https://www.genecards.org/). SNP array-data, der indgår i denne undersøgelse blev indsendt og godkendt af Gene Expression Omnibus (GEO) database med GEO officielle nummer:. GSE62407

Immunohistokemiske Analyser i histologiske prøver

Immunohistokemiske analyser blev udført på LNAT, LT og LP vævsprøver fikseret med formaldehyd 10% eller Hope i /II reaktiv Metode (Innovative Diagnostik-System, Tyskland), og derefter under anvendelse af 1-2 mikrogram specifikke antistoffer anti-MEOX2, anti-TWIST1, anti-HDAC9 og anti-EVX1 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, USA), ved inkubering i et fugtigt kammer og desuden af ​​antigen-specifik reaktion med avidin-biotin peroxidase /diamino-benzidin-system (Dako, Carpinteria, CA, USA ). En Ventana System-enhed (Roche, Tucson, Arizona, USA) og en transmitteret lysmikroskopi undersøgelse (Leica, Bannockburn, IL, USA), blev anvendt til at opnå mikrofotografier ved 40X og 80X forstørrelse.

Real-Time PCR for mRNA-ekspression og DNA Kvantificering Assays

i mRNA ekspression analyser, cDNA blev syntetiseret fra 2 ug totalt RNA ved anvendelse af høj kapacitet Kit (Life Technologies Corporation, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). cDNA og genomisk DNA blev også amplificeret under anvendelse af SYBR Green qPCR assays og oligonukleotidsæt designet af Primer Design og /eller Vector NT softwareprogrammer, og syntetiseret af Sigma-Genosys (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), beskrevet for mRNA ekspressionsassays i tabel S1, og til DNA-promotorsekvenser analyse i tabel S2.

Kvantitativ realtids-PCR (qPCR) blev udført på en Step One Plus og 7500-enhed (Life Technologies Corporation, Applied Biosystems, Foster City , CA, USA), og i en LightCycler 480 System (Roche, Mannheim, Tyskland) ved anvendelse Power SYBR Green (Life Technologies Corporation, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) og Maxima SYBR Green qPCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific , Fermentas, Life Science, Foster City, CA,).

betingelser for relativ kvantitativ PCR reaktion under anvendelse Fermentas SYBR Green var som følger, én cyklus af 50 ° C i 2 minutter, en cyklus på 95 ° C i 10 min, 40 cyklusser af 95 ° C i 15 s, 60 ° C i 30 s, og yderligere udvidelse trin ved 60 ° C i 30 s. Mens for Applied Biosystems Power SYBR Green var som følger: en cyklus på 50 ° C i 2 minutter, en cyklus på 95 ° C i 10 minutter, 40 cykler ved 95 ° C i 15 s, 60 ° C i 30 s og 72 ° C i 30 s. Ved slutningen af ​​PCR-reaktionen blev prøver underkastet et smeltepunkt analyse for at bekræfte specificiteten af ​​amplikonet, og β-actin-genet blev anvendt som husholdning for normalisering analyse. Salg

Restriction Enzyme følsomme for methylering Assays

Methylering status af genomisk DNA (200 ng), der blev afledt fra LNAT blev LT og LP væv og lungekræft cellelinier undersøgt under anvendelse 0,5 enheder hver en af ​​en kombination af følsomme for methylering restriktionsenzymer

HpaII

,

HpyCH4IV

og /eller

Acil

(New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) og inkubering ved 37 ° C, i 4 timer. Efterfulgt af methylering følsomme PCR amplifikationsanalyser hjælp oligonukleotidsæt (Tabel S2), der er designet inde i de forudsagte CpG øer i promoter s målgener (

MEOX2

,

HDAC9, TWIST1

, og

AhR

), efter kriterier som ø størrelse 100, og GC Procent . 50,0, bruger MethPrimer at vedlægge så mange restriktionssteder at nå de enzymer, følsomme for methylering status, inde i amplikon og angivet på tabel S3

methylering Sensitive PCR-assays Salg

methylering status (%) blev beregnet baseret på methylering Sensitive PCR-assays, ved hjælp af oligonukleotidsæt indeholdende CpG sites inde på amplikonet ved promotor- s målgener undersøgt (

MEOX2

,

HDAC9, TWIST1

, og

AhR

) beskrevet i tabel S3. Kort fortalt blev 50 ng af fordøjede DNA anvendt som input på 25 pi total PCR-reaktion, og produktstørrelser analyseres, ifølge tabellen S3, følger de næste PCR-betingelser: en cyklus på 95 ° C i 10 min, 40 cyklusser af 95 ° C i 15 s, 55 ° C i 30 s og 72 ° C 45 s.

Endvidere blev human lunge (NSCLC) cellelinier A-427 og iner-37 anvendes til at standardisere enzymatisk restriktionssteder betingelser, udvikle

i Salg methylering assays under anvendelse CpG methyl-transferase (M.SssI) og S-adenosylmethionin (SAM), ved vitro inkubering ved 37 ° C i 4 timer. Standard methylerede DNA og menneskelig sæd DNA ekstraheret fra raske donorer blev anvendt som hyper-methylerede og hypo-methylerede DNA kontroller for enzymatiske begrænsning assays.

In Vitro

DNA-methylering og histon Ændring Inhibition Analyser

A-427 og iner-37 humane NSCLC (adenocarcinom) cellelinier (5 × 10

5 celler) blev behandlet

in vitro

med 5′-aza-deoxycytidin [4 pM ], at inhibere

de novo

DNA-methylering i sekvensposition promotorer, og /eller med TSA [300 nM], at inhibere aktiviteten af ​​histondeacetylaser (HDAC) i løbet 48 timer.

chromatin immunoprecipitation (chip)

Frisk frosset LT (3 mm

3) blev pulveriseret under flydende nitrogen frysning og fikseret med 1% formaldehyd løbet af 10 minutter, og straks neutraliseret med 0,125 M glycin i løbet af 5 min. Resulterende celler blev vasket med 1% PBS, og lyseret med lysepuffer (50 mM HEPES-KOH pH 7,5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 8, Triton X-100 1%, 0,1% natriumdeoxycholat, 0,1% SDS) indeholdende proteaseinhibitoren

Complete Mini

1 tablet i 10 ml (Roche, Indianapolis, IN, USA).

kromatin fra LT prøver blev sonikeret under anvendelse af 10 pulser af 20 sekunder m /u 60 watt. 10 ug kromatin blev immunopræcipiteret (chip) under anvendelse af kommercielt kit EZ-Magna ChIP G (Millipore, Temecula, CA, USA), og anvendelse af 2,5 ug anti-H3K27Ac, ​​anti-H3K4me3, anti-H3K27me3, anti-H3K9me3 og anti -RNA Pol II aktiverede antistoffer (ABCAM, Cambridge Science Park, Cambridge, UK). 1 ug anti-muse-IgG blev anvendt som en negativ kontrol for chip (Millipore, Temecula, CA, USA). Integritet og kvalitet af promotorsekvenser af Immuno-udfældet DNA (IP-DNA) blev vurderet ved PCR-amplifikation produkt af 166 bp for promotorsekvensen for genet GADPH som anbefalet af leverandøren (Millipore, Temecula, CA, USA).

IP-DNA Amplification og chip Kvantitative Analyser Brug qPCR assays

immunudfældet DNA (IP-DNA) 20 ng blev lineært forstærkes ved hjælp af Whole Genome Amplification (WGA1) Kit (Sigma, St. Louis, MO , USA), og efter der blev oprenset ved MiniElute søjler (Qiagen, Hilden Renania-Westfalia, Tyskland).

IP-DNA opnået fra både LT prøver og LT cellelinier blev analyseret ved qPCR absolut kvantificering under anvendelse LightCycler 480 System (Roche, Mannheim, Tyskland), og SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Fermentas Life Science, Foster City, CA, USA) og oligonukleotidsæt for mål og kontroller (tabel S2).

IP-DNA 20 ng blev anvendt pr reaktionen blev ligeledes amplifikation af standardkurver udviklet gennem serielle fortyndinger af native DNA fra mononukleære celler fra perifert blod fra raske donorer (100 ng, 10 ng, 1 ng, 0,1 ng og 0,01 ng), og under anvendelse af oligonukleotidsekvenser mål (tabel S2), og oligonukleotidsekvens kontrol som C-fos-promotoren tages fra chromatin immunoprecipitation kit Forstørrelse System (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA).

cellemedieret cytotoksicitet assays

cellulær levedygtighed blev udført i plader med 96 brønde under anvendelse af 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) -2H-tetrazolium (MTS ) (Promega, Madison, WI, USA) i fravær eller tilstedeværelse af onkologisk lægemiddel cisplatin. For at gøre dette, blev 96-brønds plader podet med 3.000 til 5.000 celler i 200 pi RPMI-1640-medium i 48 timer og efterfølgende inkuberet med 10 pi MTS [5 mg /ml] i 3 timer, til senere aflæsning ved 550 nm og /eller 570 nm, ved anvendelse af formlen: cellelevedygtigheden = (OD af prøven /Kontrol OD) x 100. Ligeledes blev lægemiddelresistens kurver udviklet i en dosis-respons afhængig måde ved hjælp af serielle fortyndinger af kræft narkotika cisplatin.

Genetic Silencing (siRNA transfektionsanalyser)

Vi brugte små interfererende RNA (siRNA) rettet mod

MEOX2

(sc-106.233),

TWIST1

(sc-38.604) og ikke-menneskelige relateret mRNA som negativ kontrol (sc-37007 og sc-44.230) alle opnået fra Santa Cruz Biotechnology (Dallas, Texas, USA). Kort fortalt blev cellekulturer med 3% af antibiotika-fri FCS inkuberet i 96-brønds plader i 12 timer og derefter transficeret med RNAi Reagens, lipofectamin (Life Technologies Corporation, Invitrogen, Foster City, CA, USA) og siRNA’er på 50 nM, i et samlet volumen på 100 pi.

Western Blot

Proteiner blev ekstraheret og oprenset ved fremgangsmåden ifølge TRIZOL (Invitrogen), suspenderet i SDS 5% med proteasehæmmere (komplet mini, Roche, Indianapolis, IN, USA), og kvantificeres ved Lowry-metoden. Totale proteiner (30 ug) blev underkastet lodret elektroforese i acrylamidgeler 12%, og derefter blev overført til nitrocellulosemembraner under anvendelse af Trans-Blot-Turbo udstyr /Transfer System (BioRad, Hercules, CA, USA). Membraner blev inkuberet natten over ved 4 ° C, blokering med fedtfattig mælk 5% i PBS 1X /Tween20 0,1%, og inkuberet 2 timer med antistoffer (MEOX2) 1:1500, (TWIST1) 1:1500, (β-actin) 1 :3000, eller (GAPDH) 1:3000 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, USA). Membraner blev inkuberet i 1 time med et sekundært antistof (anti-muse-HRP /anti kanin HRP) 1:10000, ved stuetemperatur og afslørede med Luminol 1 minut ved stuetemperatur under anvendelse af C-Digit scanner (Li-cor, Lincon, Nebraska, USA ) og Hypercassette og film (Amersham, Chalfont, Buckinghamshire, England).

statistiske Analyser

Fishers eksakte test,

t

-test og Mann Whitney-U statistiske tests var bruges til at analysere forskellene mellem grupper af patienter,

s

værdier ≤0.05 blev betragtet som statistisk signifikant. Vi har også brugt Log-Rank (Mantel Cox) og Gehan-Breslow-Wilcoxon overlevelse curve tests. Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS statistisk software til Mac-OS X (version 11.0) og GraphPad (version 5.0).

Resultater

Kromosomal Microaberrations og øget antal kopier Variationer (CNVs) med høj Frekvenser på 7p22-21 og 7p15 i lungekræftpatienter

for at identificere de hyppigste genetiske microaberrations med sine sandsynlige genetiske udtryk profiler og epigenetiske afvigelser i lungekræftpatienter, LNAT-, LP-, LT og NSCLC cellelinie-afledte DNA-prøver (n = 30) blev udsat for genomiske hybridiseringsassays på SNP 500 K mikroarrays. Den bioinformatik segmentær analyse tillod identifikation af kromosomafvigelser og øget CNVs i LT-afledte prøver, som ikke blev observeret i de LNAT-afledte matchede væv. Typiske kromosomforandringer i lungekræft, herunder 3P sletninger; forstærkning af flere regioner på kromosomerne 5, 12, 14, 16, 18, 19 og 20; og amplifikation /deletion af flere regioner i kromosom 8 blev identificeret (figur 1A).

Focal analyse af hele genomet og kromosom 7. (A) en hel-genom-amplifikation og en bioinformatik segmental analyse af tre lungekræft patienter blev udført under anvendelse matchet, histologisk hosliggende ikke-involveret lungevæv (LNAT) og lungecarcinomer (LT). (B) Hele-genom og fokale analyser af normal lunge, lunge prækursorer læsioner og lungecarcinomer (18-14 af 27 lungelæsioner med høj CNV). (C) En omdrejningspunkt analyse af kromosom 7 afslørede en høj frekvens af CNV på region 7p21 (pil) i precursor lungelæsioner og lungecarcinomer.

En høj frekvens af CNV hjælp omdrejningspunkt genomisk analyser på 7p22. 3-p22.1 blev 7p21.3-p21.1 og 7p15.3-p15.2 (figur 1B) opdaget. Især vi observerede DNA-amplificeringer på 7p21.1 locus i LT og LP-afledte prøver i næsten 55% af tilfældene (15/27 lungelæsioner), herunder 3 af 4 precursor læsioner (Figur 1C og figur S1), som ikke blev observeret i de LNAT-afledte prøver (figur 1C).

Desuden bekræftede vi stigninger i CNV ved 7p locus i både LP- og LT-afledte prøver ved anvendelse af SNP 6.0 platform (figur S2 ). De 39 gener med de højeste satser for forandring i CNV er vist i tabel S4. Disse ændringer blev placeret i de 7p22.3-p22.1 og 7p21.3-p21.1 cytogenetiske regioner, og de omfattede

ZNF12

,

RPA3

,

MEOX2

,

BZW2

,

TSPAN13

,

AGR2

,

AGR3

,

AhR

,

TWIST1

HDAC9

. Ændringer i

TWISTN

,

HNRNPA2

,

CBX3

,

Hoxa

klynge og

EVX1

, som er placeret på 7p15. 3-p15.2, blev også identificeret (tabel S4).

Vi har registreret i alt 1.376 gener med kopi nummer ændringer i vores menneskelige lungekræft prøver (File S1). Af disse gener, blev 809 gener forstærkes med en frekvens på 37-66% ved kromosom 7.

grundlag af denne analyse fandt vi en berigelse af gener involveret i adskillige cellulære signalveje, især cellecykluskontrol, cellulære bevægelse , celle embryonale netværk udvikling død og (data ikke vist), nogle af dem er opført i tabel S4, tyder på, at genetiske og /eller epigenetiske afvigelser spiller en funktionel rolle i lungekræft biologi.

Stigninger i CNV på 7p21 og 7p15 korrelerer med mRNA og protein Overekspression og ikke med DNA-methylering i lungekræft

sammenhængen mellem stigningen i CNV og relative mRNA ekspressionsniveauer, samt virkningen af ​​DNA methylering på mRNA udtryk profiler blev analyseret i lungecarcinomer. Brug QRT-PCR-analyser, fandt vi, at kun

MEOX2

,

HDAC9

TWIST1

(figur 2A), samt

AhR

EVX1

gener (figur S3A-B) var overudtrykt og positivt korreleret med CNV-høj sammenhæng (figur 1B og C, og fig S1), sammenlignet med andre gener på 7p21 (ikke vist). Ekspressionen af ​​disse gener var signifikant højere i de LT-afledte prøver end i de LNAT-afledte prøver (

s

≤0.05). Hertil kommer, at nukleare protein niveauer af

MEOX2

,

HDAC9

TWIST1

blev konsekvent steget i de LT-afledte prøver (Figur 2B) samt

MEOX2

og

TWIST1

protein niveauer /overflod i NSCLC cellelinier (Figur S4A-C), mens ekspressionen af ​​disse proteiner i det tilstødende pulmonal parenkym og LNAT-afledte prøver ikke var steget (figur 2B ), som påvist under anvendelse af immunhistokemi. En stigning i

EVX1

udtryk blev opdaget på membranerne i LP- og LT-afledte prøver og NSCLC cellelinjer (figur S5A-B).

(A)

MEOX2

,

HDAC9

TWIST1

mRNA-ekspression. Fejl søjler repræsenterer 95% af konfidensintervallet for middelværdien. (B) Protein ekspression i tilstødende ikke-involverede lungevæv (LNAT), lunge forstadielæsioner (LP) og lungecarcinomer (LT) (mikrofotografier ved 200X og 400X), samt formalinfikseret og paraffinindlejret (FFPE) og friske frosne (FF) væv, blev sammenlignet. (C) promotorsekvens methyleringsanalyse. Forskellene var statistisk signifikante i forhold til LNAT og blev påvist under anvendelse af Fishers eksakte test, en uparret

t

-test og en Mann-Whitney U test, *

s

≤0.05; **

s

≤0.005; ***

s

≤0.001. Fejl barer indikerer min til max rang med 95% konfidensinterval, og box plots repræsenterer standardafvigelser af middelværdien.

For yderligere at undersøge virkningen på genekspression af gener, der er forbundet til CNV, inddragelse af epigenetisk ændringer, navnlig DNA-methylering blev vurderet. Følsomme for methylering enzymatiske begrænsning analyser afslørede små forskelle i den procentvise DNA methylering mellem LNAT- og LT-afledte prøver i promotorsekvenserne af

MEOX2

,

HDAC9

TWIST1

(figur 2C), hvilket antyder en manglende korrelation mellem mRNA-ekspression og DNA-methylering (figur 2A og 2C). Desuden har vi identificeret en reduktion i DNA methylering for

MEOX2

,

HDAC9

TWIST1

(

s

≤0.005 og

p

≤0.001 henholdsvis), i LP-afledte prøver, som ikke blev observeret i de LNAT- og LT-afledte prøver (Figur 2C).

som et supplement, en parret analyse mellem LNAT- og LT -afledte prøver i nogle CNV-fri patienter afslørede også en mRNA overekspression af

MEOX2

,

HDAC9

, og

TWIST1

, hvilket tyder på en mangel på genetisk (CNV) og epigenetiske (DNA-methylering) korrelation (Figur S6A-C), og en mangel på genetisk-epigenetisk korrelation i CNV-høj patienter (figur S7A-C); med undtagelse for

AhR

gen mellem LNAT- og LT-prøver (figur S3A, S3C), og mellem CNV-frie og CNV-høje patienter (S6D og S7D). Sammenfattende vores data tyder på, at DNA-methylering er ikke den vigtigste ansvarlig for de observerede ekspressionsmønstre ved 7p21 cytogenetiske region i lungecarcinomer, såsom NSCLC.

Fald i histon kodeks for H3K27me3 og Stigninger i H3K4me3 er Forbundet med

MEOX2

TWIST1

Overekspression og korreleret med dårlig Klinisk Prognose i NSCLC

Derfor spurgte vi, om andre epigenetiske modifikationer kunne deltage i reguleringen af ​​de berørte gener, fokus på 7p21 cytogenetiske region i NSCLC.

på denne, som en helt uafhængig validering undersøgelse, rolle histon ændringer i overekspression af

MEOX2

TWIST1

i NSCLC-patienter blev evalueret. Til denne analyse en yderligere gruppe af patienter, som havde gennemgået en klinisk opfølgning blev undersøgt for at bestemme, om

MEOX2

TWIST1

overekspression i tumor væv var forbundet med niveauerne af H3K27me3

vs.

H3K27Ac og H3K4me3 og kunne bestemme prognose og /eller lydhørhed over for onkologisk behandling i NSCLC patienter.

En parret analyse mellem LNAT- og LT-afledte prøver i samarbejde med

MEOX2

og

TWIST1

overekspression (figur 3A-B), viste en reduktion i H3K27me3 (figur 3C-D). De patienter med lavere berigelse niveauer af det undertrykkende histon H3K27me3 og høj

MEOX2

TWIST1

mRNA-ekspression (figur 3A-D), der vises dårlige overlevelsesrater, med et gennemsnit på 6,2 måneder (DSE, RSCL, MGGR, GOMJ og GCH patienter), mens patienter med højere H3K27me3 berigelse niveauer og lav

MEOX2

og

TWIST1

mRNA-ekspression (figur 3A-D), der vises bedre overlevelsesrater, med et gennemsnit på 53,4 måneder (GMRM, AEE, SPN, GHM og PMA patienter, med

s

≤0.0027) (figur 3E, tabel 1).

(A)

MEOX2

udtryk i NSCLC og LNAT-afledte prøver, og (B)

TWIST1

udtryk i NSCLC og LNAT-afledte prøver. Fejl- søjler repræsenterer standardafvigelser af middelværdien af ​​tre gentagelser. (C) histon modifikation berigelse profil af

MEOX2

promoter sekvens. (D) histon modifikation berigelse profil af

TWIST1

promoter sekvens. Box plots repræsenterer middelværdien af ​​tre gentagelser. Analysen afslørede en sammenhæng mellem lav mRNA-ekspression og H3K27me3 berigelse. (E) Overlevelse kurve analyser baseret på Log-Rank (Mantel Cox) og Gehan-Breslow-Wilcoxon test af den relative ekspression indeks

MEOX2

plus

TWIST1

(

p

≤0.0027).

også signifikant forhøjede niveauer (

s

≤0.008) af det undertrykkende histon markør H3K27me3 på både

MEOX2

TWIST1

promoter sekvenser blev bekræftet for de patienter med højere overlevelsesrater (Figur 4A-B). Der blev imidlertid ikke signifikante ændringer i H3K27Ac niveauer observeret (figur 4C-D). I modsætning hertil blev der påvist reducerede niveauer af aktiverings- markør H3K4me3 på både

MEOX2

(

s

≤0.028) og

TWIST1

(

s

≤ 0,0006) promoter sekvenser i høj overlevelsesprocent gruppen af ​​patienter (Figur 4E-F) og blev korreleret med delvis respons på adjuverende cisplatin eller carboplatin, som den første linje kemoterapi i NSCLC-patienter (tabel 1).

(A ) H3K27me3 berigelse i

MEOX2

promoter sekvens (** Mann-Whitney U test,

s

≤0.01, og F-test,

s

≤0.0003) og (B ) H3K27me3 berigelse i

TWIST1

promoter sekvens i høje overlevelse patienter sammenlignet med patienter med dårlige prognoser (*** Mann-Whitney U test,

s

≤0.01 og uparret t-test ,

s

≤0.02). (C) H3K27ac berigelse i promoter sekvens af

MEOX2

(ingen væsentlige ændringer) og (D) H3K27ac berigelse i promoter sekvens af

TWIST1

i høje overlevelse patienter sammenlignet med patienter med dårlige prognoser (ingen signifikante ændringer). (E) H3K4me3 berigelse i

MEOX2

promoter sekvens (* F-test,

s

≤0.02) og (F)

TWIST1

promoter sekvens i høj overlevelse patienter sammenlignet