PLoS ONE: Epiteliale til Mesenchymale Transition af TGF-1 Induktion Øger Stemness Karakteristika i Primær ikke-småcellet lungekræft cellelinje

Abstrakt

Baggrund

Kræft stamceller (CSCS) hypotese hævder, at kun en lille delmængde af celler i en tumor er i stand til både tumor initiering og opretholdelse. Epitel-Mesenchymale Transition (EMT) er et embryonisk udviklingsmæssige program, der ofte aktiveret under cancer invasion og metastase. Formålet med denne undersøgelse er at belyse forholdet mellem EMT og CSCS ved hjælp LC31 lungekræft primær cellelinje.

Materialer og metoder

A549 og LC31 cellelinjer blev behandlet med 2 ng /ml TGFp-1 i 30 dage, og 80 dage henholdsvis. Til bedømmelse EMT blev morfologiske ændringer vurderet ved lysmikroskopi, immunofluorescens og cytometri for følgende markører: cytokeratiner, e-cadherin, CD326 (epiteliale markører) og CD90, og vimentin (mesenchymal markører). Desuden RT-PCR for Slug, Twist og P-catenin gener blev udført. På TGFP-1 behandlede og ubehandlede LC31 cellelinjer, vi udførte stemness tests såsom pneumospheres vækst og dæmme markører udtryk såsom Oct4, Nanog, Sox2, c-kit og CD133. Western Blot for CD133 og tumorigenisitetsforsøg assays under anvendelse NOD /SCID-mus blev udført.

Resultater

TGFp-1 behandlede LC31 cellelinie mistet sin epitelial morfologi under forudsætning af en fibroblast-lignende udseende. De samme resultater blev opnået for A549-cellelinien (som kontrol). Immunofluorescens og cytometri viste opregulering af vimentin og CD90 og nedregulering af cytocheratin, e-cadherin og CD326 i TGFp-1-behandlede LC31 og A549-cellelinier. Slug, Twist og β-catenin m-RNA-transkripter var opreguleret i TGFp-1 behandlede LC31 cellelinje bekræfter EMT. Denne cellelinie viste også overekspression af Oct4, Nanog, Sox2 og CD133, alle generne af stemness. Derudover i TGFp-1 behandlede LC31 cellelinje, en forøget pneumosphere-dannende evne og tumorer-dannende evne i NOD /SCID-mus kunne påvises.

Konklusioner

Induktionen af ​​EMT af TGFp -1 eksponering, i primær lunge cancer cellelinje resulterer i erhvervelse af mesenkymale profil og i udtrykket af stamceller markører

Henvisning:. Pirozzi G, Tirino V, Camerlingo R, Franco R, La Rocca A, Liguori E, et al. (2011) Epithelial til Mesenchymale Transition af TGFp-1 Induktion Øger Stemness Karakteristika i Primær ikke småcellet lungekræft Cell Line. PLoS ONE 6 (6): e21548. doi: 10,1371 /journal.pone.0021548

Redaktør: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, USA

Modtaget: April 5, 2011; Accepteret: 1 Juni 2011; Udgivet: 30 Jun 2011

Copyright: © 2011 Pirozzi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Aktuel forskning 2009/10 i den italienske sundhedsministerium til G. Pirozzi og G. Rocco. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

To vigtige hypotese er blevet postuleret i tilblivelsen, dannelse, vækst og metastase af epitelial kræft: rolle cancer stamceller (CSCS) eller Tumor Iværksættelse Cells (tics) og inddragelse af den såkaldte epithelial -Mesenchymal Transition (EMT).

Kræft stamceller er blevet defineret som “en celle i en tumor, der har kapacitet til selv at forny og til at forårsage de heterogene slægter af kræftceller, der omfatter tumor” [1 ]. Disse to definitive biologiske egenskaber er det, der gør CSCS den oplagt kandidat til initiering af tilbagefald.

CSCS hypotese hævder, at kun en lille delmængde af celler i en tumor er i stand til både tumor initiering og opretholdelse [2], [ ,,,0],3]. Disse celler udtrykker stemness markører, er i stand til at danne flydende kugler i serumfrit medium, en egenskab der er forbundet med stamceller, og er også i stand til at differentiere i en aberrerende celle fænotype udgør tumor heterogenitet [4]. Eksperimentelt er denne population identificeres ved dets evne til at danne nye tumorer gennem serielle transplantationer i immundefekte ikke-overvægtige diabetiske (NOD) /alvorlige kombinerede immundefekte (SCID) mus, genindførelse tumor heterogenitet [5].

Der er to grundlæggende emner, der understreger den hypotese, at CSCS stammer fra normale væv stamceller. Først og fremmest de CSCS har normale stamceller egenskaber såsom selvfornyelse, differentiering, lægemiddelresistens og migration kapacitet. Derefter levetiden af ​​stamceller gør dem modtagelige for at akkumulere genetiske og epigenetiske skader for at gøre dem gode kandidater til fremkomsten af ​​neoplastisk transformation [6], [7]. De CSCS er de eneste celler, der er i stand til at frembringe tumorer ligner det oprindelige patientprøver når transplanteret til immunkompromitterede mus, såsom NOD /SCID-mus [8].

Eksisterende terapier har forbedret længden af ​​overlevelse efter diagnose af kræft, men helt mislykkedes i form af helbredelse. Kræft terapi fejl kan skyldes ineffektive virkningerne af en nuværende terapi upon potentielt hvilende CSCS, som fortsat vital og fastholde evnen til at regenerere [9] tumor. I de fleste tilfælde er de nuværende terapeutiske strategier udviklet til at målrette hovedparten af ​​cancer og sandsynligvis ikke udrydde CSCS fuldstændigt. CSCS er mere modstandsdygtige over for behandlinger, på grund af overlevelse fordel med øget anti-apoptotiske aktiviteter og resistens som følge af øgede niveauer af narkotika effluxpumper såsom BCRP (brystkræft modstand protein) og MDR (multiresistens) komplekser [10], [11].

CSCS er blevet identificeret i en række forskellige faste tumorer, herunder glioblastomer [12], bryst [13], og lungecancer [14], [15]. Der er tre forskellige vigtigste metoder til at isolere CSCS fra solide tumorer: i) isolering af CSCS ved flowcytometri ifølge CSC-specifikke celleoverflademarkører såsom CD44 eller CD133; ii) påvisning af siden befolkning fænotype af Hoechst33342 udstødelse iii) kuglen formation under dyrkning med defineret serum-frit medium med vækstfaktorer, der opretholder CSCS udifferentierede.

epitel-Mesenchymale Transition (EMT) er et embryonisk nøgle udviklingsmæssige program, der ofte aktiveret under cancer invasion og metastase [16], [17]. Det er en proces, hvorved celler undergår en morfologisk skift fra epitel polariseret fænotype til mesenchymale fibroblastoid fænotype. Som et resultat af EMT, epitelceller miste deres definerede celle-celle /celle-Undergrunden kontakter og deres strukturelle /funktionelle polaritet, og de bliver spindel formet og morfologisk ligner aktiverede fibroblaster [18]. På molekylært niveau er EMT defineret ved tab af celle-celle adhæsionsmolekyler (fx E-cadherin og ZO-1), nedregulering af epiteliale differentieringsmarkører herunder cytokeratiner og E-cadherin og transkriptionel induktion af mesenchymale markører, såsom vimentin, fibronectin og N-cadherin med en kernelokalisering af beta-catenin [19]. Nuklear beta-catenin inducerer en genekspression mønster begunstige tumor invasion, og montering beviser indikerer flere gensidige interaktioner af E-cadherin og beta-catenin med EMT-inducerende transkriptionelle repressorer til at stabilisere en invasiv mesenkymale fænotype af epiteliale tumorceller [20], [21 ]. Andre gener involveret i EMT er Snail, Twist e SIP-1 /ZEB-2, alle repressorer af gen CDH1, der koder for E-cadherin [16]. Adskillige distinkte træk er blevet transporteret af EMT, herunder cellemotilitet, invasivitet, modstandsdygtighed over for apoptose, og nogle egenskaber af stamceller. Mange signalveje har bidraget til induktion af EMT, herunder transformerende vækstfaktor-beta (TGFp-1), Wnt, Hedgehog, Notch, og nuklear faktor-kappa B (NFkB) [22]. Kyoung-Ok Hong et al. [23] har vist, at aktivering af PI3K /Akt aksen er en af ​​de vigtigste mekanismer i færd med EMT og det lader til, at dets inhibering ved behandling med phosphatidylinositol etherlipid analoger (PIA) kan regulere den omvendte proces Mesenchymale epithelial reverse Transition (mert ), der fører til re-ekspressionen af ​​både E-cadherin og β-catenin, og reducere udtryk for vimentin, mesenkymale markør, i mundtlig skællede linjer karcinom stabiliseret. Under processen med tumormetastase, som ofte aktiveret af ambulancereddere, ville disseminerede cancerceller synes at kræve selvfornyelse kapacitet, svarende til den, der udvises af stamceller, for at sprede makroskopiske metastaser [24]. Dette rejser muligheden for, at EMT proces, som muliggør celle formidling kræft, også kan bibringe en selvfornyelse evne til at formidle cancerceller. Faktisk den metastatiske proces er mindst overfladisk lighed med de processer, der forekommer under vævsreparation og regenerering og muliggør voksne stamceller for at afslutte væv reservoirer såsom knoglemarven, indtaste og overleve i kredsløbet, og komme ind sekundære vævssteder, hvor de formere sig, differentiere, og deltage i væv genopbygning [25]. Tilsammen udgør disse forskellige linjer af beviser tyder på en mulig forbindelse mellem kræft stamceller og de mesenkymale forekommende celler genereret af EMTs og den omvendte proces betegnes Mesenchymale Epithelial omvendt Transition (Mert). Mani ET kolleger [26] var den første til at påvise en sådan korrelation i immortaliserede humane mammae epitelceller (HMLEs).

I den forbindelse er det vigtigt at identificere hvilke faktorer kan inducere EMT og hvordan EMT-celler kunne blive en ressource for cancer stamceller-lignende celler, udvikle nye og målrettede behandlinger for lungekræft. Derfor er formålet med denne undersøgelse er at belyse den mulige sammenhæng mellem EMT og CSCS ved hjælp LC31 primær cellelinje opnået fra vævsprøve efter operationen i patient ramt af ikke-småcellet lungekræft (NSCLC).

Resultater

TGFp-1 behandling inducerer morfologiske ændringer i NSCLC cellelinjer

for at undersøge effekten af ​​TGFp-1 på LC31 og A549-cellelinjer, vi behandlede dem med 2 ng /ml TGFp-1. Som allerede også demonstreret af Ju Hee Kim [27], A549-celler behandlet med TGFp-1 mistet deres epithelmorfologi observerbar efter 48 timers behandling; de blev dispergeret og antog en fibroblast-lignende udseende med længtes form og centrale kerne.

LC31 celler behandlet med TGFp-1 mistede deres epitelial morfologi og erhvervede mesenchymal træk startende fra 21 dages behandling. Cellerne blev længtes, fibroblastlignende med central kerne og begyndte at vokse som bundter. Denne morfologi blev opretholdt i hele tiden for behandling (Fig 1A-D.)

A:. Ubehandlet A549, OM 200 ×; B: behandlet A549, på 2 dage TGFp-1 behandling, OM 400 ×; C: ubehandlet LC31, OM 400 ×; D: behandlet LC31, 30 dage TGFp-1 behandling, OM 400 ×; E: vækstkurver ubehandlede og behandlede A549; F:. Vækstkurver ubehandlet og behandlet LC31

TGFp-1 behandling inducerer væksthæmning i NSCLC cellelinjer

I alle testede, TGFp-1-induceret væksthæmning cellelinjer. I A549, analyser vækstkurver viste en stærk vækst hæmning under dyrkning tid med DT 28 h for behandlet A549 i forhold til DT 18 h af den tilsvarende ubehandlet cellelinje. I LC31 celler, DT var 72 timer for behandlede celler, mens DT var 36 timer for ubehandlede celler (Fig. 1 E-F).

TGFp-1 behandling fremmer et skift fra epitelial til mesenkymale fænotype

Den morfologiske effekt af TGFp-1 på A549 og LC31 cellelinjer foreslog, at TGFp-1 fremmet en EMT. De morfologiske ændringer er karakteristiske for celler, som undergår EMT er ledsaget af en ændring i ekspression fra en epitelial til en mesenchymal repertoire. For at bestemme, om TGFp-1-induceret sådan skift, vi brugte cytometri, immunofluorescens og RT-PCR til at undersøge udtryk og distribution af CD90, CD326, vimentin, e-cadherin og cytockeratins markører og β-catenin, Slug og Twist gener.

Ifølge cytometrisk analyse, i ubehandlede cellelinjer, CD90 blev svagt udtrykt på A549 (gennemsnitlig procentdel 10%) og LC31 (gennemsnitlig procent 4%). CD326 og cytokeratiner ekspressionsniveauer var lav både i A549 (gennemsnitlig procentdel på 10% og 1,1%), og LC31 (gennemsnitlig procentdel 1% og 18,6% henholdsvis). Vimentin var svagt positiv i A549 (gennemsnitlig procentdel 22%) og LC31 (gennemsnitlig procentdel 17%). Efter TGFp-1 behandling, CD90 (gennemsnitlig procent 93%) og vimentin (gennemsnitlig procent 91%) niveauerne øges, hvorimod CD326 og cytokeratiner faldt i A549 og LC31 (Fig 2A, B.)

A:. Cytometrisk analyse for CD90, CD326, vimentin og Cytokeratin i ubehandlet (line rød) og TGFp-1 behandlet [line grøn] i A549-cellelinje efter 20 dages behandling; B: cytometrisk analyse for CD90, CD326, vimentin og Cytokeratin i ubehandlet [linje red] og TGFp-1 behandlede (line grøn) i LC31 cellelinje efter 30 dages behandling. Isotypekontroller er i sort.

I immunofluorescensbestemmelse, i de ubehandlede cellelinjer blev vimentin udtrykkes både i A549 og LC31, men det var indeholdt i perinukleære vescicles. Cytokeratiner og E-cadherin blev svagt udtrykt i begge cellelinier. Efter TGFp-1 behandling, at vimentin var stærkt og jævnt fordelt i alle A549 og LC31 celler, mens cytokeratiner og E-cadherin svagt forblev udtrykt og lokaliseret i perinukleære områder af celler, indtil skal ophæves efter 30 dage for A549 og 40 dage for LC31 (figur 3 A-L.)

Immunofluorescens for vimentin (A), cytokeratin (B) og e-cadherin (C) på ubehandlet A549 cellelinie.; vimentin (D), cytokeratin (E) og e-cadherin (F) på behandlet i A549-cellelinje efter 20 dage af TGFp-1 behandling; vimentin (G), cytokeratin (H) og e-cadherin (I) på ubehandlet LC31-cellelinje; vimentin (J), cytokeratin (K) og e-cadherin (L) på behandlet i LC31 cellelinje efter 30 dages TGF-1 behandling. Alle immunofluorescens billeder har OM 200 ×; M: RT-PCR-analyse og densitometri evaluering for Slug, Twist og β-catenin på ubehandlede og TGFp-1 behandlet på LC31-cellelinje efter 0, 20, 50 og 80 dages behandling. *, P 0001, **, p. 0,0001 i forhold til forældrenes cellelinie (0 behandlingsdag)

RT-PCR-data viste, at der var massive skift af genekspression fra et mønster karakteristisk for epitelceller til det i mesenchymceller i LC31 cellelinje med en betydelig stigning i ekspressionen af ​​EMT-inducerende transkriptionsfaktorer, specielt beta-catenin (~1,5 gange), Twist (~1,5 gange), og Slug (~2,7 fold), der angiver deres EMT fænotype. Opregulering af disse gener er nævnt ovenfor var TGFp-1 afhængig tid undtagen for beta-catenin, for hvilke der var en stigning på 20 og 80 dages behandling i forhold til ubehandlet cellelinje og en svag nedgang på 50 dage respekterer 20 og 80 dage behandling, men altid øget hensyn til ubehandlet cellelinje (fig. 3M).

Gen-ekspression profilering af stemness markører i EMT-LC31 cellelinje

for at undersøge generne regulering og vedligeholdelse af stamcelle-fænotype af LC31 celler med EMT signaturer (betegnet EMT-LC31 cellelinie), udførte vi RT-PCR for OCT4, Nanog og Sox2. Interessant, transskription faktorer OCT4, Nanog, Sox2, kendt for at være tilstrækkeligt til at omprogrammere mus eller humane somatiske celler til udifferentierede, pluripotente stamceller, viste sig at være steget betydeligt i EMT-LC31 cellelinje med en stigning på 3,5 gange, 3 , 0 gange, og 1,4 gange for OCT4, Nanog og Sox-2, henholdsvis mere end forældrenes cellelinje med angivelse af deres stemness fænotype (. figur 4A)

A:. RT-PCR og densitometri evaluering for Oct4 , Sox2 og NANOG gener på LC31 og EMT-LC31 cellelinier efter 0, 20, 50 og 80 dages behandling; B: RT-PCR og densitometri evaluering for CD133 og c-kit-gener på LC31 og EMT-LC31 cellelinier efter 0, 20, 50 og 80 dages behandling; C: Western blot for CD133 LC31 og EMT-LC31-cellelinier efter 0, 20, 50 og 80 dages behandling. *, P 0001, **, s 0,0001 i forhold til LC31-cellelinje (0 behandlingsdag). α-tubulin bruges som lastning kontrol.

CD133 og c-kit markører blev forøget i EMT-LC31 cellelinje

For yderligere at bestemme, om celler med EMT fænotype kunne vise kræft stamceller ligesom celle egenskaber, vi evaluerer udtryk for CD133, vigtigste markør identificere cancer stamceller i NSCLC [14], [15] og c-kit [28], mesenkymale stamceller markør.

cytometri analyser viste, at i LC31 parentale cellelinje, procentdelen af ​​CD133 var 3% af den samlede cellepopulation. Efter TGFp-1 behandling, viste resultaterne, at nogen forskelle i CD133 ekspressionsniveauer mellem parentale og EMT-celler kunne påvises (data ikke vist). Dette resultat er forskelligt i forhold til dem, der opnås ved RT-PCR og western blotting for CD133. Både RT-PCR og western blotting viste en stigning på CD133 (~2,3 fold for RT-PCR) efter forskellige tidspunkter af TGFp-1 behandling. Vedrørende c-Kit-genet, sidstnævnte resulterede opreguleret i EMT-LC31-celler med en stigning på ~2,3 gange mere end parentale cellelinje (fig. 4B, C).

Pneumospheres dannelse evne blev forøget i EMT-LC31 cellelinje

Liu et al. [29] og andre [30] har vist, at evnen til at danne mammospheres

in vitro

afhænger af tilstedeværelsen af ​​selvfornyende. Vi testede pneumophere-dannende evne EMT-LC31 celler sammenlignet med forældrenes cellelinie.

Betydeligt, efter vi inducerede en EMT i LC31 celler ved at udsætte dem for TGF-β1, fandt vi, at EMT-LC31 celler viste signifikant øget evne til at danne pneumopheres forhold til forældrenes cellelinie danner mindst 40 gange flere pneumospheres end forældrenes celler. Forholdet mellem pneumospheres størrelse og deres vækst var signifikant større end for ubehandlede celler. Endvidere EMT pneumospheres var mere end 50 um i diameter efter 5 dage, mens parentale pneumospheres var 20 um (fig. 5A, B). Desuden var alle EMT pneumospheres positive for CD133 (fig. 5C). Baseret på denne funktionelle analyse, konkluderede vi, at cellerne genereret af en EMT erhvervet endnu en egenskab ved lungekræft stamceller

A:. LC31 pneumospheres; EMT-LC31 pneumospheres; C:. CD133 ekspressionen på EMT-LC31 pneumospheres

Colony effektivitet analyser

En af metoderne til at analysere tumorigent potentiale er den blød agar forsøg, der måler forankringsuafhængig vækst, som er en indikator for celletransformation. Som beskrevet i tabel 1, vurdering af vækstkinetik afslørede stor koloni effektivitet EMT-LC31 cellelinie sammenlignet med parentale cellelinje med 18 og 3 gange stigning i 1000 og 10.000, henholdsvis af podede EMT celler respekt til parentale cellelinje (fig. 6A-C)

A:. fotografier af kolonier fra LC31 cellelinje og [B] EMT-LC31-cellelinje; C:. Kolonien nummer blev talt, og data blev præsenteret som CFU (%) i forhold til celle nummer seedet

EMT-LC31 genererer tumorer større end tilsvarende parental cellelinie

i vores tidligere undersøgelser [15], viste vi, at tumorerne fra LC31-celler dyrket som pneumopsheres voksede meget hurtigere sammenlignet med fra tilsvarende celler dyrket i adhærerende kultur tilstand. For at teste, om TGFp-1 behandling lykkedes ændring af tumorfremkaldende frekvens af transformerede celler, injicerede vi EMT-LC31-celler og tilsvarende cellelinje i immundefekte værter. Som rapporteret i tabel S1, fandt vi, at mængden af ​​tumor induceret af EMT-LC31-celler var signifikant større end parentale celler (fig. S1). Disse resultater tyder på, at cellerne med EMT signatur forfremmet tumorgenicitet

in vivo

.

Diskussion

Epithelial til mesenkymale overgang (EMT) er en grundlæggende fysiologisk proces, hvorved epitelceller mister deres polaritet og gennemgår en overgang til en mesenkymale fænotype. Kendetegnende for EMT omfatte tab af celle-celle adhæsion, re-organisering af cytoskeletale actin og erhvervelse af øgede vandrende egenskaber [31], [32].

EMT er en afgørende begivenhed i tumor progression og flere undersøgelser tilstand at EMT aktiveres i mange cancertyper [33] – [35]. Trods nylige fremskridt, er der behov for yderligere undersøgelser for at klarlægge rolle EMT i invasionen og metastase af tumorer. Under processen med tumormetastase, cancerceller, der metastaserer, erhverve færdigheder selvfornyelse, svarende til den, der udvises af stamceller for at sprede metastaserne [24].

Tilsammen tyder på en mulig disse beviser sammenhæng mellem kræft stamceller og de mesenkymale forekommende celler genereret af ambulancereddere.

i denne sammenhæng Formålet med denne undersøgelse er at vise, at erhvervelsen EMT er forbundet med en stigning i stemness underskrifter i en primær cellelinje opnået i vores laboratorium. A549 lungekræft er en velkarakteriseret cellelinje, der er blevet anvendt som et modelsystem til at undersøge mekanismerne for carcinogenese, apoptose og cancer progression i lungecancer [36], [37]. Fordi EMT spiller en central rolle i tumoren progression, vi valgte A549 cellelinje som modelsystem for EMT. Vi fokuserede vores opmærksomhed på LC31 cellelinje opnået i vores laboratorium og undersøge effekten af ​​TGFp-1 på EMT og stemness mekanisme på denne linje. Efter aftale med tidligere rapporter [38], [39], viste vi, at TGFp-1 inducerer EMT i A549 celler ved erhvervelse af mesenkymale morfologi, forøget ekspression af mesenkymale markører såsom vimentin og CD90 og nedsat udtryk for epitelial markører såsom cytokeratiner og CD326. Når defineret, at vores EMT undersøgelse model er anvendelig, testede vi virkningen af ​​TGFp-1 på LC31 cellelinie. Vi behandlede LC31 cellelinie med TGFp-1 2 ng /ml i 80 dage. Først efter ca. 20 dage, vi observerer morfologiske ændringer, der er i overensstemmelse med købet af EMT fænotype som er karakteriseret ved tab af ekspressionen af ​​epitel markører såsom cytokeratiner, e-cadherin og CD326 og gevinsten eller forøget ekspression af mesenkymale markører såsom vimentin udskiftning cytokeratiner. Efter 20 dages behandling, blev LC31 celler langstrakt, central kerne med fibroblast lignende form og øget stress fiber reorganisering.

EMT tager 48 timer i A549, fordi det har stærkere mesenkymale markører udtryk end LC31 behøver 20 dage til at gennemgå EMT .

Derfor LC31 celle linie viser flere funktioner, som er typiske for EMT: reduktion i celle-celle adhæsion, udfladning og spredning, udtryk for mesenchymale markører. Slug, Twist og β-catenin, vigtigste transkriptionelle faktorer involveret i EMT, er opreguleret i cellerne behandlet, og disse faktorer øger med stigende TGFp-1 behandling tid, bekræfter deres EMT fænotype.

Disse resultater åbne måde at kontrollere, om LC31 primær lungecancer-cellelinie, følsomme for TGFp-1 behandling, kunne øge stamcelle egenskaber. Interessant, EMT-LC31 celler også vise stilk-lignende-fænotype karakteriseret ved øget pneumosphere-dannende kapacitet i forhold til forældrenes LC31 cellelinje med EMT pneumospheres større end forældrenes pneumopheres. Desuden EMT pneumospheres var positive for CD133 markør styrke stemness signatur. Vigtigst er det velkendt, at co-ekspression af Sox-2, Nanog og Oct4 i humane eller muse somatiske celler kan omprogrammere disse celler til pluripotente embryonale stamceller-lignende celler [40], [41]. I vores undersøgelse fandt vi, at udtrykkene for Sox-2, Nanog og Oct4 blev dramatisk opreguleret i EMT-LC31 cellelinie sammenlignet med parentale cellelinje. Tilsammen disse data, LC31 cellelinje med EMT signatur viste en stigning på stamceller-lignende cellekarakteristika associeret med over-ekspression af Sox-2, Nanog og Oct4.

Nylige undersøgelser har vist, at c-kit og dens ligand udtrykkes i lungekræft. Immunologiske undersøgelser af c-kit-ekspression viste, at proteinet aberrant kun udtrykkes i lungecancerceller og ikke i pneumocytter eller normale bronchiale epitelceller [42]. Desuden Levina et al. [43], [44] har vist, at behandling af lunge tumorceller med doxorubicin, cisplatin eller etoposid resulterede i udvælgelsen af ​​lægemiddel overlevende celler, der udtrykker CD133, CD117, SSEA-3, TRA1-81, Oct-4, og nuklear beta-catenin med lav ekspression af differentieringsmarkører cytokeratiner 8/18. I vores undersøgelse, viser vi, at TGFp-1 inducerer også en stigning af c-kit m-RNA udtryk, en anden stemness markør, styrke den hypotese, at LC31-cellelinje med EMT signatur viste en stigning på stilk fænotype. Et andet interessant resultat er opreguleringen af ​​CD133 i EMT-LC31-cellelinie, vigtigste markør for CSCS identifikation i lungekræft som rapporteret af Eramo et al. [14] og Tirino et al. [15]. I vores undersøgelse observerede vi en stigning på CD133 både i RT-PCR og Western blot, men ikke i cytometri og immunofluorescens på adhærerende celler. Der er mange værker, hvor tvivl om begrænsninger i brugen af ​​antistof diskuteres [45]. Antistofferne mere almindeligt anvendte genkende AC133 og AC141 stærkt glycosylerede epitoper [46]. Derfor er deres anvendelse indebærer risiko for undervurderede ikke glycosylerede former af antigenet. Desuden har flere CD133 mRNA splejsning blevet identificeret, hvilket igen vil føre til protein produkter ikke genkendelige ved hjælp af fælles antistoffer; Endelig iboende begrænsninger af immunofluorescens og cytometri metodologier, hvilket indebærer antistof følsomhed, epitop beskadigelse på grund af rutinemæssig fiksering /procedurer inklusion, antigen-genvinding, skal der træffes enzymatiske trin af cellepræparation hensyn [47]. I denne forbindelse kan vi også hypotesen, at TGFp-1-behandling giver anledning til konformationel ændring af CD133-epitoper og dets antistof er ikke i stand til at genkende molekylet i cytometri og immunofluorescens procedurer. I pneumospheres, sandsynligvis, tredimensional struktur tillader eksponering af epitoper genkendt af fælles antistoffer. Desuden er de ikke omfattet af enzymatiske trin, som kan beskadige cellestruktur.

Selv om denne betragtning, RT-PCR og Western blot bekræfter det samme at stemness funktion i EMT-LC31 cellelinje efter behandling af TGFp-1 med opregulering både CD133 m-RNA og CD133 protein.

Endelig, for at vurdere TGFp-1 effekt på tumorigent potentiale, vi udførte både blød agar assay og tumorgenicitet

in vivo

. TGFp-1 i overensstemmelse med cancer stamceller koncept, inducerer en forøgelse af kolonier dannelse i blød agar eksperimenter og volumenet af tumorer var signifikant større end for ubehandlede LC31 cellelinje bekræfter, at EMT fænotype ikke kun fremmes stemness fænotype, men også tumorigeniciteten . Afslutningsvis cellerne med EMT fænotype fremmes tumorigenicitet.

Derfor er den høje sandsynlighed for, at EMT genererer celler med mange af de egenskaber af selvfornyende stamceller er verificeret af forøget ekspression af Nanog, Oct4 og Sox2, determinant selvfornyelse faktorer og CD133 og c-Kit, vigtigste stemness markører for CSCS i lungekræft.

som konklusion, rapporterer vi, at induktion af EMT af TGFp-1 behandling i en primær lunge kræft celle line resultater i køb af mesenkymale profil og i opregulering af ekspressionen af ​​stamceller markører.

Denne undersøgelse sætter fokus på muligheden for at tage fat på en ny farmakologisk tilgang versus EMT-fænotype celler eller cancer stamceller-lignende celler til forebyggelse tumor progression og metastase formation.

Materialer og metoder

Etik Statement

de eksperimentelle protokoller er blevet vurderet og godkendt af den etiske komité om dyrs brug af Biogem. Den eksperimentelle projekt har godkendelse ID 10.08 og er blevet meddelt i maj 26

th, 2008 til den italienske sundhedsminister, efter de nationale love om beskyttelse af dyrs velfærd. Patienten, indskrevet i denne undersøgelse, havde underskrevet informeret samtykke, der er godkendt af vores interne komitésystem (National Cancer Institute, Napoli).

Cell Culture

A549-cellelinje blev købt fra ATCC Cell Bank og blev dyrket i RPMI1640 (Lonza, Milano, Italien) ved 10% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C, 5% CO

2. LC31 cellelinje er blevet opnået i vores laboratorium af en patient ramt af lunge skællede adenokarcinom med skriftligt informeret samtykke, der er godkendt af vores interne komitésystem (National Cancer Institute, Napoli) og blev dyrket i IMDM (Lonza) på 10% FBS [14] . Til forsøg blev celler dyrket til 90% sammenflydning.

TGFp-1 behandling og vækstkurver

For at fremkalde EMT proces blev A549 og LC31 cellelinjer behandlet med 2 ng /ml TGFp -1 (ABCAM, Milano, Italien) i 30 og 80 dage. TGFp-1 er blevet tilsat to gange om ugen i mediet. For at teste den mulige vækstinhibering på grund af TGFp-1 behandling blev 10.000 celler udpladet i 24well plader for hver cellelinje og TGFp-1 ubehandlede og behandlede celler blev frigjort hver 24. time i 10 dage. Antallet af celler for hver eksperimentel betingelse blev talt og repræsenteret på en lineær graf. Fordoblingen tid (DT) blev bestemt ud fra vækstkurverne ved hjælp af formlen: hvor t og t

0 var de tidspunkter, hvor cellerne blev talt, og N og N

0 var celle numre til tider t og t

0, hhv.

Pneumospheres assay

for at evaluere effekten af ​​TGFp-1 på pneumospheres vækst og dannelse blev LC31-cellelinie udpladet ved en densitet på 60.000 brønd i seks-brønds fastgørelsesplader ultralave (Corning Inc., Corning, NY, USA) i BEBM cellemedium, suppleret med BEGM [færdigpakkede SingleQuots indeholdende retinsyre, ekstrakt fra bovin hypofyse, insulin, hydrocortison, transferrin triiodotyronine, epinephrin, human epidermal vækstfaktor, gentamicin og amphotericin B (alle fra Lonza Group Ltd., Basel, Schweiz) plus human EGF (10 ng /ml; Sigma, Milano, Italien) og human bFGF (10 ng /ml; Sigma, Milano , Italien). Celler blev inkuberet i en fugtig atmosfære ved 37 ° C med 5% CO

2. Friske portioner af TGFp-1 blev EGF og bFGF tilsat to gange om ugen. Efter 48-72 timers kultur, kugler var synlige ved omvendt fase-kontrast mikroskopi.

flowcytometri

For at vurdere effekten af ​​TGFp-1 på både stemness og differentiering fænotype af A549 og LC31 cellelinier, 200.000 celler blev farvet med de følgende antistoffer (2 ug /ml): muse-anti-humant CD90 FITC (Becton Dickinson, Buccinasco, Milano, Italien), mesenchymale markering, muse-anti-humant CD133 PE ( Miltenyi Biotec, Calderara di Reno, Bologna, Italien), muse-anti-human CD326 PerCP (EpCAM, Becton Dickinson), epitelial markør, mus anti-human vimentin (DAKO, Milano, Italien) og muse-anti-Cytokeratin (klon CK3 -6H5, Miltenyi Biotec). Antistofferne blev inkuberet i 30 minutter ved 4 ° C i mørke. Efter inkubation blev prøverne vasket med PBS og analyseret ved FACSAriaII (Becton Dickinson).