PLoS ONE: Karakterisering microRNA Expression Profiler og opdagelsen af ​​Nye MikroRNA’er involveret i kræft i løbet af humane embryonale Development

Abstrakt

MikroRNA’er (miRNA), ca. 22-nukleotid ikke-kodende RNA-molekyler, regulere en række pivotale fysiologiske eller patologiske processer, herunder fosterudvikling og tumorigenese. For at opnå fuldstændige udtryk profiler af miRNA i menneskelige embryoner, kendetegnet vi miRNA udtryk i uge 4-6 af humane embryonale udvikling ved hjælp af miRNA microarrays og identificeret 50 menneske-embryo-specifikke miRNA (HES-miRNA). Desuden valgte vi tre ikke-konserverede eller primat-specifikke miRNA, HSA-miR-638, -720 og -1280, og undersøgte deres ekspressionsniveauer i forskellige normale og tumorvæv. Resultaterne viser, at ekspression af de fleste miRNA er ekstremt lav under tidlig human embryonisk udvikling. Derudover er ekspressionen af ​​nogle ikke-konserverede eller primat-specifikke miRNA er signifikant forskellig mellem tumor og de tilsvarende vævsprøver normale, hvilket antyder, at miRNA er tæt forbundet med de patologiske processer i forskellige tumorer. Denne undersøgelse præsenterer den første omfattende overblik over miRNA udtryk under humane embryonale udvikling og giver øjeblikkelig dokumentation for sammenhængen mellem menneskets tidlige fosterudvikling og tumorigenese

Henvisning:. Lin Y, Zeng Y, Zhang F, Xue L, Huang Z, Li W, et al. (2013) Karakterisering microRNA Expression Profiler og opdagelsen af ​​Nye MikroRNA’er involveret i kræft i løbet af humane embryonale udvikling. PLoS ONE 8 (8): e69230. doi: 10,1371 /journal.pone.0069230

Redaktør: Wei Yan, University of Nevada School of Medicine, USA

Modtaget: 15. marts 2013; Accepteret: 6 Juni 2013; Udgivet: 2 August, 2013

Copyright: © 2013 Lin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National High Technology Research and Development Program Kina (863 Program) Grant 2006AA02A306, National Natural Science Foundation of China Grant 30871245 og 31271511. De finansieringskilderne havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

MikroRNA’er (miRNA) er ~ 22-nukleotid (nt) ikke- kodende RNA-molekyler, der regulerer genekspression på niveauet af messenger RNA-nedbrydning eller oversættelse, udøver væsentlige funktioner i forskellige biologiske processer lige fra cellecyklusregulering, differentiering og metabolisme, på normalt væv og embryo udvikling, og selv tumorigenese [1-4] . Ændringer i miRNA udtryk er involveret i initiering, progression, og metastase af humane tumorer [5]. Gradvist stigende tyder en direkte sammenhæng mellem miRNA og mange sygdomme, især kræft.

Ved hjælp af forskellige eksperimentelle metoder, tidligere undersøgelser i dyr embryogenese fundet, at visse miRNA kontinuerligt blev rapporteret, og de fleste spiller afgørende roller i differentiering eller vedligeholdelse af væv identitet [6-10]. Menneskelig udvikling i de første 8 uger af embryogenese er potentielt en af ​​de mest spændende områder af biologisk forskning. Specifikt nogle vigtige væv og organer, herunder neurogenese og udvikling af leveren, begyndte at danne i ugerne 4-6 (Carnegie Stages 10-17) af humant embryogenese [11]. For nylig har vores forskning gruppe og andre karakteriserede transkriptionelle profiler af genom-dækkende mRNA-ekspression under human embryogenese hjælp microarray [12,13]. Men menneskelige miRNA udtryk i denne periode stadig, at blive belyst.

Mange undersøgelser har vist, at miRNA er impliceret i forskellige aspekter af tumorigenese og dyrs embryogenese (Anmeldt i 4,5,14-21). I 1892, de franske biologer Lobstein og Recamier spekuleret begrebet embryonale oprindelse af tumorer for første gang. I 1970’erne foreslog Dr. Pierce teorien ‘kræft, en udviklingsmæssige biologi «og påpegede, at tumorigenese var tæt involveret med udviklingsmæssige biologi i vid udstrækning [22-27]. I øjeblikket er dog relevant dokumentation for sammenhængen mellem tidlige menneskelige embryo udvikling og tumorigenese er stadig begrænset [28-32]. For at udfylde denne vigtige hul i viden, derfor er det nødvendigt flere undersøgelser.

I denne undersøgelse de miRNA udtryk profiler under humane embryonale udvikling blev identificeret og karakteriseret ved hjælp af miRNA microarrays. Resultaterne viser, at næsten alle miRNA med kendt funktion, der er stærkt udtrykt eller udviser ekspressionsvektorer ændringer under human embryonisk udvikling har været impliceret i flere maligne sygdomme. Endvidere vævsekspression undersøgelser af adskillige miRNA med ukendt funktion, der er stærkt udtrykt eller undergår ekspression ændrer sig under humane embryo udvikling indikerer, at ekspressionen af ​​disse miRNA var signifikant forskellig mellem kræft prøver og tilsvarende normale væv, hvilket antyder, at disse miRNA også kan spille vigtige roller i tumorigenese. Disse resultater giver dokumentation for det nære forhold mellem menneske embryogenese og carcinogenese og yderligere viser, at miRNA relateret til fosterudviklingen med ukendte funktioner kan være involveret i udviklingen og progressionen af ​​cancer.

Materialer og Metoder

embryonindsamlingsteam og cellelinje

Menneskelig embryonindsamlingsteam blev udført som tidligere beskrevet [13]. Passende skriftlig tilladelse er indhentet fra patienter og godkendelse opnået fra Medical Ethics Committee of Zhongnan Hospital på Wuhan University ved at følge nationale retningslinjer.

Microarray og Bioinformatik Analyser

microRNA microarray-analysen blev udført ved hjælp af en tjenesteudbyder (LC Sciences). Assayet begyndte med 2 til 5 ug totalt RNA-prøve, som var størrelsesfraktioneret under anvendelse af en YM-100 Microcon centrifugal filter (Millipore). De isolerede små RNA’er ( 300 nt) var 3′-forlænget med en poly (A) hale ved anvendelse af poly (A) polymerase. Et oligonukleotid tag blev ligeret til poly (A) hale til senere fluorescerende farvestof farvning; to forskellige mærker blev anvendt til de to RNA-prøver i dual-sample eksperimenter. Hybridisering blev udført natten over på en

μ

Paraflo ™ mikrofluid chip bruger en mikrocirkulationen pumpe (ataktisk Technologies) [33,34]. På mikrofluid chip, hver påvisningsprobe bestod af en kemisk modificeret nukleotid-kodende segment komplementært til target microRNA (fra miRBase, https://www.mirbase.org/) eller andet RNA (kontrol eller kunde defineret sekvenser) samt en spacer segment af polyethylenglycol til at udvide det kodende segment væk fra substratet. Detektions- prober blev genereret fra

in situ

syntese under anvendelse PGR (fotofrembragte reagens) kemi. Hybridiseringsbetingelserne smeltetemperaturer blev afbalanceret kemiske modifikationer af detektionsprober. Hybridisering anvendt 100 pi 6xSSPE puffer (0,90 M NaCl, 60 mM Na

2HPO

4, 6 mM EDTA, pH 6,8) indeholdende 25% formamid ved 34 ° C. Efter hybridisering, detektion anvendes fluorescens mærkning med mærke-specifikt Cy3 og Cy5 farvestoffer. Hybridisering billeder blev indsamlet ved hjælp af en laserscanner (GenePix 4000B, Molekylær Device) og digitaliseret ved hjælp Array-Pro billede analyse software (Media Cybernetics). Data blev analyseret ved først at subtrahere baggrunden og normalisere signaler under anvendelse af et LOWESS filter (lokalt vægtet regression) [35]. For tofarvede eksperimenter, forholdet mellem de to sæt af detekterede signaler (log

2 transformeres, afbalanceret) og p-værdier for t-tests blev beregnet; differentielt detekterede signaler var dem med p-værdier under 0,01. Det normaliserede signal intensitet fra 8 prøver (Uge 4 af humane embryonale udvikling: ZN18, ZN46 /47, ZN75; Uge 5: ZN38, ZN43, ZN63-1; Uge 6: ZN61, ZN70) blev brugt clustering analyse ved hjælp af en en- variansanalyse (ANOVA) af en tjenesteudbyder (LC Sciences). Normaliserede data for alle arrays er deponeret i Gene Expression Omnibus (GEO) ved National Center for Biotechnology Information (NCBI), tilgængeligt via GEO Series tiltrædelse nummer GSE46795 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo /query/acc.cgi?acc=GSE46795).

High-density flere orgel tumor og normale væv microarrays (katalog MC5003), der indeholder 18 tumortyper (20 tilfælde pr type) og normale tilsvarende kontroller (5 tilfælde per type), blev købt fra US Biomax. De miRNA og scrambled oligonukleotider til

in situ

hybridisering blev købt som digoxigenin-mærket låst nukleinsyre (LNA) prober fra Exiqon (Danmark). Sekvensen af ​​LNA detektionsprober var: LNA-638: 5′-DIG-AGGCCGCCACCCGCCCGCGATCCT-3 ‘; LNA-720: 5’-DIG-TGGAGGCCCCAGCGAGA-3 ‘; og LNA-1280: 5’-DIG-GGGTGGCAGCGGTGGGA-3 ‘. LNA-U6: 5’-DIG-CACGAATTTGCGTGTCATCCTT-3 ‘og LNA-scramble: 5′-DIG-GTGTAACACGTCTATACGCCCA-3’ blev anvendt som positive og negative kontroller prober hhv.

in situ

hybridisering af væv array til miRNA experssion blev udført ved hjælp af en tjenesteudbyder (Shaanxi Chaoying Biotechnology CO, LTD, Shaanxi Kina), og slides blev læst af to uafhængige forskere. Intensiteten af ​​farvningen blev scoret som negativ (- /0)., Svag (+ /1), moderat (++ /2), eller stærk (+++ /3) som tidligere beskrevet [36,37]

miRNA realtid polymerasekædereaktion (PCR)

miRNA RT-PCR-assay blev udført under anvendelse af en tjenesteudbyder (LC Sciences). Kort fortalt blev miRNA kvantificering undersøgt ved hjælp af TaqMan

® miRNA tests og TaqMan® Universal PCR Master Mix og analyseret af ABI PRISM 7000 Sequence Detection System. RNU24 blev anvendt som en intern kontrol til at bestemme relative miRNA udtryk. Hver prøve blev udført tre gange.

Statistiske analyser

envejs variansanalyse (ANOVA) blev udført under anvendelse af de normaliserede data for uge 4-6 for at identificere miRNA hvis ekspression ændres. At sammenligne miRNA udtryk i humane normale og cancer væv, to-tailed Students

t

tests blev udført ved hjælp af ovenstående snesevis af prøver.

Resultater og diskussion

Karakterisering af miRNA udtryk profiler under humane embryonale udvikling

for at identificere de miRNA udtryk profiler af menneskelige embryoner, blev miRNA microarrays analyser udført i humane embryo prøver (uger 4, 5 og 6 efter befrugtningen) ved hjælp af μParaflo® teknologi, og microarrays blev analyseret rådata. Rækken dækker alle miRNA udskrifter til rådighed i Sanger miRBase databasen (frigive 10.1). For detaljer, se eksperimentelle procedurer og supplerende data (tabel S1 tilgængelig online). Følgelig miRNA udviser signalstyrker over 32 blev betragtet som detekteret ekspression. Efter normalisering blev en stærk tærskel på miRNA detektionssignal defineret som 500 (figur 1). Vi har udpeget disse 50 miRNA (~ 6%), hvori ekspressionen signalet blev større end 500 af ethvert trin i uge 4, 5 eller 6 under human embryonisk udvikling, som humane embryo-specifikke miRNA (HES-miRNA) (tabel 1 ).

miRNA ekspressionsniveauerne under humane embryonale udvikling (uge 4, 5, og 6 efter befrugtningen) med signalstyrken større 32 blev betragtet som påvist udtryk. En stærk tærskel på miRNA detektionssignal blev defineret som 500 efter normalisering. MiRNA med et fluorescenssignal større end 500 på noget tidspunkt på ugen 4, 5 eller 6 blev defineret som HES-miRNA.

MiRNA

Uge 4

Uge 5

Uge 6

hsa-miR-1031020.97589.63775.30hsa-miR-106a3717.471283.56988.08hsa-miR-106b705.36336.58217.08hsa-miR-107837.20446.95520.07hsa-miR-10b1679.971511.97688.29hsa-miR-1224805.009396.8510671.26hsa-miR-1246356.13816.55100.26hsa-miR-125a-5p387.96827.091146.67hsa-miR-125b558.09937.533407.28hsa-miR-126513.43257.52195.18hsa-miR-126867.10212.18725.03hsa-miR-1275238.04928.53413.71hsa-miR-1280189.87292.811238.08hsa-miR-130a522.76130.33161.38hsa-miR-130b827.85593.00936.95hsa-miR-151-5p713.59579.19423.27hsa-miR-15b1041.17788.21368.30hsa-miR-161080.15395.87286.75hsa-miR-174108.911437.681210.55hsa-miR-181a312.21269.73741.07hsa-miR-181b192.98187.58873.77hsa-miR-182341.78579.71453.59hsa-miR-191482.51483.55631.69hsa-miR-199a-3p1284.651201.391165.51hsa-miR-19b758.72559.73223.40hsa-miR-206791.121067.481658.21hsa-miR-20a3614.131105.53804.23hsa-miR-20b1471.15540.45323.50hsa-miR-2142654.733566.049605.29hsa-miR-23b745.25594.28767.96hsa-miR-251871.251553.321021.11hsa-miR-26a4645.233390.432536.21hsa-miR-320a1849.633185.424495.39hsa-miR-320b1358.111904.943209.74hsa-miR-320c1666.092358.804068.96hsa-miR-320d790.281072.821897.73hsa-miR-361-5p751.92719.17643.41hsa-miR-423-5p553.06888.43400.99hsa-miR-432499.71807.49534.52hsa-miR-4511355.12622.2018.66hsa-miR-483-5p480.512580.411537.07hsa-miR-574-5p163.53375.89709.17hsa-miR-6384622.856092.422891.58hsa-miR-663290.15525.9244.41hsa-miR-720101.92181.661255.10hsa-miR-92a11338.0811838.016909.45hsa-miR-92b4171.404315.192556.64hsa-miR-93872.20552.87445.45hsa-miR-936323.52512.7235.61hsa-miR-99b510.57635.731232.78Table 1. Liste over menneske-embryo-specifik-miRNA.

Efter normalisering blev en stærk tærskel på miRNA detektionssignal defineret som 500 (figur 1), og 50 miRNA (~ 6%, 50/835), hvori ekspressionen signalet var større end 500 af ethvert trin i uge 4 , 5 eller 6 under human fosterudvikling, blev udpeget som menneske-embryo-specifikke miRNA (HES-miRNA). CSV Hent CSV

Udtrykket profiler viser, at ekspressionen af ​​de fleste miRNA er lav i den tidlige menneskelige embryonale udvikling, hvor ca. 80% af miRNA (666 af 835 miRNA) udviser signalstyrken blev betragtet som uopdaget udtryk (figur 1 og tabel S1). Disse data svarer til resultaterne, at de fleste miRNA ikke blev opdaget i begyndelsen af ​​zebrafisk udvikling [10]. Hierarkiske cluster assays af HES-miRNA ekspression (figur 2A) og 169 miRNA udviser signalstyrken løbet 32 ​​(fig S1) under human embryonisk udvikling er vist. I figur 2A blev identificeret følgende tre klynger af HES-miRNA udtryk: Cluster a, opreguleres ved uge 6; Cluster B, nedreguleret ved uge 6; og Cluster c, opreguleres i uge 4. I figur S1 blev fire klynger af 169 miRNA identificeret: klynger 1, 2, 3 og 4. Cluster en miRNA i figur 2A steget i løbet af de tre humane embryonale stadier (uge 6 uge 5 uge 4), og omfattede nogle miRNA arter rapporteret til at blive beriget med forskellige udviklingsmæssige og sygdomsprocesser (f.eks HSA-miR-122, -206, -214, -181 familie, og -125 familie) [38]. Cluster c miRNA, der faldt i de tre humane embryonale stadier (uge 4 uge 5 uge 6) medtaget nogle miRNA, der også beriget med forskellige udviklingsmæssige og sygdomsprocesser (f.eks HSA-miR-451, -106, -16 og -17) (figur 2A) [38]. Men udtryk for mange klynge b medlemmer, der steg fra uge 4 til uge 5, men faldt fra uge 5 til uge 6, har ukendte funktioner i udviklings- og sygdomsprocesser.

(A) Fifty HES-miRNA var opdelt i 3 grupper: klynger a, b, og c. Pilen viser miRNA, der blev udvalgt til yderligere validere microarray data ved hjælp microRNA QRT-PCR (figur 3). Stjernen viser den ikke-konserveret eller primat-specifik HES-miRNA (figur S4). Den hule trekant angiver miRNA harborring samme frø region sekvens blandt klynge c. (B) Figur 2B viser den modne sekvens af seks miRNA (miR-17, -106a, -106b, -20a, -20b, -93) med den samme frø region tagget med lys rød skygge. (C) Pie diagram viser funktionelle mønster analyse (Gene ontologi) af de bevarede mål (1245 udskrifter), forudsagt af Targetscan (https://www.targetscan.org/vert_60/), af de seks miRNA.

Blandt HES-miRNA (tabel 1 og figur 2A), nogle er blevet eksperimentelt bekræftet at spille afgørende roller i differentiering og sygdom. Eksempelvis pattedyr lever-specifikke miRNA, MIR-122, som havde det højeste ekspressionsniveau i uge 6 af human embryonal udvikling, ofte undertrykt i primære hepatocellulære carcinomer [39,40], og er også afgørende for hepatitis C-virus-RNA akkumulering i dyrkede leverceller [10,41-47]. HSA-miR-214 er relateret til muskel udvikling og knogledannelse, og er involveret i gastrisk og ovariecancer [48-53]. HSA-miR-92a /b, som medlemmer af miR-17 ~ 92 familie, er involveret i mange solide tumorer og leukæmi [54-57]. HSA-miR-106a er involveret i reguleringen af ​​induceret pluripotente stamceller generation, posttranskriptionel regulering af interleukin-10 udtryk, mavekræft, og astrocytom [58-61]. Derfor er vores resultater støtter stærkt den opfattelse, at der er slående lighed mellem tidlig fosterudvikling og tumorigenese [22].

Desuden er disse højt udtrykte miRNA, samt dem, der har lav udtryk kan spille forskellige regulatoriske roller i forskellige stadier af humane embryonale udvikling. Alternativt disse miRNA med høje ekspressionsniveauer har stærke vævsspecificitet, såsom HSA-miR-122.

Blandt klynge c, er det forbløffende, at vi bemærket 6 miRNA (HSA-miR-17, -106a, -106b , -20a, -20b og -93), der indeholder den samme frø region sequcence AAAGUG (figur 2B), blev nedreguleret i uge 6 i menneskets fosterudvikling, og kunne spille de tilsvarende biologiske funktioner i menneskelig embryogenese. De Hannon og Hammond laboratorier forudsat direkte eksperimentelle resultater, at disse microRNA, der kodes af miR-17-92 klynge og dets paraloger (den miR-106a-363 ​​klynge og miR-106b-25 klynger), har onkogen aktivitet i fast tumor [62 ]. Ventura og kolleger dokumenterede stærke beviser, at sletning af miR-17-92 klynge resulterede i alvorligt hypoplastiske lunger og reduktion i præ-B-celler numre i mus, endelig fører til mindre embryoner endda øjeblikkelig postnatal død [63]. I betragtning af den afgørende rolle, som disse miRNA i udvikling og tumorigenese, vi forudsagde alle mål af disse 6 miRNA ved Targetscan, og derefter blev yderligere analyseret de konserverede mål (1245 udskrifter). I den tidlige fase af human embryonal udvikling, en vigtig begivenhed i forbindelse med den udviklingsmæssige overgangen fra den tidlige celleproliferation fase til organogenese og histogenese er, at antallet af stamceller eller udifferentierede celler reduceres, fordi flere celler begynder at differentiere til forskellige organ- /vævs- specifikke celletyper. I den tidlige fase af menneskets fosterudvikling, en vigtig begivenhed i forbindelse med den udviklingsmæssige overgang fra den tidlige celledeling fase til organogenese og histogenese præsenteres. Funktionel mønster analyse (Gene ontologi) fra den konserverede mål (1245 udskrifter) af 6 miRNA, viser, at langt de fleste af disse gener i GO kategorier relateret til biologisk regulering, regulering af biologisk proces, metabilic proces, cellulær proces, flercellede organismal proces og udviklingsproces (figur 2C). For nylig rapporterede nogle mål for miR-17 ~ 92 familie, såsom CDKN1A (p21) [64], BIM [65], RUNX1 [66], både af dem er inkluderet i disse GO kategorier, som tyder på, at disse gener er uerstattelige position ved styring af cellecyklus, celle apopotosis, og differentiering af hæmatopoietiske progenitorceller. Og disse resultater kan hjælpe os til bedre at forstå betydningen af ​​HES-miRNA i human embryogenese og tumorigenese.

Desuden at validere kvaliteten af ​​miRNA microarray data, fire miRNA (HSA-miR-125b, -720 , -1280, og -20b, figur 3 og figur S2), hvis udtryk niveauer ændret sig væsentligt i løbet af udviklingen valideret ved anvendelse TaqMan® realtid RT-PCR miRNA analyser. Tendenserne i miRNA udtryk var i overensstemmelse med den observeret i miRNA microarray data (figur 3B, C, D og E).

Fire miRNA [HSA-miR-125b (B), HSA-miR-720 (C), HSA-mIR-1280 (D), og HSA-mIR-20b (E)], der differentielt blev udtrykt (p 0,05, figur 3A) og (p 0,10, figur S2) i ugerne 4, 5 og 6 i humane embryonale udvikling, blev valgt. QRT-PCR blev udført og U6 snRNA blev anvendt som en intern kontrol for at bestemme den relative miRNA udtryk.

Menneske-Mouse Sammenlignende analyser af miRNA Expression under fosterudviklingen

For at sammenligne miRNA udtryk profiler mellem mennesker og mus embryonale udvikling, vi foretaget en sammenlignende analyse i forhold til tidligere offentliggjorte microRNA udtryk profiler i musefostre dækker prænatal udvikling (E9.5, E10.5 og E11.5) [8], der svarer til uge 4, 5 og 6 i humane embryonale udvikling [67,68]. I betragtning af de identiske miRNA i mennesker og mus, vi konstrueret et skæringspunkt analyse mellem 835 menneskelige miRNA i denne undersøgelse og 390 mus miRNA, og identificeret 195 homologe miRNA (tabel S2). De hierarkiske clustering assays af human-muse homologi miRNA er vist i figur S3A og B. Venn-diagram (figur S3C og S3D) viste, at 38 eller 32 menneske-muse homologi miRNA blev opreguleret eller nedreguleret henholdsvis under human og muse embryonale udvikling. Blandt disse miRNA, lad-7 familiemedlemmer, miR-34a, miR-221/222 miR-145, miR-125b, miR-15a, og miR-223 har vist sig at spille mangeartede roller under udvikling og patogenese i forskellige pattedyr organer [38]. Disse resultater tyder endvidere, at nogle homologe menneske-muse miRNA er vigtige for udviklingen og patogenesen, mens dem, der ikke homologe sandsynligt er involveret i forskellige udviklingsprocesser, der afspejler den udviklingsmæssige forskel mellem menneske og mus.

Konservative egenskaber HES-miRNA

en tidligere undersøgelse viste, at mange kendte miRNA gener har en typisk bevaring mønster, vedholdende hele klynger, hvilket tyder evolutionære og funktionelle konsekvenser [69]. Dog er en væsentlig del af microRNA bekræftet som ikke-konserverede eller primat-specifikke miRNA, fordi mange nye humane miRNA er løbende blevet identificeret [70]. At definere bevarelsen af ​​HES-miRNA, vi brugte miRviewer [71], som viser bevarelse af miRNA gener grupperet efter navn. Som vist i figur S4, er de fleste HES-miRNA højt konserveret, og deres funktioner er velkendte. Bemærkelsesværdigt, blandt HES-miRNA, otte miRNA, HSA-miR-638, -663, -720, -936, -1246, -1268, -1275, og -1280, er ekstremt ikke-konserveret, selvom de fleste er primate- specifikke (fig S4) [70,72]. Mærkbart, peak udtryk værdier af 5 af disse miRNA, miR-638, -663, -936, -1246, og -1275, er på 5 ugers humane embryonale udvikling. Med andre ord kan disse miRNA kun fungere ved et specifikt human embryonisk udviklingsstadiet. Desuden ved vi meget lidt om de biologiske funktioner af disse miRNA i pattedyr organogenese og patogenese. Men fordi ekspressionen af ​​disse ikke-konserverede eller primat-specifikke miRNA er høj under human embryonisk udvikling, disse miRNA sandsynligvis spiller afgørende roller i pattedyr organogenese og /eller patogenese. Faktisk et par undersøgelser viser, at disse ikke-konserveret eller primat-specifik HES-miRNA kan være forbundet med alle former for sygdom [73-82]. Funktionen af ​​disse ikke-bevaret eller primat-specifik HES-miRNA er endnu ikke fastslået.

Komparative analyser af ekspressionen af ​​HSA-miR-638, -720, og -1280 i normale og maligne væv

Mange undersøgelser har vist, at miRNA er involveret i forskellige aspekter af animalske udviklingsprocesser og sygdom [4,16-21,38,83-89]. For yderligere at validere forholdet mellem HES-miRNA og forskellige faste maligne tumorer, fokuserer vi på tre ikke-konserveret eller primat-specifik HES-miRNA, HSA-miR-638, -720, og -1280 (tabel 1), af højt udtrykt eller udstille udtryk ændringer i uge 4-6 af humane embryonale udvikling for yderligere funktionel undersøgelse. Vi undersøgte, om ekspression af tre HES-miRNA varierer betydeligt mellem forskellige humane tumorer og den tilsvarende normale væv.

Brug af væv microarray MC5003 og meget specifikke og følsomme LNA-modificeret oligonucleotidprober, udtrykket profiler af 3 miRNA i normale og ondartede væv blev påvist ved hjælp af

in situ

hybridisering. U6 snoRNA og scramble-mir prober blev anvendt som positive og negative kontroller prober hhv. De statistiske resultater viser, at ekspressionen af ​​HSA-MIR-638 signifikant opreguleret i hepatocellulære liver cancer væv (n = 20) versus normale levervæv (n = 5) (p = 0,0092), og i cervix uteri pladecellecarcinom væv ( n = 18) versus normale cervix uteri væv (n = 7) (p = 0,0003). Derimod blev ekspressionen af ​​HSA-MIR-638 signifikant nedreguleret i maven adenocarcinom væv (n = 19) versus normale mave væv (n = 6) (p = 0,0095) (figur 4A). Disse data stemmer med resultaterne fra Tsukamoto et al. viser nedregulering af denne miRNA i gastrisk cancer [90]. HSA-MIR-720-ekspression er signifikant opreguleret i cervix uteri pladecellecarcinom væv (n = 18) versus normale cervix uteri væv (n = 6) (p = 0,0086), i lunge pladecellecarcinom /adenocarcinom væv (n = 17) versus normale lungevæv (n = 6) (p = 0,0386), i ovarieceller cystadenocarcinoma /adenocarcinom væv (n = 18) versus normalt ovarie væv (n = 6) (p = 0,04045), og i urothelial carcinoma væv (n = 17 ) versus normale vesica urinaria væv (n = 5) (p = 0,03504) (figur 4B). Desuden er HSA-MIR-720-ekspression betydeligt nedreguleret i tarmslimhinden maligne væv (n = 19) versus normal hud væv (n = 9) (p = 0,0017) (figur 4B). Ekspressionen af ​​HSA-MIR-1280 signifikant nedreguleret i pladecellecarcinom væv af hoved og hals hud (n = 20) versus normal hud væv (n = 9) (p 0,0001), i tarmslimhinden maligne væv (n = 20 ) versus normal hud væv (n = 9) (p = 0,0009), og i pancreas adenocarcinom væv (n = 17) versus normale pancreas væv (n = 6) (p = 0,0270) (figur 4C). I modsætning hertil er HSA-MIR-1280 ekspression signifikant opreguleret i livmoderhalsen pladecellecarcinom væv (n = 17) versus normale cervix uteri væv (n = 7) (p = 0,01076) (figur 4C). Repræsentative eksempler på tre miRNA som blev differentielt udtrykt i tumorvæv versus normale væv er vist i figurerne 5, S5, S6, S7 og. Resultaterne tyder på, at disse HES-miRNA er tæt knyttet til de patologiske processer i forskellige tumorer.

High-density flere organer tumor og normale væv mikroarrays indeholdende 500 væv-prikker med 18 tumortyper og normale tilsvarende kontrol væv . Digoxigenin-mærkede Locked Nucleic Acid (LNA) prober (LNA-638, LNA-720, og LNA-1280) blev anvendt til specifikt at detektere miRNA ekspression på vævet chip. (A) afvigende ekspression af HSA-MIR-638 på væv microarray. kan observeres betydelige opregulering af miR-638 i hepatocellulær leverkræft og livmoderhalsen pladecellekræft. MIR-638 nedregulering findes i maven adenocarcinom versus de tilsvarende normale væv (p = 0,0092, p = 0,0003, og p = 0,0095, henholdsvis) (B) afvigende ekspression af HSA-MIR-720 på væv microarray. HSA-MIR-720 signifikant opreguleret i cervix uteri pladecellecarcinom, lunge planocellulært adenocarcinom, ovarie adenocarcinom og urothelial carcinoma versus de tilsvarende normale væv (p = 0,0086, p = 0,0386, p = 0,0404, og p = 0,035, henholdsvis ). HSA-MIR-720 er betydeligt nedreguleret i tarmslimhinden maligne væv versus normal hud væv (p = 0,0017). (C) afvigende ekspression af HSA-MIR-1280 på væv microarray. HSA-MIR-1280 nedreguleres i pladecellecarcinom, tarmslimhinden malignt væv, og pancreas adenocarcinom versus de tilsvarende normale væv (p 0,0001, p = 0,0009, og p = 0,0270, henholdsvis). HSA-miR-1280 opreguleres betydeligt i livmoderhalsen planocellulært karcinom væv versus normale livmoderhalsen væv (p = 0,01076). Mirna ekspressionsniveauer (y-akse) med en score = 0, 1, 2 eller 3, indikerer negativ, svag, middel eller stærk farvning intensitet hhv. n angiver antallet af de undersøgte prøver. NT angiver normale vævsprøver; CT angiver prøver carcinom væv. To-tailed student

t

tests blev udført for at sammenligne miRNA udtryk i normale og ondartede væv.

Paneler en gennem t show mave adenocarcinom prøver og paneler u gennem z show normal mave væv . Den blå farvning indikerer ekspression af HSA-MIR-638. Den røde farvning viser cellekernen (skala 200 um som figur 5a). j2 viser større forstørrelse (5x) af det indikerede i figur 5j og z2 viser større forstørrelse (5x) af det indikerede i figur 5z.

Sammenfattende vores studier heri afslører, at udtrykket niveauer af de fleste miRNA under human embryogenese er meget lave. Vi har udpeget 50 (~ 6%) af de 835 miRNA reguleret i uge 4 til 6 af humane embryonale udvikling som HES-miRNA, og viste, at nogle ikke-bevaret eller primat-specifik HES-miRNA er involveret i tumorigenese, hvilket understøtter hypotesen at tidlige aktier embryonale udvikling mange ligheder med udviklingen af ​​kræft i biologisk adfærd samt molekylemæssigt [22]. Men funktionerne af ikke-konserveret eller primat-specifik HES-miRNA tilbage, som skal eksperimentelt etableret, som vil hjælpe os yderligere at forstå komplicerede molekylære graduering netværk, der opstår i løbet af humane embryonale udvikling.

Støtte Information

Figur S1.

Hierarkisk klyngedannelse analyser af ekspressionen af ​​169 miRNA udviser signalstyrker større end 32 miRNA (n = 169) blev opdelt i 4 grupper: gruppering 1, 2, 3, og 4. Pilen viser miRNA, der blev udvalgt valideres af microRNA QRT-PCR (figur 3). Stjernen viser den ikke-konserveret eller primat-specifik HES-miRNA (figur S4)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0069230.s001

(TIF)

Figur S2.

Clustering analyser af miRNA-ekspression (

s

0,10) under human fosterudvikling Rød og grøn indikerer høje og lave ekspressionsniveauer henholdsvis

doi:. 10,1371 /journal.pone.0069230.s002 Hotel (TIF)

figur S3.

Conserved miRNA ekspressionsmønstre og biologiske karakteristika af menneske-mus homologer under fosterudviklingen. Uovervåget hierarkisk klyngedannelse analyser af miRNA ekspression pro fi les i mennesker (uge 4, 5 og 6, fig S3A) og muse embryo prøver (E9.5, E10.5, og E11.5, fig S3B). De microarray data mus embryo blev udgivet i 2006 af Mineno og kolleger. Farven i hvert gitter re fl ects Ekspressionsniveauet af miRNA i den tilsvarende prøve. De stigende intensiteter af rød indikerer, at en specifik miRNA har en højere udtryk i given prøve. De stigende intensiteter af grøn indikerer, at dette miRNA har lavere ekspression. Venn diagrammer skildrer kryds miRNA mellem mennesker (uge 4, 5 og 6), og mus embryo prøver (E9.5, E10.5 og E11.5) og viser, at 38 og 32 menneske-mus homologi miRNA blev opreguleret (C .) og nedreguleret (D), henholdsvis under mennesker og mus embryonale udvikling

doi: 10,1371 /journal.pone.0069230.s003

(TIF)

Figur S4.

Conservation analyser af HES-miRNA. Den miRviewer viser bevarelsen af ​​HES-miRNA gener, grupperet efter navn. De miRNA, som kun kan blive opdaget i mennesker eller andre primater, herunder miR-638, -663, -720, -936, -1246, -1268, -1275, og -1280, blev adskilt nedenfor. De stigende intensiteter af grøn indikerer, at en specifik miRNA (eller miRNA familie) har højere bevarelse i de pågældende dyrearter. Tal i parentes angiver antallet af de miRNA i en given miRNA familie. De fleste deler lignende bevarelse resultater

doi:. 10,1371 /journal.pone.0069230.s004

(TIF)

Figur S5.

HSA-MIR-638 ekspression i cervix uteri adenocarcinom og tilsvarende normale væv. Paneler A til t show livmoderhalsen adenocarcinom prøver og paneler u gennem z viser normale livmoderhalsen væv. Den blå farvning indikerer ekspression af HSA-MIR-638. Den røde farvning viser cellekernen (skala 200 um som figur S5a)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0069230.s005

(TIF)

Figur S6.

HSA-MIR-720 ekspression i cervix uteri adenocarcinom og tilsvarende normale væv.