PLoS ONE: nedregulering af 5-HT1B og 5-HT1D receptorer Forhindrer spredning, Clonogenicity og Invasion of Human kræft i bugspytkirtlen Cells

Abstrakt

Bugspytkirtelkræft duktalt adenokarcinom er kendetegnet ved omfattende lokal tumor invasion, metastase og tidlig systemisk spredning. Langt størstedelen af ​​kræft i bugspytkirtlen (PaCa) patienter, der allerede har metastatisk komplikationer på tidspunktet for diagnosen, og dødeligheden af ​​denne dødelige form for kræft er steget i de seneste årtier. Således bestræbelser på at identificere roman molekylært målrettede behandlinger er prioriteter. Nylige undersøgelser har antydet, at serotonin (5-HT) bidrager til tumorvækst i en række forskellige cancere, herunder prostata, colon, blære og leverkræft. Men der er mangel på beviser om effekten af ​​5-HT-receptorer på fremme kræft i bugspytkirtlen. Efter at have overvejet den rolle af 5-HT-1-receptorer, især 5-HT

1B og 5-HT

1D undertyper i forskellige typer af maligne lidelser, er formålet med denne undersøgelse var at undersøge rollen af ​​5-HT

1B og 5-HT

1D receptorer i PaCa vækst og progression og analysere deres potentiale som cytotoksiske mål. Vi fandt, at knockdown af 5-HT

1B og 5-HT

1D receptorer ekspression, via bestemte lille interfererende RNA (siRNA), inducerede signifikant inhibering af proliferation og clonogenicity af Paca celler. Også, det undertrykte signifikant invasion PACA celler og reducerede aktiviteten af ​​uPAR /MMP-2 signalering og Integrin /Src /Fak-medieret signalering, som integrerede tumorcellelinier pathways associeret med invasion, migration, adhæsion og proliferation. Desuden målretning 5-HT

1B og 5-HT

1D receptorer nedregulerer zinkfinger ZEB1 og sneglen proteiner, kendetegnende transkriptionsfaktorer der regulerer epitel-mesenkymale overgang (EMT), samtidig med opregulering af claudin- 1 og E-cadherin. Afslutningsvis vores data antyder, at 5-HT spiller

1B- og 5-HT

1D-medieret signalering en vigtig rolle i reguleringen af ​​den proliferative og invasive fænotype af PaCa. Det fremhæver også det terapeutiske potentiale af målretning af 5-HT

1B /1D receptorer i behandlingen af ​​PaCa, og åbner en ny vej for biomarkører identifikation, og værdifulde nye terapeutiske mål for styring kræft i bugspytkirtlen.

Henvisning: Gurbuz N, Ashour AA, Alpay SN, Ozpolat B (2014) nedregulering af 5-HT

1B og 5-HT

1D Receptorer Forhindrer spredning, Clonogenicity og invasion of human bugspytkirtelkræftceller. PLoS ONE 9 (8): e105245. doi: 10,1371 /journal.pone.0105245

Redaktør: Rajeev Samant, University of Alabama i Birmingham, USA

Modtaget: Marts 13, 2014 Accepteret: 21 Juli 2014; Udgivet: 29 August, 2014

Copyright: © 2014 Gurbuz et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Texas Center for Cancer Nanomedicin (TCCN), en National Cancer Institute (NCI) Center for Nanoteknologi (454CA151668), og ved siRNA center projekt, MD Anderson Cancer center, UT, Houston, Texas, USA. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i bugspytkirtlen (PaCa), der har en stærk invasiv kapacitet med hyppige metastaser og tilbagefald, er kendt for at være en af ​​de mest dødelige menneskelige kræftformer med 5% 5-års overlevelse [1]. Selv om det kun rangerer tiendedel i forekomsten blandt de mest almindelige menneskelige kræftformer, PaCa er den fjerde hyppigste årsag til kræftdødsfald i vestlige lande og dens dødelighed ikke er faldet i de seneste årtier [2], [3]. Samlet set PaCa har omkring 100% mortalitet, fordi det generelt er opdaget på forhånd stadier, da det typisk ikke forårsager nogen symptomer på tidligere stadier [4]. PaCa er uløseligt resistente over for apoptose og dårligt reagerer på eksisterende lægemidler, herunder kombinerede kemoterapeutiske regimer [5]. For at overvinde dette globale sundhedsproblem, er undersøgelserne fokuseret på identifikation af nye molekylære mål at udvikle nye behandlingsstrategier.

mitogene neurotransmitter, serotonin (5-HT) er tidligere kendt for at fungerer som en vækstfaktor [ ,,,0],6] for flere typer af ikke-tumorceller (f.eks vaskulære glatte muskelceller, lungefibroblaster og renale mesangialceller) [7], [8], og tumorceller (f.eks pankreatiske carcinoide celler, småcellet lungecarcinom-celler og colorectalt carcinom) [9], [10], [11]. For nylig er 5-HT dukket op som en vigtig regulator af celleproliferation og tumorvækst i en række forskellige cancertyper [12], [13], [14], [15]. Under tumorprogression, tyrosinhydroxylase, det hastighedsbegrænsende enzym i serotonin biosyntesevejen, ofte opreguleres [16]. Vigtigere er, har forskellige 5-HT-receptorer blevet identificeret (5-HT-1-7) baseret på deres strukturelle, funktionelle og farmakologiske karakteristika [17], [18]. Seks af de familier af 5-HT-receptorer er G-protein-koblet, herunder Gi: 5-HT-1, Gs: 5-HT-4,6,7, og Gq /11: 5-HT-2,5. Kun 5-HT-3 er entydigt et ligand-gated kationkanal, relateret til nikotinacetylcholinreceptoren [16]. 5-HT-receptorer er endvidere opdelt i forskellige undertyper, fx 5-HT-1 familien har fem undertyper [18], der omfatter den 5-HT-1A, 1b, -1d, -1e og -1f receptorer og par fortrinsvis til Gi /o til at inhibere cAMP-dannelse [19], [20 ]. Især den humane 5-HT

1B og 5-HT

1D receptorer er især i sekvens trods bliver kodes af to forskellige gener. Den præcise funktion af disse receptorer forbliver udefineret, og fremskridt i retning af dette er blevet hæmmet af manglen på selektive ligander [21]. Det blev tidligere anført, at 5-HT-1-receptorer udførligt udtrykkes i human brystcancer [22], prostatacancer [23] og blære cancerceller [18], hvilket kunne forklare de mitogene virkninger af agonister af disse receptor i sådanne cancerformer. Kræft i bugspytkirtlen forskning har primært fokuseret på studiet af genmutationer og signaltransduktionsveje i bugspytkirtlen ductal adenocarcinom (PDAC) celler, hvorimod er stort set blevet ignoreret potentielle rolle neurotransmitterreceptorer i udvikling og progression af denne dødelige neoplastisk sygdom [4]. I betragtning af den potentielle involvering af 5-HT-1-receptorer signalering af spredning af flere typer af kræft, med ukendte konsekvenser af disse receptorer på PaCa progression, undersøgte vi her den rolle, som 5-HT

1B og 5-HT

1D receptorer i proliferation og den invasive fænotype af PaCa.

lokal invasion kan betragtes som et første og afgørende skridt inden for malignitet af carcinomer, hvilket fører til dannelsen af ​​sædvanligvis fatal fjernmetastaser. For cancercellerne at invadere fjerne væv, de har til at trænge omgivende ekstracellulære matrixer. Sådanne cancercelle /ECM-interaktioner lettes af integrinfamilien af ​​celleadhæsionsmolekyler herunder tyrosin-phosphorylerede substrater (tyrosinkinase Src og fokal adhæsion kinase) [24]. Integriner er trans-membranøse a /p heterodimere receptorer som medierer celle-celle interaktioner og cellebinding til ekstracellulær matrix (ECM) [25], og de tjener som receptorer for nogle ECM-proteiner (fx fibronectin vitronectin, laminin og collagen) [ ,,,0],26]. Altered integrin aktivitet eller substrat affinitet kan bidrage til den neoplastiske fænotype. Normalt cellulær Src holdes i en inaktiv tilstand, men i flere kræfttyper, unormale begivenheder medfører forhøjet kinase aktivitet af proteinet og forårsage pleiotrope cellulære responser inducerende transformation og metastase [27].

Som carcinomer fremskridt, tumorerne kan miste epithelmorfologi og erhverve mesenchymale egenskaber, som bidrager til metastatisk potentiale. En epitelial til mesenkymale overgang (EMT), en kritisk proces svarende til processen med embryonale udvikling, menes at være en vigtig mekanisme til fremme cancer invasion og metastase [28]. I de senere år har ZEB familie af zinkfinger transkriptionsfaktorer blevet dokumenteret som væsentlige spillere af EMT [29]. Epitel adhæsionsprotein, E-cadherin, er en aktiv suppressor af invasion og vækst af mange epiteliale cancere, og dets nedregulering betragtes kendetegnende for EMT [30], [31]. E-cadherin er en større målgen af ​​ZEB familien transkriptionelle repressorer. EMT-fremkaldende mediatorer, såsom TCF8, udløse epitelial dedifferentiering ved at ændre udtrykket /funktion af E-cadherin [32]. De E-cadherin repressorer kan regulere udviklingsmæssige transkriptionelle programmer EMT i tumorceller som disponerer dem til invasion og metastase [33]. Således mutationer i ZEB gener knytte disse faktorer til ondartet tumor progression [29].

Den aktuelle undersøgelse fokuserede på at undersøge betydningen af ​​5-HT

1B og 5-HT

1D receptorer på PaCa spredning og invasion. Vores data viser signifikante reduktioner i PaCa vækst celler, invasion og korreleret nedstrøms signalering som respons på nedregulering af disse serotoninreceptorer udtryk, hvilket tyder på signifikant involvering af disse receptorer til fremme bugspytkirtelkræft.

Materialer og metoder

cellelinjer, dyrkningsbetingelser og reagenser

De humane pancreas cancer cellelinjer blev indhentet fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). Panc-1 og MiaPaCa-2-celler blev dyrket i DMEM /F12 suppleret med 10% FBS. Alle medier indeholder penicillin og streptomycin (100 enheder /ml). Celler blev holdt ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO

2/95,% luft, og blev anvendt mellem passage 4 og 15. Humane pancreas kanalen epiteliale (Æske med HDPE) -celler blev venligst stillet til rådighed af Dr. Kapil Mehta, Institut for eksperimentel terapeutisk, MD Anderson Cancer center, som en generøs gave. Æske med HDPE-celler blev holdt i keratinocyt serumfrit medium (keratinocyt-SFM, 1X) indeholdende L-glutamin og suppleret med prækvalificerede human rekombinant epidermal vækstfaktor 1-53 (EGF 1-53) og 25 mg /500 ml oksehypofyseekstrakt ( BPE) (Invitrogen /Life Technologies, Carlsbad, CA). NF-KB-aktivering inhibitor II, JSH-23 (4-Methyl-N

1- (3-phenylpropyl) benzen-1,2-diamin) (EMD Millipore Billerica, MA), blev opløst i DMSO ved en endelig bestand koncentration på 10 mM, og tilsat direkte til cellekulturer på 25 og 50 pM koncentrationer, som selektivt blokerer nuklear translokation af NF-KB p-65 og dens transkription aktivitet.

Transfektioner med siRNA

eksponentielt voksende ubehandlede PANC-1 og MiaPaCa-2-celler blev udpladet 24 timer før transfektion. Udpladede celler blev transficeret med dobbeltstrenget siRNA targeting mRNA’et af de serotonerge receptorer (5-HT-1) undertypen -B eller -D (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), eller transficeret med kontrol (ikke-nedregulering) siRNA; (5′-AAUUCUCCGAACGUGUCACGU-3 ‘) [34], [35] (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). siRNA targeting vævstransglutaminase (TG2) (Qiagen, Valencia, CA) blev også anvendt [35]. Celler blev transficeret med enten siRNA, ved en slutkoncentration på 25-50 nM i 72 timer under anvendelse HiPerFect transfektionsreagens (Qiagen, Valencia, CA) ifølge fabrikantens protokol. Koncentrationerne af siRNA’er blev valgt baseret på dosis-respons-undersøgelser. Ikke-silencing kontrol siRNA-transficerede celler blev anvendt som negative kontroller. Efter behandling blev cellerne høstet /forarbejdet til yderligere analyse og analyser.

Cell levedygtighed og proliferation /vækst analyser

levedygtighed og /eller spredning af celler blev opdaget af MTS assay (Promega, Madison, WI, USA), efter cellerne behandling, til at måle cellevækst. Celler blev talt under anvendelse af et hæmocytometer og levedygtige celler blev identificeret ved trypan blå-udelukkelse. Levedygtige celler blev podet i plader med 96 brønde (1,5 x 10

3 celler /brønd), og transficeret med angivne siRNA’er. Efter 72 timers behandling, en opløsning indeholdende MTS (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxy-methoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) -2H-tetrazolium) og PMS ( phenazinmethosulfat) (20:01 vol /vol) blev tilsat til cellerne. Efter 2-3 timers inkubation ved 37 ° C blev de levedygtige celler i vækst estimeres ved at overvåge absorption af produktet ved 490 nm, baseret på genereringen af ​​formazan via levende celler. Alle eksperimenter blev udført tredobbelt, og resultaterne blev rapporteret som middelværdien af ​​absorption ± standardafvigelse.

Klonogen overlevelse assay

Paca celler blev podet i 6-brøndsplader (1,5 × 10

3 celler /brønd), transficeret med ikke-silencing kontrol siRNA, eller siRNA mod 5-HT

1B eller 5-HT

1D (en gang /uge), og dyrket i 2 uger. De dannede kolonier blev farvet med krystalviolet, og kolonierne-Områdefordeling regioner blev målt densitometrisk [36]. Hvert forsøg blev udført tredobbelt, og resultaterne blev rapporteret som middelværdien af ​​absorption ± standardafvigelse.

Matrigel invasion assay

PaCa celler blev transficeret med 50 nM angivne siRNA’er, og 72 timer senere, lige stort antal af de behandlede levedygtige celler (4 x 10

4 celler), podedes på Matrigelcoatede Transwells (med 8- um porestørrelsesfiltre) i Matrigel invasion kamre (BD Biosciences, San Jose, CA). Antallet af celler, der invaderede den nedre side af membranen efter 24 timer blev bestemt ved tælling celler i mindst fire tilfældigt udvalgte områder. Forsøgene blev udført i tre eksemplarer, og resultaterne blev rapporteret som gennemsnit af procentdele af invasion ± standardafvigelse.

Migration Assay

In-vitro

sårhelende assay blev anvendt at vurdere cellemotilitet og evnen til at migrere. PANC-1-celler blev udpladet i 6-brønds plader (5 x 10

5 celler /brønd) og dyrket i medium indeholdende 10% FBS for at opnå en næsten sammenflydende cellemonolag. En ridse blev derpå forsigtigt foretaget på cellelaget ved anvendelse af en 10 pi sterilt mikropipettespids, og enhver cellerester blev fjernet ved vask med PBS til fjernelse af flydende celler. De sårede monolag blev derefter transficeret med 50 nM angivne siRNA’er. Umiddelbart efter behandlingerne blev cellerne fotograferet under anvendelse af et fasekontrastmikroskop (Nikon), at bestemme såret bredde på tidspunkt 0. Kulturerne blev fortsat, og cellerne blev fotograferet igen efter 12 timer og efter 24 timer for at såre cellen lag. Sårhelingen blev visualiseret ved at sammenligne fotografier taget ved 0 timer med dem, der træffes ved 12 timer og 24 timer senere, og analyseret for afstanden migrerede ved forkanten af ​​såret ved hvert tidspunkt. Den strækning af cellerne blev bestemt ved måling af såret bredde på tidspunktet 12 timer og 24 timer, og subtrahere det fra såret bredde på tidspunkt 0. De opnåede var værdierne derefter udtrykt som% migration, indstilling af spaltebredden ved 0 h som 100%. Tre eksperimenter blev udført tre gange.

Western blot analyse

Celler blev udsået i 25-cm

2 dyrkningskolber (0,5 × 10

6 celler /kolbe). Efter behandlinger, blev cellerne opsamlet, centrifugeret, vasket to gange i iskold PBS og hel-cellelysater blev fremstillet ved at suspendere cellerne i en lysebuffer ved 4 ° C. Lysater blev centrifugeret ved 13.000 g i 10 minutter ved 4 ° C, og supernatanten fraktioner blev opsamlet. Total proteinkoncentration for hver prøve blev bestemt ved et detergent kompatibelt protein assay kit (Bio-Rad, Hercules, CA), og Western blotting blev udført som 40 ug protein /bane på 4-15% SDS-PAGE-gel. Proteinerne blev elektro-overført til PVDF-membraner og blev først inkuberet med de følgende primære antistoffer; p-Src (Tyr-416), Src, β1 integrin, uPAR, MMP-2, snail, TCF8 /ZEB1, NF-KB (p-105 /p-50), og Claudin-1 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA); p-FAK (Tyr-397), FAK (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ); 5-HT

1B (Sigma Chemical, St. Louis, MO); TG2 og α-SMA (Abcam, Cambridge, MA); Fibronectin og 5-HT

1D (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), og derefter med peberrod peroxidase-konjugeret anti-kanin eller anti-muse-sekundært antistof (Cell Signaling Technology, Danvers, MA). β-actin (Sigma Chemical, St. Louis, MO), eller α-β-tubulin (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) blev anvendt som indlæsning kontroller. Alle antistoffer blev fortyndet i TBS-Tween 20 indeholdende 5% tørmælk. Kemiluminescerende påvisning blev udført med Chemi-glød påvisningsreagenser (Alpha Innotech, San Leandro, CA), og blottene blev visualiseret med en FluorChem 8900 billeddanner, og kvantificeres ved et densitometer under anvendelse af billedet analyseprogram (ImageJ 1.48s forarbejdning software, National Institutes Sundhedsstyrelsen, Bethesda, MD, USA). Alle eksperimenter blev uafhængigt gentaget mindst to gange. Salg

omvendt fase proteinarrays (RPPA)

siRNA-transficerede PANC-1-celler (0,5 x 10

6 celler /2 ml medier) blev podet i 6-brønds plade. Efter 72 timers inkubation blev cellerne vasket to gange med PBS, og 150 pi af lyseringsbuffer [1% Triton X-100, 50 mM Hepes (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1,5 mM MgCl

2, 1 mM EGTA , 100 mM NaF, 10 mM Sod. pyrophosphat, 1 mM Na

3VO

4 og 10% glycerol, der indeholder proteinase og phosphataseinhibitorer (Roche Applied Science, Indianapolis)] blev sat til hver brønd. Cellelysaterne blev opsamlet, og RPPA blev behandlet som beskrevet før [35].

RNA-isolering og revers transkriptase-polymerasekædereaktion (RT-PCR) analyse

Totalt RNA blev isoleret fra opsamlede celler med TRIzol Reagent (Invitrogen /Life Technologies, Carlsbad, CA), og cDNA blev opnået fra 1 ug totalt RNA ved anvendelse RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific). CDNA’et for 5-HT

1B, 5-HT

1D, β1 integrin, TG2 og GAPDH blev amplificeret under anvendelse Platinum Taq DNA Polymerase (Invitrogen /Life Technologies), med specifikke primere. Kort beskrevet blev 2 pi af den samlede 20 pi af revers-transkriberet produkt, der anvendes til PCR i 1 × PCR-buffer indeholdende 1,5 mM MgCl

2, 200 uM deoxynukleotidtriphosphater (dNTP’er), 1 enhed af Platinum Taq polymerase og 0,2 uM af hver angivne primere (Integrated DNA Technologies, IDT) eller GAPDH-specifikke primere (Thermo Scientific). Sekvenserne af sense og anti-sense-5-HT

1B primere er 5′-TGCTGGTTATGCTATTGGCG-3 ‘; og 5’-GATGACACAGAGGTGCAGGATG-3 ‘. Sekvenserne af sense og anti-sense-5-HT

1D primere er 5′-TGCCGTGGTCCTTTCCGTC-3 ‘; og 5’-GGTGATGGTATAGGCGATGCTG-3 ‘. Sekvenserne af sense og anti-sense p1 integrin primere er 5’-CCTACTTCTGCACGATGTGATG-3 ‘; og 5’-CCTTTGCTACGGTTGGTTACATT-3 ‘. Sekvenserne af sense- og anti-sense TG2 primere er 5’-TAAGAGATGCTGTGGAGGAG-3 ‘; og 5’-CGAGCCCTGGTAGATAAA-3 ‘. CDNA prøverne blev inkuberet ved 94 ° C (2-5 min.) For at denaturere templaten og aktivere enzymet. Dette trin blev efterfulgt af 35 cykler af PCR-amplifikation (som 94 ° C i 30 s, 55 ° C i 30 s og 72 ° C i 60 s med 5-HT

1B primer; 94 ° C i 30 s, 60 ° C i 30 s og 72 ° C i 60 s med TG2 primer; 94 ° C i 30 s, 58 ° C i 45 s og 72 ° C i 60 s med 5-HT

1D og p1 integrin primere, i hver cyklus). PCR-reaktionen blev afsluttet med en endelig forlængelse trin på 5 min. ved 72 ° C. De amplificerede Reaktionsprodukterne blev analyseret på en 1,2% agarosegel indeholdende ethidiumbromid. CDNA-syntese blev bekræftet ved påvisning af GAPDH-transkript, som blev anvendt som en intern kontrol.

Statistisk analyse

Dataene blev udtrykt som middelværdi ± SD af tre uafhængige forsøg, og statistiske analyse blev udført under anvendelse af Students

t

-test, for at bestemme statistisk signifikans. P-værdier mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant og er angivet med en stjerne.

Resultater

5-HT

1B og 5-HT

1D receptorer er overudtrykt i bugspytkirtelkræft celler

Øget 5-hydroxytryptamin biosyntetiske kapacitet samt alvorlige ændringer i ekspressionsmønstre for de 5-HT-receptorer, er tidligere blevet rapporteret under progression af brystcancer [16]. Her evaluerede vi udtryk for 5-HT

1B og 5-HT

1D receptorer i forskellige PACA celler samt i normale menneske pancreas kanalen epitel (Æske med HDPE) celler. Vi fandt, at disse receptorer er opreguleret i alle testede Paca celler, sammenligne med sin lave ekspression i normale pancreas- epitel (fig. 1A), hvilket antyder, at dys-regulering af disse receptorer kan promoverer signalering favor tumor progression i Paca celler.

(A) 5-HT

1B og 5-HT

1D receptorer er stærkt udtrykt i flere bugspytkirtelkræft cellelinjer. Cellelysater af flere Paca cellelinjer og normale humane pancreas kanalen epiteliale (Æske med HDPE) celler blev underkastet Western blot-analyse som angivet. β-actin blev anvendt som en loading kontrol. (B-C) 5-HT

1B og 5-HT

1D receptorer ekspressionsniveauer i PANC-1 (B) og MiaPaCa-2-celler (C) efter knockdown af receptorerne udtryk med deres tilsvarende siRNA’er. Celler blev transficeret med 50 nM angivne siRNA’er, og 72 timer senere blev cellelysater underkastet Western blot analyse. p-actin blev anvendt som indlæsning kontrol. Histogrammerne viser den relative kvantificering af de angivne proteiner niveauer. (D-E) mRNA-ekspression af 5-HT

1B og 5-HT

1D receptorer i PANC-1 (D) og MiaPaCa-2-celler (E) efter knockdown af receptorerne udtryk med deres tilsvarende siRNA’er. Celler blev transficeret med 50 nM angivne siRNA’er, og 72 timer senere blev det totale RNA ekstraheres og transkriptet niveauer af 5-HT

1B og 5-HT

1D blev bestemt ved standard RT-PCR som beskrevet i Materialer og metoder. GAPDH blev anvendt som indlæsning kontrol. (F-G) siRNA-medieret 5-HT

1B og 5-HT

1D receptorer knockdown inhiberer Paca celleproliferation. PANC-1 (F) og MiaPaCa-2-celler (G) blev transficeret med 50 nM angivet siRNA’er, og efter 72 timer blev proliferation påvises ved en MTS-assay. Data er repræsenteret som middelværdi ± SD. * P 0,05 vs. kontrolceller. Alle forsøg blev uafhængigt udført tre gange.

Knockdown af 5-HT

1B og 5-HT

1D receptorer udtryk hæmmer proliferation /levedygtighed Paca celler

Vi havde til formål at undersøge inddragelsen af ​​disse receptorer i spredning og vækst af Paca celler. Til den ende, vi bankede ned ekspressionen af ​​hver receptor undertype i PANC-1 og MiaPaCa-2-celler under anvendelse af specifikke lille interfererende RNA (siRNA). Trods bliver kodet af to forskellige gener, den humane 5-HT

1B og 5-HT

1D receptorer er især i sekvens [21]. Derfor, som vist i figur 1B og C, 5-HT

1B siRNA behandlinger førte til en relativt lavere ekspression af 5-HT

1D proteinniveau, med en lignende nedre 5-HT

1B proteinniveauer induceret med 5-HT

1D siRNA. Dette kunne tilskrives den omstændighed, at både 5-HT

1B og 5-HT

1D receptorer undertyper deler en høj aminosyresekvensidentitet (~68% aminosyresekvenshomologi), har lignende ligandbindende egenskaber og er næsten ikke skelnes farmakologisk [37]. kunne forekom sådanne ligheder inducerede interaktioner mellem de to receptortyper på proteinniveauet efter genekspression (for eksempel under protein modning eller foldning). Derfor detekteringen af ​​receptorerne proteinekspression ved Western blotting ikke var helt tilstrækkeligt til at skelne disse tæt-relaterede receptorsubtyper at etablere deres respektive fysiologiske relevans. For at overvinde sådanne problemer for at undersøge de biologiske virkninger af målretning hver undertype individuelt anvendte vi RT-PCR-analyse og undersøgt virkningen af ​​siRNA behandlinger på transkriptionsniveauer af det tilsvarende gen subtype. Vores resultater viser klart, at 5-HT

1B specifikke siRNA og 5-HT

1D specifikke siRNA blev bekræftet at inhibere ekspressionen af ​​det tilsvarende mRNA uden nogen signifikant effekt på den anden tværs analoge undertype i både PANC-1 og MiaPaCa-2-cellelinier (fig. 1D og E). Vi analyserede næste proliferation efter 72 timer af siRNA behandling af MTS-assay. Som vist i figur 1F og G, vores resultater viste, at knockdown af 5-HT

1B og 5-HT

1D ekspression inhiberede signifikant proliferation af både PANC-1 og MiaPaCa-2-celler. Den kombinerede nedregulering af både 5-HT

1B og 5-HT

1D undertyper svækker spredning mere end nedregulering af enten alene receptor (figur S1), hvilket tyder på de biologiske fordele fra samtidige målrette begge receptorer.

Målretning 5-HT

1B og 5-HT

1D receptorer hæmmer celle clonogenicity af PACA celler

for yderligere at verificere rolle af 5-HT-1 serotonerge-receptorer i PaCa celleproliferation og kolonidannelse, vi vurderede klonogene kapacitet Paca celler efter knock-down af 5-HT

1B og 5-HT

1D receptorer ekspression. Dette assay er en

in vitro

celleoverlevelse assay baseret på evnen af ​​en enkelt celle til at vokse og dannelse af foci i en koloni [36]. Knockdown af 5-HT

1B og 5-HT

1D receptorer, ved hjælp af deres specifikke siRNA’er, markant hæmmer evnen af ​​PANC-1 og MiaPaCa-2-celler til at danne kolonier (fig. 2A og B, henholdsvis). Samlet set har disse fund tyder på, at 5-HT

1B- og 5-HT

1D-medieret signalering er involveret i proliferation og klonogen evne Paca celler.

PANC-1 (A) og MiaPaCa-2-celler (B) blev transficeret (en gang /uge) med angivne siRNA’er. Cellerne blev inkuberet i 14 dage blev kolonierne farvet med krystalviolet, og kolonierne-Områdefordeling regioner blev målt densitometrisk ved afslutningen af ​​de 14 dage. Histogrammerne viser de procentdele af de dannede kolonier, efter 14 dage fra den første transfektion. Dataene er udtrykt som gennemsnit af procentdele af kolonidannelse ± SD af tre uafhængige forsøg. * P. 0,05 vs. kontrol celler

Målretning 5-HT

1B og 5-HT

1D receptorer svækker celle invasion /migration af PACA celler

bugspytkirtlen duktalt adenokarcinom er karakteriseret ved stærkt invasiv fænotype og stærk metastatisk kapacitet [38]. Fordi ekspressionen af ​​5-HT

1B og 5-HT

1D receptorer er forhøjet i Paca celler vurderede vi, om disse receptorer er involveret i at fremme en sådan invasiv fænotype. Derfor har vi slået ned disse receptorer i PANC-1 og MiaPaCa-2 celler ved siRNA’er og evalueret de ændringer i deres invasive kapacitet ved

in vitro

invasion under anvendelse Matrigelcoatede Boyden kamre. Denne assay efterligner den

in vivo

invasion proces og måler antallet af kræftceller, der passerer gennem en basalmembran matrix mod medier, der indeholder kemo-lokkemidler [39]. Det mest slående resultat var, at knockdown af 5-HT

1B og 5-HT

1D receptorer signifikant reduceret invasionen af ​​PANC-1-celler med omkring 76% og 66%, (fig. 3A), og reduceret invasionen af ​​MiaPaCa-2-celler med omkring 75% og 71%, (fig. 3B). Vi undersøgte dernæst involveringen af ​​5-HT

1B og 5-HT

1D receptorer i mediering PANC-1 cellemotilitet hjælp af scratch assay ved 12 timer og 24 timer tidspunkter. Analysen afslørede, at den distance, der migrerende celler blev signifikant nedsat, når cellerne transficeret med 5-HT

1B eller 5-HT

1D receptorer siRNAs sammenlignet med celler udsat for den ikke-silencing kontrol siRNA (Fig. 3C ). Disse resultater viser en korrelation mellem PaCa celle motile adfærd og 5-HT

1B /1D-ekspression. Samlet set disse data indikerer, at 5-HT

1B og 5-HT

1D receptorer spiller en rolle ved mediering PaCa celler migration og invasion.

Panc-1-celler (A) og MiaPaCa-2 celler (B) blev transficeret med 50 nM angivne siRNA’er (for 72 timer), og et lige stort antal levedygtige celler podedes på Matrigelcoatede Transwell filtre i Matrigel invasion kamre. Antallet af de celler, der invaderede efter 24 timer blev bestemt som i protokollen. Forstørrelse, 100 ×. Histogrammerne viser middelværdien af ​​procentdele af invasion ± SD af tre eksperimenter. * P 0,05 vs. kontrolceller. (C) Inddragelsen af ​​5-HT

1B og 5-HT

1D receptorer i reguleringen af ​​PANC-1 cellemotiliteten som analyseret ved den sårhelende assay. En enkelt ridse blev foretaget i midten af ​​sammenflydende cellemonolag, og de sårede monolag blev transficeret med angivne siRNA’er. Sårene reparation blev overvåget i 24 timer og visualiseret mikroskopisk med oprindelig forstørrelse x 100. Billeder blev taget straks (0 h), og efter 12 timer og 24 timer for at ridse kulturerne. Histogrammet viser procentdele af migration celler, og dataene er udtrykt som gennemsnit af de procentdele af migration ± SD af tre uafhængige forsøg. * Repræsenterer signifikant forskel mellem angivne grupper (P 0,05).

5-HT

1B og 5-HT

1D receptorer er involveret i reguleringen af ​​β1 integrin udtryk i PACA Cells

Efter at have konstateret, at 5-HT

1B og 5-HT

1D receptorer over-udtrykkes i Paca celler, der tyder på væsentlige ændringer i vækstfremmende nedstrøms signalering, vi næste undersøgt nogle nedstrøms molekylære effekter af knockdown af disse receptorer. Integrinfamilien af ​​trans-membranreceptorer forbinder den ekstracellulære matrix (ECM) til intracellulære actincytoskelettet ved fokale adhæsioner interaktionspunkter. Ud over denne strukturel rolle, kan integrin clustering initiere intracellulære signalering begivenheder der fremmer celleproliferation, overlevelse og migration i både normale og tumorigene celler sammenhænge [40]. Fra integrin familie, er β1-subtype kendt for at inducere Src og FAK aktivitet gennem rekruttering og aktivering af Src /FAK dual kinase kompleks [41]. Fordi, nedregulering af 5-HT

1B /1D-receptorer undertrykker PACA celler migration /invasion (fig. 3), vi undersøgte, om disse receptorer regulerer ekspressionen af ​​β1 integrin. Vi anvendte Western blot og RT-PCR-analyse for at bestemme ekspressionen af ​​β1 integrin-protein og mRNA-niveauer henholdsvis efter silencing disse receptorer. Vi fandt, at 5-HT

1B og 5-HT

1D receptorer knockdown signifikant inducerer nedregulering af β1 integrin ekspression på både protein og mRNA-niveau i begge PANC-1 og MiaPaCa-2-celler (fig. 4A og B).

(A-B) effekten af ​​siRNA’er-medieret 5-HT

1B og 5-HT

1D receptorer nedregulering på β1 integrin /ECM-medieret nedstrøms signalering i PANC -1 (A) og MiaPaCa-2-celler (B). (Øverste panel) Celler blev transficeret med 50 nM angivne siRNA’er, og efter 72 timer blev total RNA ekstraheres og Udskriften niveauer af 5-HT

1B og 5-HT

1D blev bestemt ved standard RT PCR som beskrevet i Materialer og Metoder. GAPDH blev anvendt som indlæsning kontrol. (Nedre panel) Celler blev transficeret med 50 nM angivet siRNA’er, og efter 72 timer blev cellelysater underkastet Western blot analyse. p-actin blev anvendt som indlæsning kontrol. (C-D) Virkningen af ​​5-HT

1B og 5-HT

1D receptorer nedregulering om EMT-processen i PANC-1 (C) og MiaPaCa-2-celler (D). Inaktivering af 5-HT

1B og 5-HT

1D receptorer øge ekspressionen af ​​EMT tight junction-protein, claudin-1, og mindske zinkfinger ZEB1 transkriptionelle faktorer, TCF8 og sneglen. p-actin blev anvendt som indlæsning kontrol. Tubulin blev anvendt som indlæsning kontrol.