PLoS ONE: Overekspression af Forkhead Box Protein M1 (FOXM1) i kræft i æggestokkene korrelerer med dårlig Patient Overlevelse og Bidrager til Paclitaxel Resistance

Abstrakt

Formål

Deregulering af FOXM1 er blevet dokumenteret i forskellige kræftformer. Formålet med denne undersøgelse var at vurdere betydningen af ​​FOXM1 i ovariecancer tumorigenese og paclitaxel modstand.

Eksperimentel udformning

Ekspression af FOXM1 blev undersøgt i 119 kliniske prøver ved immunhistokemi og korreleret med klinisk-patologiske parametre . Effekter af FOXM1 knockdown på kræft i æggestokkene celle migration, invasion og mitotisk katastrofe blev også undersøgt. qPCR og chip-qPCR blev brugt til at etablere KIF2C som en ny FOXM1 målgen impliceret i kemoresistens.

Resultater

Høj nukleare FOXM1 udtryk i kræft i æggestokkene patientprøver var signifikant associeret med fremskredne stadier (

P

= 0,035), kortere samlet (

P

= 0,019) og sygdomsfri (

P

= 0,014) overlevelse. Multivariat analyse bekræftede FOXM1 udtryk som en selvstændig prognostisk faktor for kræft i æggestokkene. FOXM1 knockdown betydeligt hæmmet migration og invasion af æggestokkene cancerceller og forbedret paclitaxel-medieret celledød og mitotisk katastrofe i en p53-uafhængig måde. Bioinformatik analyse foreslog en række potentielle transskription mål for FOXM1. En af de potentielle mål, KIF2C, udviste lignende ekspressionsmønster til FOXM1 i chemosensitive og kemoterapi celler som respons på paclitaxel behandling. FOXM1 kunne påvises ved promotor af KIF2C og FOXM1 silencing betydeligt nedreguleret KIF2C.

Konklusion

Vores resultater tyder på, at FOXM1 er forbundet med dårlig patient resultat og bidrager til paclitaxel modstand ved at blokere mitotiske katastrofe. KIF2C er identificeret som en ny FOXM1 transkriptionel mål, der kan være involveret i erhvervelsen af ​​kemoresistens. FOXM1 bør undersøges nærmere som en potentiel prognostisk markør og terapeutisk mål for kræft i æggestokkene

Henvisning:. Zhao F, Siu MKY, Jiang L, Tam KF, Ngan HYS, Le XF, et al. (2014) Overekspression af Forkhead Box Protein M1 (FOXM1) i kræft i æggestokkene korrelerer med dårlig Patient Overlevelse og Bidrager til Paclitaxel Resistance. PLoS ONE 9 (11): e113478. doi: 10,1371 /journal.pone.0113478

Redaktør: Vladimir V. Kalinichenko, Cincinnati Children ‘s Hospital Medical Center, USA

Modtaget: 24. februar, 2014 Accepteret den 28. oktober 2014 Udgivet: 20. november 2014

Copyright: © 2014 Zhao et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Fung Zhao er en modtager af en HKU-ICL fælles studentship. Ana Gomes er et ph.d.-stipendiat støttet af Cancer Research UK. Laura Bella understøttes af en studentship fra Breast Cancer Campaign. Pasarat Khongkow er støttet af legater fra den thailandske Goverment. Eric Lam arbejde er støttet af tilskud fra Breast Cancer Campaign og Cancer Research UK. Annie Cheung arbejde er støttet af midler fra Research Grants Råd Hongkong. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i æggestokkene er den mest dødelige gynækologiske cancer verden over som de fleste patienter, når diagnosticeret, er præsenteret med fremskreden sygdom [1]. Selv om der er observeret forbedring i median overlevelse i de seneste årtier, tilbagefald og dødelighed forbliver høje skyldes til dels købet af kemoresistens [2]. En kombination af paclitaxel og carboplatin er almindeligt anvendt som første-line kemoterapi for patienter med ovariecancer. Paclitaxel virker specifikt under G2-M-fasen af ​​cellens cyklus ved at inducere abnorme spindler og afbrydelse af mikrotubulusdynamik, hvilket blokerer cellecyklusprogression. På trods af sin oprindelige effektivitet som en cancer terapeutisk middel, i de fleste tilfælde, patienter i sidste ende blive ufølsomme for paclitaxel kemoterapi og tilbagefald. Det er derfor afgørende at identificere nye prognostiske markører og terapeutiske mål, især gener relateret til metastase og resistens.

Forkhead boks (FOX) proteiner tilhører en superfamilie af evolutionært bevarede transkriptionsfaktorer ansvarlige for den spatio-temporale bøde -tuning af et bredt repertoire af transkriptionelle programmer, der er nødvendig for den normale homøostase og udvikling [3]. Blandt hvilke, forkhead kasse protein M1 (FOXM1) deltager i en lang række biologiske processer, herunder celleproliferation, cellecyklusprogression, celledifferentiering, DNA beskadigelse reparation, vævshomeostase, angiogenese og apoptose [4], [5]. Det er derfor ikke overraskende, at deregulering af FOXM1 kan resultere i alvorlige patologiske tilstande, herunder kræft. Faktisk har FOXM1 overekspression blevet dokumenteret i kræft i lunge, bryst, lever, prostata og tyktarm, osv antyder, at FOXM1 har en nøglerolle i tumorigenese [3], [6]. For nylig er det blevet vist, at dereguleret FOXM1 ekspression kan bibringe resistens over for kemoterapeutiske lægemidler, såsom cisplatin og epirubicin, ved at beskytte celler mod DNA-beskadigelse induceret celledød, og forstyrrer mitotiske kontrolpunkt [7] -. [9]

i denne undersøgelse undersøgte vi ekspressionsmønsteret for FOXM1 i ovariecancer. Virkningerne af FOXM1 ekspression på kræft cellemigration, invasion og paclitaxel modstand blev også undersøgt i et forsøg på at evaluere FOXM1 som en potentiel molekylær prognostisk markør og terapeutisk mål for ovariecancer. Yderligere analyser blev udført for at identificere KIF2C som en ny FOXM1 transkriptionel mål, der kan være involveret i købet af kemoresistens.

Materialer og metoder

Kliniske prøver og cellelinier

Archival paraffin indlejrede væv blokke fra år 1987 til 2004 blev hentet fra Patologisk Institut, Queen Mary Hospital, University of Hong Kong. Prøverne omfattede 2 godartede cystadenomas, 2 borderline tumorer, 94 primære carcinomer og 21 metastatiske foci af kræft (ved ligament, tarm, lymfeknude og uterin serosa). Alle patienter med carcinoma blev opereret efterfulgt af standard first-line kemoterapi, herunder platin /paclitaxel. Opfølgningen periode varierede fra 5 til 209 måneder (median 63 måneder). Anvendelsen af ​​disse prøver blev godkendt af Institutional Ethical Review Board. Hver patientprøve blev vurderet af patologer og sikret at indeholde mere end 70% tumorceller.

Ovariecancer cellelinier SKOV-3 og OVCAR-3 blev indkøbt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). SKOV3-TR celler en generøs gave fra Dr. Lawrence XF Le (Division of Cancer Medicine, University of Texas M.D. Anderson Cancer Center, Houston, Texas, USA) [10]. PEO1 og PEO1-TaxR er for nylig udviklet cellelinjer og er blevet godkendt ved Cancer Research UK facilitet. Anvendelsen af ​​PEO1 og PEO1-TaxR stedet for SKOV-3 og SKOV3-TR for nogle eksperimenter giver ekstra midler til at sikre, at resistente mekanismer identificeret i SKOV-3 og SKOV3-TR er fælles for alle paclitaxel resistente ovariecancerceller og ikke enestående for SKOV-3 og SKOV3-TR. Vigtigt er det, både PEO1 og PEO1-TaxR holdes på lavere passager at undgå driver i modstand og erhvervelse af sekundære mutationer [10] [11]. OVCAR-3 blev dyrket i 01:01 Medium 199 (Invitrogen, CA, USA): MCDB105 (Sigma, MO, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 100 enheder /ml penicillin-streptomycin (Invitrogen). SKOV3, SKOV3-TR, PEO1 og PEO1-TaxR blev dyrket i RPMI1640 (Sigma) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 100 enheder /ml penicillin-streptomycin (Invitrogen). PEO1-TaxR blev suppleret med 50 nM paclitaxel. Alle cellelinjer blev holdt ved 37 ° C i befugtet inkubator med 5% CO

2. Celledyrkningsmedium blev skiftet hver 3 til 5 dage afhængig af celledensitet. Til rutinemæssig passage, når cellerne nåede 85% til 90% konfluens, blev de delt i et forhold på 1:04.

Immunhistokemi

Immunhistokemi blev udført som tidligere beskrevet [12], [13 ]. Kort fortalt blev formalinfikserede paraffinsnit inkuberet med anti-FOXM1 antistof (NBP1-30961, 1:40 Novus Biologicals, CO, USA) ved stuetemperatur natten over og farvet under anvendelse EnVision + Dual Link System (K4061, Dako, CA, USA) . Antigen genfinding blev udført under anvendelse EDTA-buffer, pH 8,0, i en trykkoger i 30 min. Alle sektioner blev vurderet af to uafhængige undersøgere. Immunoreaktiviteten af ​​FOXM1 antistof, intensiteten af ​​farvede celler og deres procenter blev målt i intensitet og procentvise scoringer hhv. Den procentvise score varierede fra 0 til 4: 0 = 5% af positivt farvede celler, 1 = 5-25% af positivt farvede celler, 2 = 26-60% af positivt farvede celler, 3 = 61-85% af positivt farvede celler, og 4 = 86-100% af positivt farvede celler. Immunhistokemisk (IHC) score (mellem 0 og 16) blev beregnet ved at gange intensiteten score (0-4) og den procentvise score (0-4), med en maksimal score på 16 [12], [13]. FOXM1 nukleare og cytoplasmiske immunoreaktiviteter blev bedømt særskilt.

Western blot-

Celler blev høstet med lysepuffer [0,125 M Tris, pH 6,8 ved 22 ° C indeholdende 1% NP-40 (volumen /volumen ), 2 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), 2 mM N-ethylmaleimid, 2 mM phenylmethanesulphonyl (PMSF), 1 mM natriumorthovanadat og 0,1 um natrium okadate] og centrifugeret ved 4 ° C i 10 minutter. Proteinkoncentrationen blev bestemt ved detergentforligeligt (DC) proteinassay (Bio-Rad). Tyve mikrogram protein blev separeret ved natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE), overført til polyvinylidendifluoridmembran og hybridiseret med de følgende anti-organer: anti-FOXM1 (sc-502, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) , anti-Caspase 9 (9502, Cell Signaling Technology, MA, USA), anti-KIF2C (WH0011004M1, Sigma), anti-Caspase 7 (9492, Cell Signaling) og anti-β-tubulin (sc-9104, Santa Cruz Biotechnology ).

Kvantitativ real-time PCR

Kvantitativ real-time PCR (qPCR) blev udført ved hjælp af Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) og analyseret af ABI7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems ). L19 (RPL19), en ureguleret ribosomal housekeeping-genet blev anvendt som en intern kontrol til normalisering ved hjælp af delta-delta Ct-metoden. Følgende primere blev anvendt:

KIF2C Forward 5 ’til 3′: CATGATTGCCACGATCTCAC

KIF2C Reverse 5 ’til 3′: CGTTAGAGCAGGCTTCCATC

L19 Forward 5 ’til 3′: GCGGAAGGGTACAGCCAAT

L19 Reverse 5 ’til 3′: GCAGCCGGCGCAAA

Forbigående knockdown af FOXM1

ON-TARGET Plus Menneskelig FOXM1 siRNA og ikke-targeting Kontrol siRNAs (Thermo Scientific, CO , USA) blev anvendt til forbigående lyddæmpning af FOXM1 hjælp Oligofectamine transfektion reagens (Invitrogen) i henhold til fabrikantens anvisninger.

In vitro

migration og invasion analyser

In vitro

migration og invasion assays blev udført som tidligere beskrevet [12], [13]. Kort fortalt blev 1,25 × 10

5-celler udpladet på det øvre rum af en Transwell kammer (Corning Life Sciences, MA, USA). For migration assays blev celler lov til at migrere gennem en gelatine-belagt membran. For invasion assays blev celler lov til at invadere gennem en Matrigelcoatede membran. Efter 24 timer blev celler på den øvre side af membranen fjernet, og migrerede eller invaderede celler blev fikseret, farvet og talt.

TdT-medieret dUTP nick-endemærkning (TUNEL) assay og evaluering af mitotisk katastrofe indeks

efter FOXM1 knockdown i 48 timer og paclitaxel behandling (50 nM) i 24 timer blev TUNEL-assay udført under anvendelse af in situ Død Detection Kit (Roche Biochemical, IN, USA) ved at følge fabrikantens protokol [14]. Apoptotisk og mitotiske katastrofe tal blev vurderet under fluorescens mikroskopi. Mitotiske katastrofe tal blev observeret af morfologiske ændringer i kerner (DAPI farvning) [10]. Mere end 1000 levedygtige celler i hvert forsøg blev undersøgt, og det mitotiske katastrofe-indekset blev evalueret som procentdele af cellerne tælles. Hver assay blev kørt i tre eksemplarer.

Cell cyklus analyse

Cell cyklus analyse blev udført ved propidiumiodidfarvning som tidligere [15] beskrevet. Kort fortalt blev både vedhæftende og suspensionsceller høstet og farvet med propidiumiodid (1 mg /ml) i nærvær af DNase-fri RNase til flowcytometrisk analyse. Celle cyklus profil blev analyseret ved hjælp af cellen Diva software (Becton Dickinson UK Ltd.).

chromatin immunoprecipitation

40 pi Dynabeads Protein A (10002D, Invitrogen) blev vasket med 200 pi TSE jeg buffer i tre gange og fortyndet med 40 pi TSE i puffer. Anti-FOXM1 (sc502, Santa Cruz Biotechnology) (4 ug) og kanin IgG-kontrol (X0903, DAKO) (4 ug) blev først separat fortyndet i Buffer D, blandet med fortyndet Dynabeads og derefter roteret O /N ved 4 ° C. PEO1 og PEO1-TaxR celler ved 90% konfluens i 100 mm dyrkningsskål blev tværbundet med 1% formaldehyd i 10 minutter, skyllet med iskold PBS og inkuberet med 2,5 M glycin i 5 minutter. Celler blev derefter høstet med 2 ml ophugning puffer. Efter en sekventiel vask med PBS puffer I og Buffer II, blev cellepellet resuspenderet i 300 pi lysepuffer og underkastet lydbehandling under optimerede betingelser (20 min med 30 s på og 30 s slukket). Supernatanten blev derefter fortyndet i 300 pi buffer D, hvorfra 100 pi blev taget som INPUT kontrol. 200 pi cellelysat blev blandet med tilberedte Dynabeads og roteres O /N ved 4 ° C. Efter en sekventiel vask med TSE I, TSE II, buffer III og TE-buffer, blev 100 pi elueringspuffer tilsat til Dynabeads, og blandingen blev roteret ved stuetemperatur i 1 time. Eluerede prøve blev opsamlet i Eppendorf-og Dynabeads blev re-elueret med yderligere 100 pi elueringspuffer. 200 pi prøve blev de-tværbundet ved inkubering ved 65 ° C O /N. PCR Purification Kit (Qiagen) blev derefter anvendt til at oprense DNA. Kvantitativ realtids-PCR blev udført med følgende primere: KIF2C (Forward 5 ’til 3′: GCCAAGTCTCCAACTTGCTC; Reverse 5 ’til 3′: TTCCCAACCATCTTCCTACG)

chip-qPCR data blev normaliseret til IgG-kontrol og plottet. som procent input. Sammensætning af buffere blev opført i tabel 1.

Statistisk analyse

Statistisk analyse blev udført af det statistiske Package for Social Science-version 19,0 til Windows (IBM). Sammenligning mellem to grupper af ikke-parametriske data blev udført ved Mann-Whitney

U

-testen. Sandsynlighed for overlevelse blev analyseret under anvendelse af Kaplan-Meier tilgang. Multivariat analyse af prognostiske faktorer blev udført ved hjælp af Cox ‘regressionsmodel.

P

-værdier af 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

FOXM1 overekspression korrelerer med dårlig overlevelse

udtryk for nukleare FOXM1. i godartede ovarietumorer og borderline tumorer og invasive cancere blev vurderet ved immunohistokemi. Æggestokkene kræftformer viste stærkere nukleare FOXM1 farvning end godartede og borderline tumorer. Der var imidlertid ingen signifikant forskel i FOXM1 ekspression mellem primære carcinomer og deres metastatiske foci (

P

= 0,6). Højere nukleare FOXM1 udtryk var signifikant associeret med fremskredne stadier af kræft i æggestokkene (

P

= 0,035) (fig. 1A). Selv ikke når statistisk signifikans, FOXM1 overekspression viste en tendens relateret til serøs histologisk type (

P

= 0,142), høj kvalitet kræftformer (dårlig differentiering) (

P

= 0,235) og kemoresistens (

P

= 0.282) (tabel 2). For at studere foreningen af ​​FOXM1 udtryk med patienternes resultat blev patienterne inddeles i to grupper ved hjælp af cutoff punkt i IHC score 0. Som det fremgår af Kaplan-Meier samlet overlevelse plot (fig. 1B), patienter med negativ FOXM1 farvning havde en signifikant længere total (

P

= 0,019) og sygdomsfri overlevelse (

P

= 0,014) end dem med positive FOXM1 udtryk. Multivariat progression analyse viste høj ekspression af FOXM1, avancerede kræft stadier og dårlig histologisk differentiering (høj kvalitet) viste sig at være uafhængige prognostiske faktorer for kort samlet overlevelse (95% CI, 0,906-5,754, HR 2,283,

P

= 0,08; 95% CI, 0,953-5,963, HR 2,384,

P

= 0,06; 95% CI, 2,137 til 40,638, HR 9,318,

P

= 0,003, henholdsvis) og sygdomsfri overlevelse (95% CI, 1,025-6,631, HR 2,607,

P

= 0,04; 95% CI, 1,039-6,555, HR 2,61,

P

= 0,04; 95% CI, 1,821 -35,091, HR 7,993,

P

= 0,006, henholdsvis). Interessant nok blev cytoplasmatisk farvning af FOXM1 også påvist i tillæg til nuklear udtryk, men blev ikke observeret nogen signifikant sammenhæng med klinisk-patologiske parametre (data ikke vist).

A, Repræsentative billeder af immunoreaktivitet af nuklear FOXM1 i (I) godartet cystadenoma, (II) borderline tumor, (III) trin I invasiv cancer, (IV) trin II invasiv cancer, (V) stadium III invasiv cancer og (VI) stadie IV invasiv cancer. Forstørrelser X400. Mellemværker: Regioner med højere forstørrelse af nuklear FOXM1 farvning. B, Kumulative overordnede og sygdomsfri overlevelse plots ved hjælp af Kaplan-Meier tilgang.

Forbigående knockdown af FOXM1 hæmmer SKOV-3 celle migration og invasion

Vi næste undersøgte rolle FOXM1 i ovariecancer progression.

In Vitro

Transwell analyser blev anvendt til at undersøge virkningerne af forbigående lyddæmpning af FOXM1 om ovariecancer celle motilitet og invasion. Signifikant nedsat migration og invasion (

P

0,05) blev observeret i Skov-3-celler transficeret med ON-TARGET Plus Menneskelig FOXM1 siRNA (siFOXM1) sammenlignet med celler transficeret med kontrol siRNA (siControl), hvilket indikerer, at knockdown af FOXM1 var i stand til at hæmme migration og invasion af SKOV3 celler (fig. 2).

A. Repræsentative billeder, der viser celler migrerede (gelatineovertrukket membran) eller invaderet (matrigel-overtrukne membran) efter 24 timer. B. repræsentant Western blot-analyse at dokumentere effektiviteten af ​​FOXM1 forbigående knockdown i SKOV-3. C. Grafisk repræsentation af migration (venstre panel) og invasion (højre panel) resultater som gange ændring af migrerede og invaderede celler i forhold til kontrollen i henholdsvis fem felter i tre brønde fra tre uafhængige forsøg; * P 0,05, signifikant; Mann-Whitney

U

-test.

Paclitaxel behandling nedregulerer ekspressionen af ​​FOXM1 i SKOV-3, men ikke i paclitaxel-resistente SKOV3-TR

I visning af IHC-farvning viser, at forhøjede FOXM1 ekspression er associeret med dårlig prognose og dermed kemoresistens, et par etableret ovariecancer cellelinie følsomme og resistente over for paclitaxel, nemlig SKOV-3 og SKOV3-TR henholdsvis blev anvendt til at undersøge virkningen af paclitaxel behandling på ekspressionen af ​​FOXM1. Celler blev behandlet med paclitaxel (100 nM) og høstet på forskellige tidspunkter 0, 8, 16, 24, 48 og 72 timer. Interessant nok viste immunoblotting FOXM1 udtryk til at være faldet på 48 timer og 72 timer i SKOV-3. Imidlertid FOXM1 ekspression forblev relativt konstant ved høje niveauer i SKOV3-TR upon paclitaxel behandling (fig. 3), hvilket antyder en rolle FOXM1 i mediering paclitaxel resistens i ovariecancerceller. Især synes der også at være en marginal stigning i ekspressionen af ​​spaltede Caspase-9 og caspase-7 i både SKOV-3 og SKOV3-TR upon paclitaxel behandling, hvilket antyder, at apoptose kan ikke være det fremherskende middel til at inducere celledød i disse ovariekarcinomceller.

paclitaxel sensitiv SKOV-3 og resistente SKOV3-TR ovariecancerceller blev behandlet med 100 nM paclitaxel og høstet på tidspunkter indiceret til Western blot-analyse. Paclitaxel behandling nedreguleret FOXM1 udtryk på tidspunkt peger 48 timer og 72 timer i SKOV-3, men ikke i SKOV3-TR, som vist ved immunblotting. Der var også nogen markante ændringer i den spaltede Caspase-9 og caspase-7-ekspression.

Forbigående lyddæmpning af FOXM1 markant forbedrer paclitaxel-medieret mitotisk katastrofe

Vi har tidligere vist, at paclitaxel dræber ovariecancerceller overvejende ved at inducere mitotisk katastrofe snarere end apoptose i cellerne [10]. For at belyse den potentielle rolle for FOXM1 i ovariecancer kemoresistens blev SKOV-3 og OVCAR3 ovariecancer cellelinier behandlet med paclitaxel i 24 timer efter FOXM1 tømt af siRNA, farvet med DAPI og undersøgt ved fluorescensmikroskopi. Resultatet viste, at der var et forøget antal af multi-kerneholdige celler (pil) i ovariecancerceller med FOXM1 knockdown (

P

= 0,03 og 0,01, henholdsvis) (Fig. 4), hvilket tyder FOXM1 udtømning signifikant forøget paclitaxel medieret mitotisk katastrofe i både SKOV-3 og OVCAR3. Det er bemærkelsesværdigt, at apoptose var knap påviselig i disse paclitaxel-behandlede celler. Dette var sandsynligvis på grund af det faktum, at både SKOV-3 og OVCAR3 harbor dysfunktionel p53, og funktionelt p53 kræves til paclitaxel-induceret apoptose i ovariecancerceller.

SKOV-3 og OVCAR3 celler transficeret med enten siRNA pools mod FOXM1 eller kontrol siRNA puljer blev behandlet med paclitaxel (100 nM) og farvet med DAPI. A. Repræsentative farvningsresultater blev vist viser, at forbigående FOXM1 knockdown signifikant forøget paclitaxel-induceret mitotisk katastrofe (pil) i SKOV-3 og OVCAR3 celler henholdsvis (øvre panel). B. Grafer repræsenterer resultaterne af tre uafhængige forsøg, der viser procentdelen af ​​celler, der undergår mitotisk katastrofe, * P 0,05, signifikant; Mann-Whitney

U

-test.

FOXM1 knockdown inducerer beskedne stigninger i akkumuleringen af ​​G2 /M og døde celler efter paclitaxel behandling i resistente SKOV3-TR-cellelinje

Cellecyklusanalyse blev derefter udført for at belyse den rolle, FOXM1 i paclitaxel-medieret celledød. Til dette formål blev SKOV-3 og SKOV3-TR-celler transient transficeret med kontrol og FOXM1 siRNA i 48 timer og dyrket i nærvær eller fravær af paclitaxel behandling (100 nM) i 48 timer. De resulterende celler blev høstet, farvet med propidiumiodid og underkastet flowcytometrianalyse. Resultaterne viste, at paclitaxel inducerede signifikante niveauer af celledød (sub-G1 population) i Skov-3-celler transficeret med enten FOXM1 eller kontrol siRNA pool (Fig. 5A, øvre panel). Øget antal celler akkumuleret med sub-G1 DNA indhold i SKOV3-TR med FOXM1 knockdown (8,1%) (fig. 5A, øvre panel) sammenlignet med SKOV3-TR transficeret med kontrol siRNA (4,2%) (fig. 5A, øvre panel ), hvilket tyder FOXM1 bidrager til paclitaxel resistens i ovariecancerceller og at FOXM1 lyddæmpning kan forbedre paclitaxel-medieret celledød. Ved paclitaxel behandling, en beskeden stigning i celler blokeres ved G2 /M-fasen blev også observeret i SKOV3-TR behandlet med siRNA mod FOXM1 sammenlignet med kontrol, hvilket tyder FOXM1 inaktivering kan forbedre paclitaxel-medieret celledød via mitotisk katastrofe (fig. 5A, nederste panel,. figur 5B). Udtømning af FOXM1 i de følsomme SKOV-3-celler har nogen additiv virkning som paclitaxel behandling. Dette skyldes sandsynligvis det faktum, at paclitaxel fungerer via nedregulering FOXM1 ekspression som afsløret af Western blot-analyse (se fig. 3).

A. Flowcytometrisk analyse blev udført efter propidiumiodidfarvning på SKOV-3 og SKOV-3-TR celler behandlet med paclitaxel (100 nM) eller forblev ubehandlet efter transfektion med siRNA pools mod FOXM1 eller styre siRNA puljer. Repræsentative data er vist indikerer, at FOXM1 nedregulering kan øge antallet af døde celler og celler blokeret ved G2 /M cellecyklus fase i SKOV-3-TR sammenlignet med celler behandlet med kontrol siRNA. B. Bar diagrammer af forskellige faser af cellecyklus i SKOV-3 og SKOV3-TR behandlet med paclitaxel efter transfektion med kontrol eller siRNA mod FOXM1. Resultater repræsenterer data fra to uafhængige forsøg.

KIF2C er identificeret som en ny FOXM1 transkriptionel mål, der kan være involveret i erhvervelsen af ​​kemoresistens

Bioinformatik analyse viste KIF2C, et medlem af KIF superfamilien af ​​proteiner, som et potentielt målgen af ​​FOXM1 med konsensus forkhead bindingssteder placeret opstrøms for transkriptionsstartstedet (fig. 6D). Anvendelse af et par af paclitaxel-sensitive (PEO1) og resistent (PEO1-TaxR) æggestokkræft cellelinje, paclitaxel behandling nedregulerede ekspressionen af ​​KIF2C ved 48 timer og 72 timer i PEO1. Men KIF2C udtryk været forholdsvis konstant i PEO1-TaxR på paclitaxel behandling (fig. 6A), hvilket tyder på en rolle KIF2C i mediering paclitaxel modstand i æggestokkene cancerceller. Interessant nok udtrykkene for FOXM1 ændret i et lignende mønster (fig. 6A). Kvantitativ real-time PCR (qPCR) blev derefter anvendt til at undersøge virkningen af ​​forbigående dæmpning af FOXM1 på udskriften niveau af KIF2C. FOXM1 knockdown resulterede i signifikant nedreguleret mRNA udtryk for KIF2C i begge cellelinier (P 0,05) (Fig 6B.). Kromatin immunofældning-qPCR (chip-qPCR) viste yderligere FOXM1 var i stand til at binde til promotorregionen af ​​KIF2C (P 0,05). (. Figur 6C), hvilket indebærer KIF2C kan tjene som en ny FOXM1 transkriptionel mål

A, paclitaxel behandling (50 nM) nedreguleret FOXM1 og KIF2C udtryk ved 48 h og 72 h i PEO1 men ikke i PEO1-TaxR. B, FOXM1 knockdown væsentligt reduceret udskrift niveau KIF2C i PEO1 og PEO1-TaxR. Data repræsenterer triplikater fra tre eksperimenter. * P = 0,04, *** P = 0,0003. siControl: Ikke-specifik kontrol. siFOXM1: FOXM1 knockdown. C, chip-qPCR viste FOXM1 betydeligt trække ned KIF2C promoter region i PEO1 og PEO1-TaxR sammenlignet med negative IgG kontrol. Data repræsenterer triplikater fra tre eksperimenter. * P = 0,04, *** P = 0,0001. D, Skematisk diagram, der viser placeringer af forkhead responselement (FHRE) og bindingsstedet af primere, der anvendes i chip-qPCR opstrøms for transkriptionsstartstedet af KIF2C.

Discussion

denne undersøgelse, viser vi, at høj nukleart FOXM1 udtryk signifikant korreleret med scenen, kortere samlet overlevelse og sygdomsfri overlevelse for patienter med ovariecancer. Multivariat analyse viser, at FOXM1 udtryk kunne fungere som en uafhængig prognostisk faktor. Endvidere forbigående FOXM1 udtømning kan inhibere ovariecancer cellemigration. Disse resultater tyder på, at FOXM1 kan have en afgørende rolle i æggestokkene carcinogenese og progression, og kan forudsige patienternes resultat.

Selvom FOXM1 associering med højkvalitets ovariecarcinomer er blevet rapporteret [16], uanset om FOXM1 deltager i erhvervelsen af paclitaxel modstand forbliver udefineret. Faktisk har dereguleret FOXM1 ekspression vist sig at give resistens over for kemoterapeutiske lægemidler, såsom cisplatin og epirubicin [8], [9]. I betragtning af den immunhistokemiske konstatering tyder associering mellem FOXM1 og kemoresistens, et par af etablerede paclitaxel-følsomme og -resistente cellelinier, SKOV-3 og SKOV3-TR [10], blev anvendt til at undersøge virkningen af ​​paclitaxel på FOXM1. Interessant paclitaxel behandling resulterede i nedregulering af FOXM1 i SKOV-3, men ikke i den resistente cellelinje SKOV3-TR, hvilket indebærer en rolle FOXM1 i mediering paclitaxel resistens i ovariecancerceller. Immunofluorescens undersøgelse viste yderligere forbigående FOXM1 knockdown kunne forbedre paclitaxel-medieret celledød i to ovarian cancer cellelinjer, SKOV-3 (udgår p53) [17] og OVCAR3 (mutant p53) [18]. Det er ikke overraskende, at apoptotiske celler var knap påviselige som begge cellelinier harbor dysfunktionel p53. For nylig blev det foreslået, at induktionen af ​​p53-uafhængig apoptose foregår gennem aktivering af caspase-9 [19]. viste imidlertid, immunoblotting Caspase-9 blev ikke aktiveres ved paclitaxel behandling i SKOV-3 og SKOV-3-TR celler, hvilket indikerer, at både paclitaxel og FOXM1 lyddæmpende effekt celledød primært ved at forbedre mitotisk katastrofe snarere end apoptose i æggestokkene cancerceller, der almindeligvis har dysfunktionel p53 pathway. Dette er i overensstemmelse med tidligere resultater om paclitaxel i brystkræft [20].

Mitotisk katastrofe kan betragtes som en type celle død under mitose eller som følge af mitotisk fiasko [21]. To mekanismer er blevet foreslået som afgørende for mitotisk katastrofe, nemlig G2 /M og mitosespindelen checkpoints [22]. For G2 /M checkpoint, inaktivering af gener såsom

p53

,

p21

Cip1

og

14-3-3Sigma

er blevet rapporteret at inducere DNA beskadigelse-induceret mitotisk katastrofe [23], [24]. Flowcytometrisk analyse udført i vores undersøgelse foreslået FOXM1 knockdown i kemoterapi kræft i æggestokkene cellelinje SKOV3-TR kunne inducere celledød. Paclitaxel behandling og immunfluorescent analyse foreslås endvidere FOXM1 lyddæmpning kunne forbedre paclitaxel-medieret mitotisk katastrofe i en p53-uafhængig og caspase-9-uafhængig måde. Afgrænsning af den underliggende mekanisme, hvormed FOXM1 formidler paclitaxel modstand vil belyse nye tilgange til behandling.

kinesin superfamilieproteiner (KIFS) spiller afgørende roller i intracellulær transport af organeller og vedligeholdelse af spindel samling under mitose og meiose [ ,,,0],25]. At være grundlæggelsen og bedst karakteriseres medlem af kinesin-13 familien, KIF2C /MCAK er afgørende for at sikre den trofaste segregering af kromosomer i mitose og for sikring kromosomal stabilitet [26]. Ikke overraskende up-forskrifter KIF2C er blevet dokumenteret i flere humane cancere og KIF2C er blevet foreslået at spille en vigtig rolle i carcinogenese [27], [28]. I den aktuelle undersøgelse, viste immunoblotting analyse KIF2C ekspression i PEO1 ændres i et lignende mønster som FOXM1 ekspression ved at vise en nedregulering ved 48 timer og 72 timer efter paclitaxel behandling. I modsætning hertil KIF2C udtryk været forholdsvis konstant i PEO1-TaxR, implicerer KIF2C kan være involveret i udviklingen af ​​paclitaxel resistens i kræft i æggestokkene. Denne konstatering er i overensstemmelse med en nylig rapport påviser tabet af KIF2C kunne forøge følsomheden af ​​kinesisk hamster ovarie (CHO) celler til paclitaxel [29]. Desuden KIF2C blev identificeret som en ny FOXM1 transkriptionel mål, der kan spille en central rolle i at mediere paclitaxel modstand i æggestokkene cancerceller.

Som konklusion blev fundet overekspression af FOXM1 at være korreleret med dårlige patienternes overlevelse og til paclitaxel-medieret mitotisk katastrofe i æggestokkene cancerceller.