PLoS ONE: GLI1 giver Gennemgribende fænotypiske ændringer upon LNCaP prostatacancerceller der omfatter erhvervelse af en hormon Uafhængig State

Abstrakt

GLI (GLI1 /GLI2) transkriptionsfaktorer har været impliceret i udviklingen og progressionen af prostatakræft, selv om vores forståelse af, hvordan de rent faktisk bidrager til biologi disse almindelige tumorer er begrænset. Vi observerede, GLI reporter aktivitet var højere i normal (PNT-2) og tumorigen (DU145 og PC-3) androgen-uafhængige celler sammenlignet med androgenafhængige LNCaP prostatacancerceller og følgelig blev GLI-mRNA-niveauer også forhøjet. Ektopisk udtryk for GLI1 eller konstitutivt aktive ΔNGLI2 mutant inducerede en tydelig brosten-lignende morfologi i LNCaP celler, der, om den tidligere, korreleret med øget GLI2 samt udtryk for de basale /stammer-lignende markører CD44, β1-integrin, ΔNp63 og BMI1 og nedsat ekspression af den luminale markør AR (androgen receptor). LNCaP-GLI1 celler var levedygtige i nærvær af AR inhibitor bicalutamid og genekspressionsprofilering afslørede, at transkriptomet af LNCaP-GLI1 celler var betydeligt tættere på DU145 og PC-3-celler end at styre LNCaP-PBP (tom vektor) celler, som samt identificere LCN2 /NGAL som en yderst induceret udskrift som er forbundet med hormon uafhængighed i bryst- og prostatakræft. Funktionelt, LNCaP-GLI1 celler vises større klonal vækst og var mere indgribende end kontrol celler, men de gjorde ikke danne kolonier i blød agar eller prostaspheres i suspension tyder på, at de ikke har iboende stamceller egenskaber. Desuden målrettet undertrykkelse af GLI1 eller GLI2 med siRNA ikke vende den transformerede fænotype af LNCaP-GLI1 celler heller ikke dobbelt GLI1 /GLI2 knockdowns aktiverer AR udtryk i DU145 eller PC-3 celler. Som sådan tidlig målretning af de GLI oncoproteiner kan hindre progression til et hormon uafhængig stat, men en mere detaljeret forståelse af de mekanismer, der opretholder denne fænotype er påkrævet for at afgøre, om deres hæmning vil øge effektiviteten af ​​anti-hormonbehandling gennem induktion af en luminale fænotype og øget afhængighed af AR-funktion

Henvisning:. Nadendla SK, Hazan A, Ward M, Harper LJ, Moutasim K, Bianchi LS, et al. (2011) GLI1 giver Gennemgribende fænotypiske ændringer upon LNCaP prostatacancerceller der omfatter erhvervelse af en Hormone uafhængig stat. PLoS ONE 6 (5): e20271. doi: 10,1371 /journal.pone.0020271

Redaktør: James McCubrey, East Carolina University, USA

Modtaget: 8. februar 2011; Accepteret: April 18, 2011; Udgivet: 25. maj 2011

Copyright: © 2011 Nadendla et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde var hovedsagelig (og generøst) støttet af Middlesex University Matched Funding Scheme (SKN), prostata Action https://www.prostateaction.org.uk/(SKN og AH: Grant koder G2007 /55, G2008 /07 og G2009 /30 ) og Barts og The London Charity https://www.bartsandthelondoncharity.org.uk/(GWN). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft (PCA) er den mest almindelige kræftform hos mænd, og selv om tumorer indledningsvist reagerer godt på anti-hormonbehandling, at mange tumorer udvikler resistens over for denne form for terapi giver en væsentlig hindring i behandling avancerede former af sygdommen. Skønt de præcise faktorer, der initierer PCa fortsat uklare, har talrige undersøgelser beskrevet genetiske læsioner og afvigende signaleringsmekanismer der kan bidrage til tumordannelse og progression, og dem, der hjælper bibringe androgen uafhængighed er af særlig interesse, da de kan repræsentere hidtil ukendte mål for terapeutisk intervention ( revideret i [1]).

Som med mange tumor former, har rollen som cancer stamceller (CSC) fået stor opmærksomhed i PCa biologi, især med hensyn til tumor initiering men også progression og metastatisk spredning (revideret i [2]). Som prostata tumorer viser en overvejende luminale fænotype herunder AR udtryk, er de menes at stamme fra luminale sekretoriske celler. Men baseret på CD profilering og cytokeratin udtryk, har basale-lignende egenskaber, er blevet identificeret i primære tumorer og kan øges i metastatisk og hormon-refraktær tumorer [3], [4]. Desuden basal /stamceller-lignende celler isoleret fra både primære tumorer og cancer cellelinjer vise større tumorigenicitet i mus xenograft eksperimenter [5], [6], [7], [8], [9], [10]. I modsætning hertil Vander Griend et al [11] foreslået, at kræft-initierende celle kan være en mellemliggende AR-udtrykkende celle, “erhverver stilk-lignende aktivitet”, og heterogenitet PCa er yderligere fremhævet af studier af musemodeller: Wang et al [12] beskrevet en sjælden luminal stamcellepopulations (udtrykkende Nkx3-1), der kan give anledning til tumorer hvorimod Lawson et al [13] fandt, at basale epitel stamceller blev transformeret mere effektivt.

Hedgehog (HH) signalering repræsenterer et stort udviklingsbane der er impliceret i dannelsen og udviklingen af ​​talrige tumortyper herunder huden, bryst, bugspytkirtel, hjerne og lunge. HH signalering, primært medieret af downstream GLI (med henvisning til både GLI1 og GLI2) transkriptionsfaktorer, er knyttet til tumorudvikling gennem regulering af forskellige mekanismer som proliferation, differentiering, apoptose, migration /invasion og vedligeholdelse af CSC populationer (revideret i [14], [15], [16]).

Nylige undersøgelser har beskrevet aktivering af HH signalering i PCa selv om resultaterne ofte har været modstridende og mekanismen (e), hvorved GLI bidrager til neoplasi er ikke godt forstået (revideret i [17], [18]). For eksempel har flere undersøgelser talt for, at øget epitelial GLI1 udtryk fremmer tumordannelse [19], [20], [21]. I modsætning hertil Fan et al [22] observeret nogen signifikant forskel i SHH eller GLI1 mRNA niveauer mellem tumor og zone matchede godartet væv og, mere væsentligt, blev denne GLI1 udtrykt i det stromale, men ikke epitel, komponent af BPH og PCa. Med hensyn til mere fremskreden sygdom tilstand, har høje niveauer af SHH protein og GLI1 mRNA blevet beskrevet i metastatiske prøver og DHH, GLI1 og GLI2 har været forbundet med overgangen til en hormon-refraktær tilstand [21], [23], [24], [25]. Desuden har nylige undersøgelser fastslået en forbindelse mellem HH /GLI og AR signalering i androgen-afhængige (AD), luminal epithelial LNCaP prostatacancer-cellelinie og viste, at GLI1 opretholder cellelevedygtigheden i fravær af AR-aktivitet [25], [26 ], [27], [28].

Her viser vi, at høj GLI aktivitet observeres i androgen-uafhængige (AI) DU145 og PC-3 epitelial prostatakræft-cellelinier, og at ektopisk GLI1 fremmer androgen uafhængighed i LNCaP celler, som korrelerer med deres forvandling til en fænotype mere karakteristisk for DU145 og PC-3 celler. Men GLI undertrykkelse ikke fremmer en AD fænotype i DU145 eller PC-3 celler. Som sådan tidlig målretning af GLI oncoproteiner kan hindre progression til et hormon uafhængig stat, men denne fremgangsmåde kan ikke forbedre effektiviteten af ​​anti-hormonbehandling i tumorceller, der har mistet AR udtryk og som ikke afhænger af dens signalering for deres levedygtighed .

Resultater

Analyse af GLI udtryk i prostata kræftceller

for at undersøge en formodet rolle for GLI i prostatakræft, vi først bestemmes niveauet af GLI reporter aktivitet i forskellige prostatacellelinjer. GLI reporter aktivitet var højere i AI DU145 og PC-3 prostata cancercellelinjer sammenlignet med AD LNCaP prostatacancer-cellelinie og reporteraktivitet var også højere i AI PNT-2 normal epitelial prostata-cellelinien (Fig. 1A). Følgelig GLI1 og GLI2 mRNA-ekspression var højere i alle AI cellelinjer sammenlignet med LNCaP-celler (fig. 1B). Som sådan vi analyseret effekten af ​​overekspression GLI1 og den aktive ΔNGLI2 mutant upon LNCaP cellebiologi. Det mest slående virkning af ektopisk GLI1 (eGLI1) og ΔNGLI2 relateret til cellemorfologi: i modsætning til den karakteristiske spindel-lignende morfologi af parentale eller kontrollere LNCaP-PBP (tom vektor) celler, inden for få dage efter transduktion celler /kolonier med en brosten-lignende morfologi var tydelige i LNCaP-celler overudtrykker eGLI1 eller ΔNGLI2 (fig. 1C). Efter udvælgelse af narkotika, havde både LNCaP-GLI1 og LNCaP-ΔNGLI2 celler fuldstændig omdannet vedtage en morfologi minder om PNT-2 eller DU145 celler (se fig. 5A for at se den fuldt transformerede morfologi). Ektopisk GLI1 og ΔNGLI2 proteinaktivitet blev bekræftet ved induktion af PTCH1 mRNA (fig. 1D). Desuden blev endogene GLI2 mRNA induceret i LNCaP-GLI1 celler mens uventet blev endogene GLI1 mRNA undertrykt i LNCaP-ΔNGLI2 celler afslører, at den morfologiske forandringer kan medieres af GLI2 (fig. 1E). Som DU145 og PC-3-celler udtrykker høje niveauer af både GLI1 og GLI2 sammenlignet med LNCaP-celler (fig. 1B), valgte vi at yderligere at undersøge biologi LNCaP-GLI1 celler.

(A) Analyse af GLI luciferase reporter aktivitet i forskellige androgen-uafhængige cellelinjer og i sammenligning til androgen-afhængige LNCaP-cellelinje. (B) Kvantitativ PCR-analyse af GLI1 og GLI2 mRNA niveauer i androgen-uafhængige cellelinier og sammenlignet med LNCaP-celler (C) Cobblestone-lignende celler /kolonier dukker op i LNCaP-celler med ektopisk GLI1 eller ΔNGLI2 ekspression (angivet ved pile). (D) qPCR-analyse af PTCH1 mRNA-ekspression i LNCaP-GLI1 og LNCaP-ΔNGLI2 celler. (E) qPCR analyse af GLI2 mRNA-ekspression i LNCaP-GLI1 celler og GLI1 mRNA-ekspression i LNCaP-ΔNGLI2 celler. (F) morfologi LNCaP celler, der udtrykker EGFP ændrer ikke ved samtidig dyrket med LNCaP-GLI1 celler.

I første omgang blev GLI reporter aktiviteten målt i LNCaP-GLI1 celler og vist at være på et niveau sammenligneligt med PC-3 og DU145 celler (fig. 1B, jf kolonnerne 2-4). Efterfølgende har vi rettet hvorvidt evne eGLI1 at inducere brosten-lignende morfologi i LNCaP-celler var gennem autonome midler, eller om dette krævede parakrin /juxtacrine signalering gennem molekyler udskilt af LNCaP-GLI1 celler eller ej. Morfologien af ​​LNCaP-celler, der udtrykker EGFP ændredes ikke ved samtidig dyrket med LNCaP-GLI1 celler afslører, at brosten-lignende morfologi induceres autonomt (fig. 1F). Vi kan imidlertid ikke udelukke, at induktion af brosten-lignende morfologi medieres gennem receptorer, der udtrykkes i LNCaP-GLI1 celler (oprindeligt med en normal morfologi), og at efterfølgende binde til molekyler udskilt af den samme (eller andet) LNCaP- GLI1 celler, der handler gennem parakrin /juxtacrine signalering

GLI1 giver androgenuafhængighed til LNCaP celler

udtryk for epitelial markører blev undersøgt for at bestemme, om den luminale fænotype af LNCaP celler blev ændret ved eGLI1.: AR var stærkt undertrykt i LNCaP-GLI1 celler mens den basale /stamme-lignende markører CD44, β1-integrin, ΔNp63, og BMI1 blev alle forøget (figur 2A.); dette blev bekræftet ved Western blot-analyse for AR og CD44, med øget celleoverfladeekspression af sidstnævnte bekræftet ved FACS (fig. 2B og C). På grund af den ensartede globale skift i CD44-ekspression vi valgte at ansætte den heterogen population til yderligere undersøgelse. Vedrørende androgen afhængighed, mens eksponering for AR inhibitor bicalutamid kraftigt undertrykt proliferationen af ​​LNCaP-PBP-celler, den forøgede proliferative potentiale LNCaP-GLI1 celler var upåvirket og dette blev bekræftet ved flowcytometri (fig. 2D, bane 1-4 og E ). Derfor, som bestemt ved epithelial markør ekspression og ufølsomhed over for bicalutamid, antyder disse data at eGLI1 inducerer regression (eller de-differentiering) af LNCaP-celler til en basal /stilk-lignende form, der er naturligt uafhængig af AR signalering for levedygtighed.

(A) qPCR analyse af epitelial markør udtryk i LNCaP-GLI1 celler i forhold til LNCaP-PBP celler (nb data præsenteres som naturlige logaritmer, så den relative induktion af CD44 er næsten 7000 gange). (B) Western blot-analyse af AR og CD44-ekspression i LNCaP-PBP, LNCaP-GLI1 og DU145 celler (pile angiver CD44-isoformer fælles for LNCaP-GLI1 og DU145 celler). (C) FACS-analyse af CD44-ekspression i LNCaP-PBP og LNCaP-GLI1 celler. (D) Proliferation assay at sammenligne og at bestemme virkningen af ​​bicalutamid på proliferationshastigheden af ​​LNCaP-PBP og LNCaP-GLI1 celler såvel som virkningen af ​​AG1478 (EGFR inhibitor) og U0126 (MEK-inhibitor) ved sidstnævnte. (E) Analyse af cellecyklus ved flowcytometri i LNCaP-PBP og LNCaP-GLI1 celler udsat for bicalutamid.

For at undersøge dette yderligere, LNCaP-PBP, LNCaP-GLI1, DU145 og PC 3-celler blev analyseret ved DNA microarrays: global tabel profilering afslørede, at transkriptomet af LNCaP-GLI1 celler var mere ligner DU145 og PC-3-celler end til LNCaP-PBP-celler således afslører hvilket omfang LNCaP-GLI1 celler har ændret fænotype ( fig. 3A). I direkte sammenligning med LNCaP-PBP-celler, ekspression af 260-transkripter afveg mere end 10-fold (144 op og 116 ned) i LNCaP-GLI1 celler (fig. 3B og fig S1 og S2). Funktionel klassifikation af disse udskrifter produceret 15 ontologiske grupper, herunder dem, der er forbundet med tumor biologi, såsom celle-celle-adhæsion, celle motilitet, EMT (epitelial-mesenkymale overgang) og hormon uafhængighed (figur S3); sidstnævnte gruppe, herunder LCN2 (lipocalin 2) og CAV2 (caveolin 2), som tidligere blev identificeret som en del af en fælles signatur for hormon uafhængighed i bryst- og prostatakræft [29]. De fleste af de 144 forøgede udskrifter blev udtrykt på lignende niveauer i LNCaP-GLI1 celler sammenlignet med DU145 og /eller PC-3 celler ( 3-fold forskel), mens ekspressionen af ​​12 transkripter (herunder LCN2) var 3 gange højere hos LNCaP-GLI celler sammenlignet med begge celletyper (figur S1 og tabel 1). Omvendt af 116 faldt transkripter kun én, MRPL23, blev udtrykt . 3 gange lavere i LNCaP-GLI1 celler sammenlignet med både DU145 og PC-3-celler (figur S2)

(A) En statistisk sammenligning af globale genekspressionsprofiler at bestemme procentdelen af ​​udskrifter, der udtrykkes på meget forskellige niveauer i LNCaP-PBP, DU145 og PC-3 celler i forhold til LNCaP-GLI1 (Pearson korrelation koefficient ≥0.7, p 0,05) (B ) Heat kort angiver udskrifter i LNCaP-GLI1 celler, hvor ændringen i udtrykket er begge 10 gange og stærkt signifikant forskellig i forhold til LNCaP-PBP celler (studerendes

t

-test, p 0,01): lister venstre panel øgede gener, lister højre panel faldt gener og DU145 og PC-3-celler er vist til sammenligning (* betegner transcript varianter af det samme gen). (C) Western blot-analyse sammenligning af ekspressionen af ​​visse signalproteiner mellem LNCaP-PBP og LNCaP-GLI1 celler med DU145 og PC-3-lysater medtaget til sammenligning. (D) Phosphorylering af den cytoskeletale protein MLC2 medieres af ROCK i LNCaP-GLI1 celler (nb antistoffet for total MLC virkede ikke i vores hænder).

Samt mikromatrice profilering, blev omfanget af stor signalvej aktivering vurderes ved Western blotting i LNCaP-GLI1 celler. Hormone uafhængighed er forbundet med EGFR-aktivering og selv om det er godtgjort, at EGFR mRNA-ekspression ikke er steget betydeligt i AI cellelinier ([29] og vores microarray data), en stærk stigning i EGFR proteinekspression blev observeret i LNCaP-GLI1 celler til et niveau sammenligneligt med DU145 og PC-3-celler (fig. 3C). ERK (Ekstracellulær signal-kinase) aktivitet blev også forøget i LNCaP-GLI1 celler (fig. 3C) og farmakologisk inhibering af EGFR eller ERK undertrykt deres høje proliferative potentiale (fig. 2D, jf kolonnerne 1, 3, 5 og 6) . Med hensyn til AKT, selvom øget aktivitet er forbundet med mutations inaktivering af PTEN i LNCaP celler [30], [31], [32], eGLI1 reduceret det til et niveau, der svarer med DU145 celler tyder på, at der er mekanisme (r), som kan udnyttes at undgå tabet af denne vigtige tumorsuppressorgen (fig. 3C). Med hensyn til cytoskelettet, LNCaP-GLI1 celler udviste en stigning på MLC2 (myosin let kæde 2) phosphorylering, der svarede til både DU145 og PC-3-celler (fig. 3C og data ikke vist). MLC2 regulerer actincytoskelettet (herunder stress fiber dannelse) og er selv reguleret af MLCK (myosin let kæde kinase) og ROCK (Rho-associeret kinase); eksponering for ROCK inhibitor Y27632 men ikke MLCK inhibitoren ML-7 reduceret MLC2 phosphorylering selvom dette ikke vende brosten-lignende morfologi af LNCaP-GLI1 celler (fig. 3D og upublicerede observationer). Sammenfattende disse data yderligere demonstrerer, i hvilket omfang LNCaP-GLI1 celler ligner DU145 og PC-3 celler.

LNCaP-GLI1 celler ikke vise forankring-uafhængig vækst

HH /GLI signalering regulerer normal og cancer stamceller populationer og nyere undersøgelser har beskrevet, hvordan EMT er en iboende egenskab af sådanne celler [15], [16], [33]. Interessant, trods deres brosten-lignende morfologi, resultaterne af microarray afslørede, at eGLI1 inducerer EMT i LNCaP-celler (figur S3). Faktisk faldt E-cadherin og forøget vimentin ekspression blev bekræftet ved Western blotting, selv om dette ikke var afhængig af EGFR eller MEK-ERK-signalering [34] (fig. 4A). Følgelig LNCaP-GLI1 celler var stærkt invasiv gennem en Matrigel ™ substrat (fig. 4B), og de vises også større klonal vækst, når podet ved lav densitet (fig. 4C). Men på trods af udtryk af ‘stemness’ markører (herunder CD44, β1-integrin og BMI1), EMT og større klonal vækst (fig. 2A, 4A og 4C), i modsætning til kontrol celler LNCaP-GLI1 celler ikke danne prostaspheres i suspension eller kolonier i blød agar (fig. 4D). For at løse den mulighed, at LNCaP-GLI1 celler ikke prolifererer i 3-D kultur, fordi de ikke er i stand til at differentiere hen imod en luminal fænotype (dvs. på grund af konstitutiv eGLI1 ekspression), DU145 celler blev også dyrket under de samme betingelser. Ingen kolonier blev observeret i begge assay med DU145 celler antyder, at AR

– celler er dårligt klonogene i forankringsuafhængig

in vitro

dyrkningssystemer (data ikke vist); Dette understøttes af Thiyagarajan et al [35], som bemærkede, at DU145 (og PC-3 celler) var meget mindre proliferativ i blød agar sammenlignet med LNCaP celler selv om nogle koloni vækst var tydelig i deres undersøgelse.

(A ) Western blot analyse sammenligner udtryk for EMT markører E-cadherin og vimentin mellem LNCaP-GLI1 og LNCaP-PBP celler (nb faldet af E-cadherin i LNCaP-GLI1 celler er delvist vendt i overværelse af EGFR inhibitor AG1478 og til mindre grad MEK-inhibitor U0126). (B) Transwell invasion assay sammenligne den invasive potentiale af LNCaP-PBP og LNCaP-GLI1 celler gennem en Matrigel substrat. (C) Clonogenicity assay vurdere kolonidannende evne LNCaP-PBP og LNCaP-GLI1 celler, når podet ved lav densitet. observeres (D) Anchorage-uafhængig vækst i LNCaP-PBP celler, men ikke LNCaP-GLI1 celler (øverste panel – blød agar koloni assay, bund panel – prostasphere assay).

GLI undertrykkelse fremmer ikke en luminal-lignende fænotype i androgen-uafhængige prostatacancerceller

Endelig søgte vi at bestemme, om en målrettet undertrykkelse af GLI var tilstrækkelig til at vende den transformerede fænotype af LNCaP-GLI1 celler eller at inducere en luminal-lignende fænotype i DU145 eller PC-3-celler. Transfektion af LNCaP-GLI1 celler med GLI1 eller GLI2 siRNA påvirkede ikke morfologien af ​​LNCaP-GLI1 celler der var heller ingen ændring i ekspressionen af ​​ΔNp63 eller AR mRNA (Fig 5A-C og figur S4A.); dette indikerer, at den fænotypiske omdannelse induceret af eGLI1 i LNCaP-celler er irreversibel, og at opretholdelsen af ​​AI fænotype ikke er afhængig af GLI2. Vedrørende DU145 og PC-3-celler blev virkningen af ​​dobbelte GLI1 /GLI2 knockdowns bekræftet ved et fald på GLI reporter aktivitet, men der var ingen ændring i cellemorfologi var heller ingen ændring i ekspressionen af ​​ΔNp63 eller AR mRNA (fig. 5D -F, fig s4b og upublicerede observationer). Vi anvendte også GLI inhibitoren GANT61 (30 uM) [36], men dette var mindre effektiv til at undertrykke GLI reporter aktivitet end RNAi (data ikke vist). Som sådan, selv om AI prostatacancerceller vise høj GLI mRNA-ekspression og aktivitet og eGLI1 er i stand til at fremme en AI fænotype i LNCaP celler, GLI undertrykkelse ikke fremmer en luminale-lignende og AD fænotype i AI prostata kræftceller.

(A) Den transformerede morfologi af LNCaP-GLI1 celler ikke omvendt ved transfektion med GLI1 eller GLI2 siRNA. (B) qPCR-analyse af GLI1 og GLI2 mRNA i LNCaP-GLI1 celler transficeret med GLI1 eller GLI2 siRNA. (C) RT-PCR-analyse af ΔNp63 og AR mRNA i LNCaP-GLI1 celler transficeret med GLI1 eller GLI2 siRNA. (D) qPCR-analyse af GLI1 og GLI2 mRNA i DU145 og PC-3-celler transficeret med GLI1 og GLI2 siRNA. (E) GLI reporter aktivitet undertrykkes i DU145 og PC-3-celler transficeret med GLI1 og GLI2 siRNA (N. B. reporter aktivitet kan være påvirket af GLI3 udtryk i PC-3 celler [17]). (F) RT-PCR-analyse af ΔNp63 og AR mRNA i DU145 og PC-3-celler transficeret med GLI1 og GLI2 siRNA.

Diskussion

rolle HH signalering har vist omstridt i PCa biologi; dette omfatter debat om, hvorvidt pathway bidrager til primær tumordannelse såvel den aktuelle funktionsmåde signalering (autokrin eller parakrin). Derudover har der været modstridende data om, hvorvidt eller ej gli ekspression medieres gennem kanoniske eller ikke-kanoniske veje i PCA-cellelinjer (gennemgået i [18]). Vi har ikke behandlet karakteren af ​​GLI regulering, men har vist, at AI cellelinjer PNT-2, DU145 og PC-3 display højere niveauer af GLI mRNA end AD LNCaP prostatakræft cellelinje og dette korrelerer med øget GLI reporter aktivitet (fig . 1A og B). Den omstændighed, at GLI1 ekspression var sammenlignelig mellem normale PNT-2-celler og tumorigen DU145 og PC-3-celler var uventet, men i modsætning til Karhadkar et al [21], vi fandt også, at GLI1 mRNA var stærkt udtrykt i kommercielle primære prostata basale epitelceller (PrECs), selvom en trofast sammenligning med de cellelinier anvendt i dette studie var ikke mulig, fordi PrECs dyrkes i specialiserede medium, der ikke indeholder serum (SKN og GWN, ikke publiceret). På trods af disse observationer, er på proteinniveauet GLI1 sjældent detekteres i det basale lag af normalt humant prostatavæv henviser udtrykket er mere udbredt i hyperplastiske basale celler og carcinomer [20]. Som sådan på en måde beslægtet med GLI2 regulering [37], selv om GLI1 mRNA-ekspression er konstant mellem normale og tumorogene celler, kan proteinet blive stabiliseret i sidstnævnte (muligvis gennem Fused [38]), og dette, sammen med GLI2, kunne forklare stigningen i GLI reporter aktivitet.

Vores data tyder på, at GLI1 inducerer androgenuafhængighed i LNCaP-celler gennem dets evne til at inducere en basal-lignende fænotype, der er associeret med basale cellepopulationer og det er naturligt uafhængig af AR aktivitet; Dette understøttes af reduceret AR udtryk kombineret med en stigning på talrige basale /stamceller-lignende markører. Chen et al [26] beskrev også en rolle for GLI1 at fremme AI væksten i LNCaP celler, men dette blev ikke forbundet med reduceret AR udtryk og kan afspejle, at eGLI1 udtryk var lavere i deres system som bestemt ved en mindre fold-stigning på GLI1 reporter aktivitet. Selv om vores undersøgelser blev udført på en heterogen cellepopulation, fænotype var ensartet, og vi har ikke været i stand til at isolere LNCaP-GLI1 klonale linjer, der opretholder normal LNCaP morfologi indikerer, at retroviral eGLI1 fremmer en “alt eller intet” svar, men som niveauet af GLI reporter aktivitet var sammenlignelig med DU145 og PC-3 celler indikerer dette, at vores system har biologisk relevans. Hvordan eGLI1 medierer omdannelsen af ​​LNCaP-celler er ikke blevet belyst, men kan involvere flere mekanismer: eGLI1 inhibering af AR signalering alene er usandsynligt at indlede den fænotypiske ændring, men kombineret med dets evne til at opretholde cellernes levedygtighed i fravær af AR signalering [27] , [28], kan dette forværre virkningerne af dets vigtigste rolle som transkriptionel aktivator.

som nævnt ovenfor eGLI1 øget total GLI aktivitet i LNCaP celler til et niveau, der svarer med DU145 og PC-3 celler. 3B.