PLoS ONE: SDA, en DNA-aptamer Inhibiting E- og P-selectin adhæsion af kræft og leukæmi celler, første og Pivotal Step i transendotelmigrering Migration under Metastase Dannelse

Abstrakt

Endotel (E-) og blodplader (P-) selectin medieret adhæsion af tumorceller til vaskulær endotel er et afgørende skridt for hæmatogen metastase dannelse. Nylige undersøgelser har vist, at selectin mangel reducerer metastase dannelse betydeligt

in vivo

. Vi valgte en E- og P-

S

electin specifik

D

NA

A

ptamer (SDA) via SELEX (

S

ystematic

E

volution af

L

igands ved

EX

ponential berigelse) med en

K

d værdi på ca. 100 nM og evnen til at hæmme interaktionen mellem selectin og dens ligander. Anvender menneskelige kolorektal cancer (HT29) og leukæmi (EOL-1) cellelinier kunne vi vise en anti-klæbende effekt for SDA

in vitro

. Under fysiologiske shear stress betingelser i en laminar strømning adhæsion assay, SDA inhiberede dynamisk tumorcelleadhæsion til immobiliseret E- eller P-selectin. Stabiliteten af ​​SDA i mere end to timer tillades dens anvendelse i celle-celleadhæsionsassays i celledyrkningsmedium. Når adhæsion af HT29-celler mod TNFa-stimuleret E-selectin frembyder humane pulmonære mikrovaskulære endotelceller blev analyseret, kunne inhibering via SDA påvises samt. Afslutningsvis SDA er en potentiel ny terapeutisk middel, der antagoniserer selectin-medieret adhæsion under metastase dannelse i menneskelige maligniteter

Henvisning:. Faryammanesh R, Lange T, Magbanua E, Haas S, Meyer C, Wicklein D, et al. (2014) SDA, en DNA aptamer Inhibiting E- og P-selectin adhæsion af kræft og leukæmi celler, første og Pivotal Step i transendotelmigrering Migration under Metastase Formation. PLoS ONE 9 (4): e93173. doi: 10,1371 /journal.pone.0093173

Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA

Modtaget: 9. januar 2014 Accepteret: 3 marts 2014; Udgivet: April 3, 2014

Copyright: © 2014 Faryammanesh et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forschungs- und Wissenschaftsstiftung Hamburg i Forschungsverbund “Cell overflade målretning”. Udstedelse af Fazit-STIFTUNG til R.F. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser: Den aptamer har patentanmeldt;. name “DNA-Aptamere, die E- und P-Selektine spezifisch binden”, nummer 2013112212485800DE. Der er ikke yderligere patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

På trods af alle fremskridt i molekylær medicin, behandling af metastatisk sygdom er stadig et uløst problem , således dødeligheden for kræft er stadig høj. I 2013 blev omkring 1.600.000 tilfælde af kræft og 580.000 kræftdødsfald registreret alene i USA [1]. Denne høje dødelighed skyldes hovedsagelig, at spredt kræft kan ikke behandles kurativt. Således mere end 90% af ofrene cancer dør på grund af metastatisk spredning af de maligne celler [2]. Derfor avancement i kræftbehandling væsentligt afhænger af den terapeutiske manipulation af metastatiske proces.

Under haematogeneous metastase dannelse tumorceller nødt til at overholde, og der vandrer endotelet ved målområdet fremtidens metastaser. Dermed de efterligner opførslen af ​​normale leukocytter, som de bruger selectin-medieret vandrende pathway af leukocytter i inflammation [3], [4]. De calciumafhængig selectiner er sammensat af en lectin domæne, som er ansvarlig for ligandbinding, en epidermal vækstfaktor-lignende domæne og et fleksibelt antal konsensus gentagelsesenheder [5], [6]. Cancerceller klæbe på endotelet ved interaktion med endothelial (E-) og blodplader (P-) selectiner [3], [4] følgende transmigration i det underliggende væv og efterfølgende proliferation (figur 1). I en xenograft model af human pancreas adenocarcinom, fraværet af E- og P-selectiner førte til 85% reduktion af peritoneal carcinomatose [7]. En tilsvarende reduktion af metastaser blev observeret i en eosinofil og kronisk myelogeneous xenograftmodel [8] og et colorektalt carcinom model i fravær af begge selectiner [4]. Således blokerer selectin-medieret adhæsion mekanisme i hematogen samt i intraperitoneal metastase er af klinisk betydning og kan være en potentiel terapeutisk fremgangsmåde mod patofysiologiske hændelser (figur 1). Hidtil monoklonale antistoffer, glycomimetic antagonister [9], og forskellige modificerede aptamerer [10] – [12] er blevet testet som selectin inhibitorer i prækliniske forsøg

metastatisk spredning af cancere forekommer via en sekventiel proces. der begynder med invasionen af ​​primære tumorceller. Efter at have krydset basalmembranen og migrerer gennem den tilstødende bindevæv, visse tumorceller intravasate i tumor mikrokar og cirkulerer med blodet til fjerne organer. På den kommende metastatisk site, er disse cirkulerende tumorceller (CTC) bremset fra blodet og holde sig til vaskulær endotel. Dette trin er afgørende initieret af interaktioner mellem endotheliale selectiner og visse kulhydrat ligander, såsom sialylerede Lewis strukturer præsenteret på tumorcelleoverfladen. Adhæsion er en forudsætning for ekstravasation og efterfølgende kolonisering af metastatisk væv. Selectin-bindende aptamerer, der forringer samspillet mellem selectinligander og endotelceller selectiner ville derfor en lovende ny anti-metastatisk terapeutisk.

Aptamerer er DNA- eller RNA-oligonukleotider med definerede tredimensionale strukturer, der udviser høj affinitet og specificitet for mål-molekyler. Med hensyn til deres bindingskarakteristika, kan de sammenlignes med antistoffer. Fordelene ved aptamerer end antistoffer er (i) deres enkel og billig syntese, (ii) muligheden for deres langtidsopbevaring ved stuetemperatur, og dermed (iii) deres stabilitet under forsendelse, (iv) de forskellige muligheder for konjugering til andre reagenser og (v) deres mangel på immunogenicitet [12]. Aptamerer vælges i en

in vitro

proces kaldet

S

ystematic

E

volution af

L

igands ved

EX

ponential Berigelse (

SELEX

) ved at amplificere DNA- eller RNA-oligonukleotider baseret på deres affinitet for et målmolekyle [13] – [15]. Mangfoldigheden af ​​oligonukleotider tillader udvælgelse af aptamerer for næsten enhver målmolekylet. Således aptamerer er et egnet værktøj til medicinsk brug i diagnose og behandling.

Vi begyndte at vælge DNA aptamerer sigter mod deres medicinske anvendelse til at hæmme tumor metastasering. Det lykkedes i at vælge en aptamer med høj affinitet for E- og P-selectin og testet bindingen til dets målmolekyler via filter fastholdelse assays (FRA). For at vurdere aptamer evne til at blokere interaktionen af ​​cancer og leukæmi celler med selectiner, vi anvendte laminare flow assays under fysiologiske shear stress betingelser, der anvender human colorektal cancercellelinie HT29, human kronisk eosinofil leukæmi cellelinje EOL-1, og primære humane pulmonal mikrovaskulære endotelceller (HPMECs). De udvalgte DNA-aptamerer inhiberer interaktionen af ​​cancerceller med endotelet ved at blokere deres selectin-medieret adhæsion. Således de valgte aptamerer et attraktivt alternativ til de eksisterende sammenlignelige reagenser.

Materialer og metoder

Oligonukleotider

Den oprindelige DNA-bibliotek anvendt til SELEX blev købt fra Metabion. Det bestod af en randomiseret region på 50 nukleotider flankeret af konstante regioner ved 5′- og 3′-ende (21 eller 20 nukleotider) for at muliggøre PCR-amplifikation. Yderligere oligonukleotider blev købt fra Invitrogen.

Biotinylering af E-selectin og Immobilisering på Streptavidin-coatede Dynabeads (Target Beads)

For biotinylering reaktion, 50 ug rekombinant human E-selektin /IgG-Fc -chimeras (rh E-selectin; R W buffer (1 mM EDTA, 2 M NaCl i 10 mM Tris-HCl, pH 7,5), sættes til streptavidin-belagte magnetiske perler og efterfølgende vasket to gange med 1 B W buffer. Efter inkubation i 15 minutter ved stuetemperatur supernatanterne blev fjernet, og perlerne blev resuspenderet i 150 mM NaOH efter inkubation i yderligere 10 minutter ved stuetemperatur. De kombinerede supernatanter, der indeholder det enkeltstrengede DNA, blev neutraliseret ved anvendelse af 100 mM HCI og udnyttes som starten puljen til en næste udvælgelsesrunde. Efter inkubation af DNA enkelte strenge med målet perler mængderne af vasketrinnene blevet rejst fra runde til runde stadig strengere.

DNA blev inkuberet med immobiliseret rh E-selectin på magnetiske perler (mål perler). Efter vask og fjernelse af ubundet DNA, blev målet bundne DNA elueres og amplificeres via PCR. Det dobbeltstrengede PCR-produkt blev adskilt i enkeltstrenget DNA og det næste SELEX trin startede efter denne regenerering. Identifikationen af ​​aptamerer via kloning og sekventering af berigede ssDNA pulje blev udført efter flere SELEX runder (10-20 runder).

Kloning

Isolering af udvalgte aptamerer blev gennemført ved molekylær TA-kloning. Derfor vektoren pUC19-T (pCR2.1-TOPO, Invitrogen) blev begrænset med Xcml (Thermo Scientific) til at generere 3′-thymidin udhæng [17], [18]. Aptamerer blev amplificeret via PCR under anvendelse FIREPol DNA Polymerase producerer 5’adenosin overhæng og ligeret med vektoren under anvendelse af T4 DNA-ligase (Thermo Scientific). DNA fra 50 resulterende kloner blev isoleret og sekventeret (GATC-Biotech).

Filter Retention Assay

Filter fastholdelse assays (FRA) blev anvendt til bestemmelse dissociationskonstanter af aptamer selectin interaktioner. Derfor DNA blev radioaktivt mærket med [ $ \\ raster = “RG1” $ –

32P] adenosin-5′-triphosphte (Hartmann Analytic) under anvendelse af T4-polynukleotidkinase (Thermo Scientific) og renset via gel ekstraktion efterfulgt af isopropanol udfældning. Til bindingsassays, konstante mængder af radioaktivt DNA ( 1 nM) blev inkuberet med stigende mængder af tilsvarende proteiner (0-1 uM) i 30 minutter ved stuetemperatur i udvælgelsen buffer. Bagefter blev protein-aptamer-komplekser filtreret (manifold I Dot-BlotSystem, Whatman) gennem en forud ækvilibreret (15 minutter i 0,4 M KOH) nitrocellulosemembran (Whatman) i 5 minutter i demineraliseret vand ved stuetemperatur og derefter vasket i udvælgelsen puffer. Efter filtrering blev nitrocellulosemembranen tørret og eksponeret i 3 timer til en fosfor billedskærm (Bio-Rad). For kvantificering brugte vi One stedspecifikke binding model (Mængde One-software)

Nuclease-resistens-stabilitet

DNA aptamer blev radioaktivt mærket med. [-?

32p] adenosine- 5′-triphosphte som beskrevet ovenfor og inkuberet med 100 pi fuld medium ved 37 ° C. Efter bestemte tidspunkter (0-720 min), blev 10 pi af hver prøve nedfrosset i flydende nitrogen og efterfølgende analyseret via 10% denaturerende gelelektroforese.

cellelinier og dyrkningsbetingelser Salg

Den humane colorektal cancer cellelinje HT29 (indkøbt fra den europæiske Cell Culture Collection) og den humane kronisk eosinofil leukæmi cellelinje EOL-1 (fra DSMZ) blev opretholdt i RPMI-1640 suppleret med 2 mM L-glutamin, 10% føtalt kalveserum (FCS ), blev 100 ug penicillin /ml og 100 ug streptomycin /ml (sidstnævnte reagenser købt hos PAA) ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO

2. For alle assays blev HT29-celler dyrket indtil 80% konfluens; EOL-1-celler blev dyrket i suspension. Primære humane pulmonale mikrovaskulære endotelceller (HPMECs) blev opnået fra Promocell, dyrket i endotelcellevækst medium MV suppleret med den tilsvarende supplement mix som leveres af leverandøren, og 100 ug penicillin /ml og 100 ug streptomycin /ml. HPMECs blev sub-dyrket ved anvendelse af en specifik løsrive kit (Promocell) ifølge producentens instruktioner. Alle eksperimenter med primære celler blev udført i løbet af de første seks passager.

Hæmning af Dynamic tumorcelleadhæsion til immobiliseret Menneskelig E- og P-selectin

Vi har analyseret aptamer-medieret hæmning af selectinligandproteinet interaktion under laminare strømningsbetingelser repræsenterer endothelial forskydningsspænding fundet i post-kapillære venuler af metastatiske organer såsom lunger [19]. Til dette formål blev rh E- og rh P-selectin immobiliseret på IBIDI behandler microslides VI (IBIDI) i en endelig koncentration på 0,02 mg /ml, fortyndet i DPBS herunder Ca

2+ og Mg

2+ ( DPBS

+; PAA) i 30 minutter ved 37 ° C. Sideløbende som en kontrol blev kamre overtrukket ligeledes med 0,02 mg /ml IgG-Fc (R 0,05 er markeret med *, meget store forskelle (p 0,01) med ** og ekstremt signifikante forskelle (p 0,001) med ***

Resultater

udvælgelse og karakterisering af en E- og P-selectin specifik DNA aptamer

med det formål at vælge DNA aptamerer, der inhiberer interaktionen mellem human E-selectiner og deres ligander præsenteret på cancerceller, udførte vi SELEX ved anvendelse rekombinant fremstillet humant E-selectin fusionsprotein som målmolekylet. Efter 17 runder af udvælgelse, den berigede DNA pool udviste ca. 20% binding til rh E-selectin forhold til den oprindelige DNA pool (figur 3A), der omfatter en dissociationskonstant (

K

d) 170 ± 65 nM. Sekvens analyser af 50 enkelte oligonukleotider afledt af denne pulje afslørede ingen sekvens ligheder mellem disse oligonukleotider. Imidlertid undersøger flere af disse molekyler ved filter fastholdelse assays, identificerede vi den rh E-selectin specifik DNA aptamer SDA (5′-GCCTGTTGTGAGCCTCCTAACGATTTGGATTTGGGGTGGAGGGTATGGTTTGTGCTGGCGTTCTCATTTCCCATGCTTATTCTTGTCTCCC-3′) med en

K

d værdi på 98 ± 16 nM (figur 3B).

DNA blev radioaktivt mærket, inkuberet med stigende mængder af proteiner og filtreret gennem en nitrocellulosemembran. blev påvist fraktioner af bundne DNA’er via autoradiografi og kvantificeres. (A) Rekombinant humant E-selectin inkuberet med DNA pool efter én (▴) og 17 (•) SELEX runder. (B) aptamer SDA inkuberet med rh E-selectin (•,

K

d ≈ 87 nM), rh P-selectin (▪,

K

d ≈ 84 nM) eller streptavidin (▴) som kontrol. En kontrol-DNA gjorde hverken binder til humant E- (▾) eller P-selectin (♦)

På grund af sekvens ligheder mellem E- og P-selectiner [6], [22] -. [ ,,,0],24], testede vi affiniteten af ​​SDA til rekombinant humant E-selectin /IgG-Fc-kimærer (rh P-selectin; R 0,001

vs

E-selectin.)

immobiliseret rh E- (A. ) eller rh P- (B) selectin (0,2 uM hver) samt stimulerede HPMECs (C) blev inkuberet med 5 uM SDA eller kontrol-DNA. Selectinligandproteinet-præsenterende tumorceller blev perfunderet løbet immobiliserede proteiner eller E-selectin præsentere HPMECs (flowhastighed 8 ml /h) og støttemure celler blev talt. SDA reducerede adhæsion til tilsvarende celler (n = 6 af samlet 2 forskellige eksperimenter,

P

-værdier anvendes på de selectiner). IgG-Fc-kontrol viste ingen vedhæftning virkning. Alle

P

værdier blev beregnet med ubehandlede selectiner som standard

(* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001).

for at undersøge om SDA også hæmmer EOL-1 celleadhæsion til humant P-selectin, vi immobiliseret humant P-selectin på kammerets overflade. I laminar flow assay upåvirket EOL-1 celleadhæsion til humant P-selectin resulterede i 10,42 ± 3,7 hændelser pr minut (figur 5B). Denne værdi blev reduceret til 60% med 6,54 ± 2,2 hændelser pr minut i tilstedeværelse af SDA (

P

. 0,05

vs

P-selectin). Efter inkubation med kontrol-DNA, flow vedhæftning af EOL-1 celler til P-selectin forblev uændret med 13,00 ± 3,7 hændelser pr minut (

P

. 0,01

vs

SDA).

SDA Forhindrer HT29 flow vedhæftning til stimulerede humane Pulmonal mikrovaskulære endotelceller

Efter at påvise, at SDA var i stand til at reducere tumorcelleadhæsion på menneskelig E- og P-selektin overflader under laminar flow stress, vi Derefter undersøgte indflydelsen af ​​SDA om celle-celle-interaktioner. Derfor blev to humane cellelinier, der anvendes: humane pulmonære mikrovaskulære endotelceller (HPMECs) og HT29-celler. Ikke-stimulerede HPMECs ikke til stede E-selectin på deres overflade. Ved TNFa-stimulering, HPMECs producere E-selectin og præsentere det på deres celleoverflade tillader interaktion med HT29 der bærer E-selectin ligander SLE

X og SLE

A. Først blev ikke-stimulerede HPMECs coatet på en mikro-kammer. Vedhæftning af selectinligandproteinet-præsenterende HT29-celler blev bestemt til at være 1,50 ± 1,3 celler pr minut (-rh TNFa). Efter E-selectin produktionen blev induceret ved behandling med rh TNFa i 4 timer forud for flow vedhæftning eksperimenter, antallet af HT29-celler adhærerer til HPMECs steg til 23.17 ± 12,7 hændelser pr minut (+ rH TNFa,

P

0,01

vs

stimuleret HPMEC).. For at undersøge indflydelsen af ​​SDA på denne celle-celle-interaktion, blev rh TNFa-stimulerede HPMECs inkuberet enten med SDA eller kontrol-DNA. Følgende laminar flow assay med HT29-celler viste, at SDA reduceret HT29 vedhæftning på E-selectin præsentere HPMECs betydeligt til 45% (10.50 ± 2,1 hændelser /min,

P

. 0,05

vs

stimuleret HPMECs). I modsætning hertil styre DNA viste ikke nogen signifikant effekt (19,67 ± 7,7 hændelser /min,

P

0,05

vs SDA

;. Figur 5C).

Diskussion

metastasedannelse er den vigtigste kliniske forhindring i cancerterapi [2]. Et stigende antal undersøgelser afslørede en afgørende inddragelse af E- og P-selectiner under metastatisk [4], [27], [28]. Derfor selectiner fremstå som lovende mål for at forstyrre metastaser formation. Til dette formål kan aptamerer være fordelagtige værktøjer. Aptamerer kan binde deres målmolekyle med høj specificitet og affinitet og kan inhibere funktionen af ​​et målmolekyle. I modsætning til antistoffer, disse oligonukleotider udviser temperaturstabilitet samt ligetil og billig syntese sammen med ukompliceret håndtering. Især DNA aptamerer kan være mere anvendelig derefter RNA aptamerer vedrørende deres længere halveringstid i serum. Den terapeutiske relevans aptamerer er blevet bevist af tidligere undersøgelser [12].

Vi udførte en

in vitro

valg for DNA aptamerer binding til E-selectin og identificeret en aptamer, opkaldt

S

electin

D

NA

A

ptamer (SDA), der omfatter høje affinitet til både, menneskelig E- samt til human P-selectin. For SDA en dissociationskonstant på ca. 100 nm blev bestemt, hvilke dokumenter den høje affinitet af bimolekylære interaktion mellem aptameren og selectin.

På grund af aminosyresekvensændringer ligheder mellem E- og P-selectin og det samme affinitet for Sle

X og SLE

A henholdsvis [6], [22], [23], [29], den sammenlignelige affinitet SDA til begge selectiner er ikke overraskende.

In vitro

bindingsassays viste en næsten lignende affinitet af SDA til rekombinant human P- og E-selectin. Assays med rekombinante murine selectiner viste, at SDA bevaret affinitet for murine selectin samt som også var ikke uventet grund af den sekvens analogi mellem humane og murine selectiner (data ikke vist). Vi ikke bevise muligt bindingsaffiniteten af ​​SDA for L-selectin, på grund af sin manglende betydning i metastase processen. Endvidere L-selectin interagerer med andre ligander end E- eller P-selectin.

Som nævnt ovenfor, nukleinsyrer i almindelighed og RNA navnlig ikke bemærkelsesværdig stabil i serum på grund af tilstedeværelsen af ​​forskellige nukleaser [12] . For at analysere aptamer levedygtighed, vi udførte en stabilitet assay med radioaktivt mærket SDA. Aptameren viste sig at være stabil i stor udstrækning i fuld medium i flere timer. Efter en time kunne påvises ca. 80% fuld længde SDA. Endvidere er det kendt, at aptamerer med en masse på ca. 40 kDa eller større forbliver i cirkulation i længere tid [30]. Således ville vi forvente en lignende adfærd for vores selectin aptamer med en masse på 30 kDa, hvilket er en forudsætning for enhver

in situ

eller endda

in vivo

applikationer i kommende undersøgelser. Denne sag og den påviste stabilitet i SDA er opmuntrende funktioner til fremtidige succesfulde

in vivo

studier.

Da SDA er i stand til at hæmme vedhæftningen til e samt P-selectin, vi hypotese, at denne aptamer interfererer med lectin domæner af selectiner, som de er ansvarlige for carbohydratbindende [31]. Hjælp af dynamiske flow adhæsionsassays, vi først påvist, at SDA inhiberede interaktionen mellem E-selectin og selectin ligand præsentere HT29 celler såvel som samspillet mellem P-selectin og selectin binding EOL-1-celler i fuldt medium under forskydning stressbetingelser. Efterfølgende testede vi den inhiberende virkning af SDA på interaktionen af ​​E-selectin præsentere HPMECs og selectin bindende HT29-celler. Dette assay simulerer den naturlige adhæsion proces ganske godt, da det kører under fysiologiske shear stress betingelser, og vi målte en markant reduktion for HT29 adhæsion medieret af SDA på 45%. Dette faktum verificeret hæmmende effektiviteten af ​​denne aptamer og valideret dets stabilitet i fuld medium og efterfølgende dens evne til

in vivo

studier.

Så vidt vi ved, kun en thio-modificeret DNA aptamer (ESTA-1) er blevet beskrevet i stand i at binde og blokere E-selectin effektivt [32]. Dette er imidlertid ikke udviste nogen target bindende i vores hænder i filteret fastholdelse assays. Desuden to modificeret RNA aptamerer PF377 [33] og ARC5690 [30] findes som binder og blokere P-selectin. Disse eller andre aptamerer med enhver ændring inden for deres sukker-delen er relativt dyre at producere og dermed mindre velegnet til lange tid behandlinger. Derudover er 2′-fluor modificeret RNA aptamer PF377 begrænset til enhver

in vivo

anvendelse, da den kun kan behandles med syntetisk PBS udelade enhver nukleaser [33], [34]. Serum ustabilitet dette nævnt, og de fleste andre RNA aptamerer er den vigtigste årsag til deres fiasko i videregående studier.

I forhold til de allerede eksisterende modificerede aptamerer, har vi udvalgt en stabil ikke-modificeret DNA aptamer med hæmmende kapacitet på selectin-ligand interaktioner mellem vaskulære endotel og tumorceller ved at reducere den initiale og hastighedsbegrænsende trin i transendotelial migrering af kræftceller.

Udover oligonucleotid antagonister, alternativ selectin målretning hæmmere præsenteres af et stof klasse navngivne glycomimetics. Disse modificerede oligosaccharider, der efterligner naturlige kulhydrater omfatter evnen til at binde efterligne kulhydrat ligand. En glycomimetic der blokerer E-, P- og L-selectin er GMI-1070 [9]. SDA aptamer beskrevet her repræsenterer en ny selectin-inhibitor, der kan anvendes i kombination med allerede eksisterende andre inhibitorer for at forhindre metastasedannelse.

Konklusioner

Sammenfattende har vi valgt en ikke-modificeret 91 nukleotider lang DNA-aptamer, SDA, som viser høj affinitet til human E- og P-selectin med

K

d

værdier på ca. 100 nM. Dens evne til at inhibere interaktionen af ​​human cancer og leukæmi celler til selectiner selv i et strømningskammer simulerer blodgennemstrømningen i fysiologisk miljø fremhæver SDA som et lovende redskab til yderligere

i

vivo

undersøgelser. Den generation af mus huser tilsvarende menneskelige selectiner for dem

i

vivo

analyser er en vigtig næste skridt og med forbehold af de nuværende eksperimenter.

Tak

Vi takker Katrin Seelhorst for omhyggeligt at læse manuskriptet.