PLoS ONE: En NQO1-Initierede og p53-Uafhængig apoptosecyklus Bestemmer Anti-tumor effekt af Tanshinone IIA mod ikke-småcellet Cancer

Abstrakt

NQO1 er en spirende og lovende terapeutisk target i kræftbehandling . Denne undersøgelse var at bestemme, hvorvidt anti-tumor effekt af tanshinone IIA (TSA) er NQO1 afhængig og at belyse de underliggende apoptotisk celledød veje. NQO1

+ A549 celler og isogenically matchede NQO1 transficeret og negative H596 celler blev brugt til at teste egenskaberne og mekanismerne i TSA celledød. In vivo anti-tumor effekt og vævsfordelingen egenskaber TSA blev testet i tumor xenotransplanterede nøgne mus. Vi observerede, at TSA inducerede en overdreven dannelse af ROS, DNA-ødelæggelse, og dramatiske apoptotisk celledød i NQO1

+ A549-celler og H596-NQO1 celler, men ikke i NQO1

– H596 celler. Hæmning eller stilhed NQO1 samt antioxidanten NAC markant vendt TSA inducerede apoptotiske effekter. TSA behandling signifikant forsinkede tumorvækst på A549 tumorxenografter, som i væsentlig grad blev antagoniseret af dicoumarol co-behandling på trods af de forøgede og langvarige TSA ophobninger i tumorvæv. TSA aktiveret en ROS udløst, p53 uafhængig og caspase afhængig mitokondrier apoptotisk celledød vej, der er kendetegnet med forøget forhold af Bax til Bcl-xl, mitokondriske membranpotentiale forstyrrelser, cytochrom c-frigivelse, og efterfølgende caspaseaktivering og PARP-1-spaltning. Resultaterne af disse resultater tyder på, at TSA er en yderst specifik NQO1 target middel og er lovende i udvikling som et effektivt lægemiddel i behandlingen af ​​NQO1 positiv NSCLC

Henvisning:. Liu F, Yu G, Wang G, Liu H, Wu X, Wang Q, et al. (2012) En NQO1-Initierede og p53-Uafhængig apoptosecyklus Bestemmer Anti-tumor effekt af Tanshinone IIA mod ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 7 (7): e42138. doi: 10,1371 /journal.pone.0042138

Redaktør: Siyaram Pandey, University of Windsor, Canada

Modtaget: Marts 16, 2012; Accepteret: 2 jul 2012; Publiceret: 27 juli, 2012 |

Copyright: © Liu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af en fond for forfatteren af ​​National Excellent doktorafhandling Kina (200.979), Natural Science Foundation i Jiangsu-provinsen (BK2011065), Science Foundation for Ungdom Scholars af Undervisningsministeriet Kina (200.803.161.012), Program for New Century Fremragende Talenter i University (NCET-09-0770), og National Natural Science Foundation Kina (nr. 91.029.746, 30.801.422). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Ikke-småcellet lungecancer (NSCLC) tegner sig for ca. 80~85% af alle tilfælde af lungekræft, og er den mest almindelige dødsårsag hos mænd og andet til brystkræft hos kvinder [1]. Kombination kemoterapi, normalt platinbaseret, er i øjeblikket den første linje behandling af valg for NSCLCs. Men prognosen for patienter med fremskreden NSCLC forbliver fattige med en median overlevelsestid på 8 to11 måneder, og en 1-års overlevelse på 30% [2], [3]. Overlevelsen lang sigt (5 år) lå endda dårlig på omkring 15% [4]. Den seneste udvikling af forskellige molekylære target narkotika og deres kombination med kemoterapi narkotika forbedrer resultatet af NSCLC terapi; imidlertid fortsat skuffende i terapien af ​​fremskreden NSCLC. Det er klart, der er et presserende behov for at identificere nye terapeutiske mål og udvikle tumor-selektive kemoterapeutiske lægemidler specifikke for NSCLCs

NAD (P) H:. Quinon oxidoreduktase (NQO1, EF 1.6.99.2) er en cytosolisk flavoenzyme som katalyserer obligatorisk to-elektron reduktion af en række quinon substrater, ved hjælp af både NADH og NADPH som elektrondonorer [5]. Oprindeligt NQO1 var bredt menes at være en afgiftning enzym i betragtning af dets to-elektron reduktion ejendom, uden om reduktion én-elektron producerer ustabil og meget reaktive semiquinon [6], [7]. Sidst blev det konstateret, at nogle quinoner såsom mitomycin C, streptonigrin, E09, og RH1 [8], [9], [10], [11], [12] blev bioaktiveres ved NQO1. Den bioaktivering ejendom NQO1 lover det et ideelt mål for udvikling antitumorlægemidler, fordi forskellige humane tumorer [13] har forhøjede NQO1 aktiviteter. I tilfælde af lungetumorer, er NQO1 aktivitet øges op til 80 gange i NSCLC-tumorer i forhold til normale lunge, og 20~35 gange i forhold til SCLC-cellelinier [14]. En sådan differentieret udtryk form for NQO1 mellem tumorer og normale væv tyder på, at NQO1 mål narkotika ville være meget selektive i at dræbe tumorceller samtidig spare normale væv. RH1 er en lægemiddelkandidat bioaktiveres ved NQO1 at producere hydroquinon i aktiveringen af ​​aziridin ringe og efterfølgende DNA alkylering og interstreng tværbinding. I dette tilfælde er NQO1 anvendes som en tumor selektiv enzym til bioactivate prodruget og således realisere en tumor specifik toksicitet. Ud over sin ejendom som en oxidoreduktase har NQO1 også blevet fundet direkte involveret i at stabilisere den vitale tumorsuppressorer p53 /p73 /p33 [15], [16]. Desuden har NQO1 polymorfisme, der fører til enzymet inaktivitet vist sig at være en stærk prognostisk og prædiktiv faktor i dårligt resultat af brystcancer [17]. Disse resultater tyder på, at den farmakologiske rolle NQO1 er langt ud over sin enzymatiske aktivitet på at reducere quinoner. Tager sammen, ville det være af stor interesse for at bestemme de terapeutiske potentialer og underliggende mekanismer NQO1 target agenter på tumorer. Hapachon (Lap), et velundersøgt NQO1 substrat, er blevet identificeret som et lovende middel til forskellige cancerterapi [18]. Men gentagen oral behandling af Lap inducerer anæmi hos både rotter og mennesker, som i høj grad kan begrænse dens anvendelse [19], [20]. En anden begrænsning ved Lap er dens NQO1 specifik aktivitet kan kun realiseres indenfor et relativt smalt koncentrationsområde og eksponeringstid vindue [18]; Det er tvivlsomt, om en sådan betingelse kan godt kontrolleret i in vivo stater.

Tanshinone IIA (TSA) var et derivat af phenanthren-quinon isoleret fra Salvia miltiorrhiza (Danshen, i kinesisk), et meget anvendt naturlægemiddel medicin. Selv om dens traditionelle brug primært fokuseret i kardiovaskulære og cerebrovaskulære sygdomme [21], [22], [23], [24], anti-tumor aktivitet af TSA og andre lignende struktur tanshinones blev bekræftet i løbet af de seneste årtier [25], [ ,,,0],26], [27]. Forskellige undersøgelser har vist, at TSA udøvede cytotoksiske virkninger over for en lang række humane tumorcellelinier [28]. På trods af tidligere bestræbelser på at afsløre dens mekanismer [29], [30], det molekylære mål af TSA til at fremkalde sin anti-tumor effekt forbliver undvigende. Vi har for nylig fundet, at NQO1 katalyseret quinon reduktion efterfulgt af øjeblikkelig glucuronidering er den fremherskende metaboliske vej for TSA i både rotter [31] og mennesker [32]. NQO1 reducerer TSA at danne et meget ustabilt catechol mellemprodukt, der automatisk oxiderer tilbage til forælder TSA og udgør en nytteløs redox cyklus producerer oxidativ stress [31]. Disse resultater fik os til at hypotesen, at NQO1 kan være den primære intracellulære mål for TSA i kræftceller.

Den foreliggende undersøgelse har til formål at afgøre, om NQO1 spiller en central rolle på indlede anti-tumor effekt af TSA både in vitro og in vivo. Isogenically matchede NQO1

+ og NQO1

– menneskelige H596 og NQO1 høj udtryk menneske A549 NSCLC cellelinjer blev anvendt til at bestemme NQO1 cytotoksicitet, apoptotisk effekt, ROS produktion, DNA-skader, og cellulære optagelse af TSA. Vi viser, at TSA er en lovende NQO1 specifikt mål middel, som inducerer apoptotisk celledød af NSCLC celler via en unik NQO1-initieret og ROS-medieret aktivering af en p53-uafhængig, men caspase-afhængige mitokondrie apoptosecyklus.

Resultater

TSA induceret cytotoksicitet er NQO1 afhængig og p53-uafhængige

for at fastlægge den rolle, NQO1 blev TSA cytotoksicitetsassays udført i NQO1 høj ekspression A549 celler, NQO1 negative og transficeret H596 celler; NQO1 proteinniveauer og enzymaktiviteter i NSCLC-celler er vist i fig. 1A. Proteinekspression og enzymaktivitet af NQO1 kunne ikke påvises i H596 celler; den NQO1 enzymaktivitet i H596-NQO1 celler er meget lavere end i A549 celler, som er i overensstemmelse med tidligere resultater [18]. TSA inducerede en koncentrationsafhængig cytotoksicitet i A549-celler med en IC50 værdi på 5,32 uM. I modsætning hertil NQO1 negative H596 celler var stort set resistente over for TSA cytotoksicitet med en IC50 40 pM (. Figur 1B). NQO1 hæmning af den specifikke NQO1 inhibitor dicoumarol (DIC, 10 uM) kunne i høj grad hindre TSA s cytotoksicitet i A549 celler; NQO1 siRNA knockdown kunne også ophæve den cytotoksiske virkning af TSA, om end i mindre udstrækning, at ved DIC (fig. 1C, D). Den transfektion af NQO1 til H596 celler genoprettet sin modtagelighed for TSA induceret cytotoksicitet. IC50 for TSA i H596-NQO1 og i H596-vektor cellelinjer er af 23,56 uM og 80 uM (figur 1E.). Notatet de IC50-værdier i A549 celler var meget lavere end i H596-NQO1 celler, hvilket er i overensstemmelse med forskellen på enzymaktiviteter mellem disse to cellelinjer. Alle disse resultater tyder på, at TSA-induceret cytotoksicitet er NQO1 afhængig. Desuden ser det ud til, at TSA viste bedre NQO1 target specificitet end Lap; IC50-værdi forskellen mellem A549 celler og H596 celler til TSA (5,32 uM VS 40 uM) er langt højere end for Lap (1,94 uM VS 3,93 uM). Desuden er forbehandling med typiske p53 inhibitor pifithrin-α (PFT-α) [33], og p53 stilhed af siRNA havde ubetydelig indvirkning på TSA-induceret cytotoksicitet (fig. 1 F), hvilket tyder på TSA induceret cytotoksicitet i en p53-uafhængig måde.

A, protein niveauer og enzymaktiviteter af NQO1 i NSCLC celler. NQO1 aktivitet 1,0 nmol⋅min

-1⋅μg

-1 var angivet ikke-påviselige (ND). B, cytotoksicitet TSA og Lap i NSCLC celler; celler blev udsat for gradient koncentrationer af TSA (0,4-40 uM) eller Lap (0,5-10 uM) i 72 timer. C, effekter af NAC eller DIC forbehandling; A549-celler blev forbehandlet med 5 mM NAC i 1 time eller 10 uM DIC i 30 min. D, effekter af NQO1 stilhed i A549 celler. E, TSA cytotoksicitet i H596 og NQO1-transficerede H596 celler. F, effekt af P53 inhibering eller tavshed; A549-celler blev forbehandlet med 10 uM af PFT-α i 5 timer eller forbehandlet med P53 siRNA. Data er vist som gennemsnit ± SE af tre uafhængige eksperimenter.

TSA inducerer NQO1 afhængige og p53-uafhængig apoptotisk celledød

TUNEL assays blev udført for at bekræfte, at TSA induceret celledød er på grund af induktion af NQO1 afhængig apoptose. Som vist i fig. 2A, TSA inducerede en koncentrationsafhængig apoptose og Tunel positive celler nåede over 80% ved 40 uM TSA behandling i A549 celler, mens Tunel positive celler påvist fra H596 celler efter TSA behandling er uden forskel fra kontrol behandling. Desuden kunne både DIC og NQO1 siRNA signifikant omvendt TSA induceret apoptose i A549-celler (fig. 2A, B). Ligeledes transfektion af NQO1 til H596 celler signifikant genoprettet sin modtagelighed for TSA induceret apoptose, kendetegnet med en 38.02% versus 7,28% TUNEL-positive celler i H596-NQO1 celler og H596-vektor-celler (fig. 2C), hhv. Resultaterne af TUNEL analyser er helt enige med dem fra MTT baseret Cytotoksicitetsstudier, kraftigt antyder, at TSA inducerer en NQO1 afhængig apoptotisk celledød i NSCLC. Overensstemmelse med MTT resultat, TUNEL assay viste også, at p53-inhibitor PFT-α og P53 siRNA havde ubetydelig indvirkning på TSA induceret apoptose, hvilket indikerer en p53 uafhængig apoptose induceret af TSA.

A, øvre, A549-celler og H596 celler blev udsat for angivne koncentration af TSA i 48 timer; lavere, blev A549-celler forbehandlet med 10 uM af DIC i 30 min, 5 mM NAC i 1 time, eller 10 uM PFT-α i 5 timer og derefter udsat for 40 uM TSA i 48 timer. B, effekter af NQO1 eller p53 stilhed på TSA-induceret apoptose i A549 celler. C, H596-vektor og H596-NQO1 celler blev udsat for TSA i 48 timer; TUNEL-analysen blev udført ved hjælp af klik-iT TUNEL Alexa Fluor 594 Imaging Assay Kit. Otte til ti felter blev undersøgt i hvert forsøg er TUNEL signalet vist i rødt og Hoechst 33342 nukleare pletten er vist med blåt. Lige er de repræsentative billeder af TUNEL farvning. Alle data er vist som middelværdi ± SE for tre uafhængige forsøg (# P 0,05, ## P 0,01, ### P 0,001, NAC, DIC forbehandling sammenlignet med TSA-behandling alene, NQO1 siRNA forbehandling sammenlignet med kontrol siRNA forbehandling, H596-NQO1 celler sammenlignet med H596-vektor celler; ** P 0,01, *** P 0,001, TSA behandling sammenlignet med kontrol celler)

TSA inducerer NQO1 afhængig DNA-skader

.

Fordi DNA-ødelæggelse er en central initiator på at inducere apoptotisk celledød [34], søgte vi at bestemme, om TSA behandling inducerer NQO1-afhængig DNA-beskadigelse og brud. Som forventet TSA inducerede en dramatisk og koncentrationsafhængig DNA-skader i A549 og H596-NQO1 celler men minimal i NQO1 negativ H596 og DIC eller siRNA forbehandlet A549-celler (fig. 3A, B og C). H

2O

2 (200 uM) behandling i 4 h inducerede næsten identisk DNA-skader i alle cellelinjer. Tidsforløbet data viste, at TSA inducerede NQO1-dependnet DNA-skader nået det maksimale efter 24 timers behandling, men faldt en smule efter 48 h, muligvis på grund af overdreven celledød (fig. 3A). Det blev også bemærket, at TSA 40 pM inducerede ret ens mængde af DNA-skader i A549-celler og H596-NQO1 celler på trods af forskellige NQO1 enzymatisk aktivitet mellem A549-celler og H596-NQO1 celler. Vi foreslog, at det er muligvis, at TSA 40 uM kan inducerede en maksimal DNA-skader til både A549 og H596-NQO1 celler og dermed ingen forskel blev observeret. Imidlertid A549-celler er faktisk at være meget mere følsom end H596-NQO1 celler til TSA induceret DNA-beskadigelse ved lavere dosis udfordring (Fig. 3B, C).

DNA-læsioner bestemmes af alkaliske comet assays. A, TSA induceret DNA-beskadigelse i A549 og H596 celler, såvel som effekten af ​​NAC eller DIC forbehandling. B, effekt af NQO1 stilhed i TSA inducerede DNA-skader i A549 celler. C, DNA skader i H596-NQO1 og H596-vektor-celler. Venstre panel, repræsentanten morfologiske udseende celler med TSA behandling i 24 timer; højre panel, kvantitative resultater udtrykt som fold ændring (T /C) af komet hale længder eller udtrykt som komet hale længder (vilkårlig enhed). Data er vist som middelværdi ± SE for mindst tre uafhængige forsøg. (# P 0,05, ## P 0,01 NQO1 stilhed vs. kontrol siRNA eller H596-NQO1 vs H596-vektor, * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001, TSA eller H

2O

2 behandling sammenlignet med kontrol celler).

ROS fremstillet af NQO1 bioaktivering er en vigtig mediator på TSA-induceret apoptotisk celledød

Vi har fundet, at TSA blev reduceret ved NQO1 at fremstille et meget ustabilt catechol mellemprodukt, som kunne enten konjugeret med glucuronsyre i nærværelse af UDP-glucuronsyre transferaser (UGT’er) eller auto-oxiderer tilbage til TSA uden dem [31]. Da blev observeret manglende UGT’er i NSCLC celler, er det rimeligt at postulere, at TSA kan udløse en nytteløs redox cyklus producerer overdreven ROS i NQO1 positive celler. For at understøtte denne overvejelse, blev DCF farvning og glutathion cykling assay anvendes på overvågning TSA induceret ROS-dannelse. Tidsforløb for DCF farvende data viste, at TSA (10 uM) inducerede overdreven ROS-dannelse inden for 30 min og nåede mætning i 60 min i A549-celler, men ikke i H596 og DIC forbehandlet A549-celler (fig. 4A). NQO1 stilhed i vid udstrækning forhindret TSA induceret ROS-dannelse i A549-celler (fig. 4C). Konsekvent, transfektion af NQO1 til H596 celler, der restitueres evne TSA induceret produktion af ROS fra den nytteløse cyklus (fig. 4D). Resultater opnået fra glutathion cykling assay (fig. 4E, F), som understøttes endvidere, at TSA induceret ROS-produktion i en NQO1 afhængig måde. I modsætning hertil H

2O

2 inducerede næsten identisk ROS produktion i alle tilfælde, uafhængig af NQO1 ekspression.

Intracellulær ROS-generering målt ved DCF-farvning. A, for tidsforløbsundersøgelse, celler blev behandlet med 10 uM af TSA med eller uden forbehandling med 10 uM af DIC eller 5 mM NAC; B, blev cellerne eksponeret for angivne doser af TSA i 1 time; C, effekt af NQO1 tavshed TSA udløst ROS formation; celler blev udsat for 4 uM eller 40 uM TSA i 1 time; D, H595-NQO1 celler og H596-vektor celler blev udsat for 10 uM eller 40 uM TSA i 1 time. H

2O

2 (400 uM) blev anvendt som en positiv kontrol. E og F, Glutathion cykling analyser; E, NSCLC celler blev udsat for angivne doser af TSA med eller uden DIC forbehandling i 24 timer. F, H596-vektor og H596-NQO1 celler blev udsat for TSA i 24 timer. Data er vist som relative ændringer blindprøvekontrol og udtrykt som middelværdi ± SE for mindst tre uafhængige forsøg. (# P 0,05, ## P 0,01, ### P 0,001 NQO1 siRNA vs. kontrol siRNA, H596-NQO1 vs H596-vektor, A549 med DIC vs. TSA alene; * P 0,05, ** P 0,001, TSA eller H

2O

2 behandling vs. deres respektive kontrol celler)

I betragtning at NQO1 udløste ROS produktion er en meget tidlig og løbende begivenhed, er det vigtigt at afgøre, om ROS produceret fra TSA quinon og catechol genanvendelse er en central aktør i TSA-induceret apoptotisk celledød. Forbehandlingen af ​​A549-celler med 5 mM N-acetylcystein (NAC), en typisk ROS scavenger, var tilstrækkelige til at fjerne TSA induceret intracellulær ROS (Fig. 4A). NAC forbehandling kunne væsentligt forhindre TSA-induceret cytotoksicitet (Fig. 1C), apoptose (fig. 2A), og DNA-skader (fig. 3A). Øvrigt i alle test aspekter, reverseringsmidlet virkninger af NAC forbehandling er næsten sammenlignelig med den, der opnås ved DIC forbehandling. Alle resultaterne indikerede, at ROS fremstillet af NQO1 katalyserede genvindingsprocessen er en vigtig mediator for induktion af apoptotisk celledød af NSCLC-celler.

TSA forårsagede NQO1 og ROS-medieret p53 uafhængig aktivering af mitokondriel pathway

Som vist i fig. 5, TSA forårsagede en dosisafhængig afbrydelse af MMP, som er konsistent med en tidligere undersøgelse af Chiu et al [35], hvori TSA blev fundet at inducere en ROS-medieret mitokondrie apoptotisk celledød. Fordi vi fandt heri, at TSA induceret apoptotisk celledød var NQO1 afhængig, vi således forsøgt at fastlægge den rolle, NQO1 i aktivering af mitokondrie apoptotisk celledød vej. NQO1 inhibitor DIC, NQO1 siRNA, samt NAC forbehandling væsentlig grad kan vende TSA induceret MMP forstyrrelser, hvilket indikerer en NQO1 afhængige og ROS-medieret mitokondrisk forstyrrelser induceret af TSA. P53 siRNA havde ingen virkning på TSA induceret afbrydelse af MMP, hvilket antyder en p53-uafhængig mekanisme.

A549-celler blev udsat for TSA af gradient koncentrationer (4, 10, og 40 uM) alene eller forbehandlet med DIC, NAC eller underkastes NQO1 og p53 stilhed, før behandlingen af ​​40 uM TSA. Celler behandlet som angivet i 24 timer blev fyldt med 3 uM JC-1 i 15 minutter ved 37 ° C, derefter blødt vasket med PBS i to gange. I cytosolen, den monomere form af dette farvestof fluorescerer Green og i den mitokondriske matrix, højt koncentrerede JC-1 danner aggregater, fluorescerer rødt. A, repræsentative billeder taget af Leica BMI3000 B mikroskop med en konfokal mikroskop ansøgning. B, fluorescensen blev aflæst ved 488 nm excitation og 530 nm emission for grøn, og ved 540 nm excitation og 590 nm emission for rød anvendelse af en Synergy-H1 fluorimeter (Bio-Tek Instruments) og ændringerne i mitokondriepotentiale blev beregnet som rød /grøn-forhold for hver tilstand. (## P 0,01, ### P 0,001, DIC, NAC forbehandling sammenlignet med TSA behandling alene eller NQO1 siRNA forbehandling sammenlignet med kontrol siRNA forbehandlede celler; ** P 0,01, *** P 0,001, TSA behandling sammenlignet med kontrol celler).

TSA behandling inducerede en tid og koncentrationsafhængig opregulering af pro-apoptotisk Bax og nedregulering af pro-overlevelse Bcl-xl i en NQO1 og ROS afhængige men p53 uafhængig måde (fig. S1, fig. 6A). Dette førte til en dramatisk forøget forhold af Bax /Bcl-XL, som er velkendt en vigtig faktor i styrende celle apoptose via afbrydelse af mitochondrier [36]. Mitokondrier forstyrrelser så føre til frigivelse af cytochrom c fra mitokondrier, som det fremgår af den cytosoliske stigning men mitokondriel reduktion af cytochrom c (Fig. 6B).

A549-celler blev udsat for TSA af gradient koncentrationer (4, 10 og 40 uM) alene eller forbehandlet med DIC, NAC, eller underkastes NQO1 og p53 stilhed, før behandlingen af ​​40 uM TSA i 48 timer. A, hele cellelysater blev forberedt efter angivne behandling og western blot analyse blev udført ved hjælp af anti-Bax, -Bcl-xl, -PARP, -cleaved PARP, -NQO1, p53, og -GAPDH antistoffer. B, Cytosolisk og mitokondrielle proteiner blev fremstillet til western blot-analyse under anvendelse af anti-cytochrom c-antistof; udsving i protein loading mellem prøver blev monitoreret ved GAPDH eller COX-IV-niveauer, hhv. Den relative massefylde værdi hvert bånd er vist nedenfor Western blot. Dataene er repræsentative for et typisk eksperiment, der blev udført tre gange (middelværdier, P 0,05)

Caspase aktivering blev derefter analyseret ved en aktivitet under anvendelse substrater af aktiv kløvet caspase og en western blot. analyse af PARP-spaltning (fig. 6A, og fig. 7A, B). TSA dosisafhængig øgning aktiviteterne af caspase-3, -9, og -8. Koncentrationen afhængig induktion af PARP-spaltning yderligere understøttet caspase-3-aktivering. Den pan-caspaseinhibitor, z-VAD-FMK, stort set svækket TSA induceret apoptose (fig. 7C). Tilsammen antyder disse resultater, at TSA induceret apoptotisk celledød er caspase-medieret. Konsistent med andre afprøvede i vores undersøgelse, TSA induceret kollaps af MMP, cytochrom c-frigivelse aspekter, og caspaseaktivering blev alle NQO1 og ROS afhængige men p53 uafhængig

A og B, caspaseaktivitet test.; A549-celler blev udsat for TSA af gradient koncentrationer (4, 10, og 40 uM) alene eller forbehandlet med DIC, NAC, eller underkastes NQO1 og p53 stilhed, før behandlingen af ​​40 uM TSA i 48 timer. C, TUNEL analyse af TSA-induceret apoptose med eller uden forbehandling af pan-caspaseinhibitor z-VAD-fmk. Data er vist som middelværdi ± SE for mindst tre uafhængige forsøg. (## P 0,01, ### P 0,001, DIC, NAC eller z-VAD-FMK forbehandling sammenlignet med TSA-behandling alene, NQO1 siRNA forbehandling sammenlignet med kontrol siRNA forbehandlede celler; * P 0,05, ** P 0,01 , *** P 0,001, TSA behandling sammenlignet med blanke kontrol celler)

antitumorvirkningen af ​​TSA in vivo er NQO1-afhængig

for at bekræfte rolle NQO1, den. antitumorvirkningen af ​​TSA blev yderligere undersøgt i A549 tumorxenoplantater af TSA behandling alene eller i kombination med DIC (fig. 8A). TSA (20 mg /kg) behandling i væsentlig grad kan undertrykke tumorvækst; efter 20 dages behandling, mængden af ​​tumorer i TSA-behandlede gruppe var på 279 ± 46 mm

3 (P 0,01, sammenlignet med kontrolgruppen af ​​552 ± 90 mm

3). DIC-behandling alene også lidt inhiberede tumorvækst kendetegnet med tumorvolumen af ​​439 ± 99 mm

3; for det modsatte, DIC forbehandling signifikant antagoniserede tumorsuppressionsaktivitet virkning TSA, hvilket antyder, at antitumorvirkningen af ​​TSA in vivo var også NQO1 afhængige. Histologiske undersøgelser viste stor tumor nekrose og apoptose dukkede op i TSA-behandlede gruppe af mus, og note, sås ingen toksicitet i normale organvæv på TSA behandling i 20 dage (fig. 8B).

A, øvre, tumor volumen måling (P 0,01, TSA vs. kontrol P 0,05, TSA vs. TSA + DIC); lavere, tumor vægt (# P 0,05, TSA vs. TSA + DIC, *** P 0,001, TSA vs. kontrol); Data er vist som middelværdi ± SE for seks mus. B, histologiske undersøgelser; tumor og vævssnit blev analyseret ved hematoxylin og eosin-farvning for histologiske træk. C, biodistribution af TSA i A549 tumor indlæst nøgne mus; data er vist som gennemsnit ± SE for 6 mus.

For at vurdere tumor ophobning niveauer af TSA blev vævsdistribution undersøgelse udført i mus med A549 tumorxenoplantater (Fig. 8C). I overensstemmelse med vores tidligere undersøgelse af TSA distributioner i rotter [37], TSA, der blev fremstillet som en fast dispersion med PEG6000 fortrinsvis fordelt i det retikuloendoteliale system. På trods af denne begrænsning, kan TSA stadig effektivt distribuere ind i tumorvæv; TSA viste højere ophobning niveauer og langvarig eksponering gange i tumorer end i plasma. DIC forbehandling, trods at modvirke tumor undertrykkelse effekt af TSA, steget betydeligt eksponeringsniveauer af TSA herunder i tumorvæv, ved en mekanisme til at hæmme TSA metabolisme via NQO1 /UGT’er [31]. Bedre TSA levering, der kan flygte fra reticuloendotheliale system optagelse forventes at stige yderligere sin tumor ophobning niveauer og dermed bedre anti-tumor effekt.

Diskussion

Akkumulerende tyder på, at NQO1 er en lovende terapeutisk målrette forskellige tumorer, især for NSCLC, hvori NQO1 overudtrykkes sammenlignet med normale lungevæv [14]. Ikke desto mindre er der i øjeblikket ingen specifikke NQO1 mål lægemidler, der anvendes i klinikken og dermed den behandlingsmæssige værdi forbliver uudforsket. Selv om nogle anti-tumor lægemidler, såsom mitomycin kan bioaktiveres af NQO1, alle af dem mangler tilstrækkelig selektivitet og specificitet til NQO1 og deres anti-tumor effekt er bedre forklares ved andre mekanismer [38], [39]. Beviser indsamlet fra studier af Lap indikerer, at NQO1 aktiverede forgæves redox cyklus kan inducere en unik celledød vej, inspirerende den nye idé om at udvikle NQO1 target anti-tumor narkotika. Denne undersøgelse bidrager til at identificere en bestemt NQO1 substrat TSA, som inducerer en unik p53 uafhængig aktivering af mitokondrie apoptosecyklus på NQO1 bioaktivering.

Hypotesen om NQO1 som intracellulære mål for TSA var baseret på tidligere resultater, at NQO1 er den hastighedsregulerende enzym i fastlæggelsen TSA stofskifte [31], [32]. For at verificere det, studerede vi den rolle NQO1 i fastsættelsen af ​​de anti-cancer effekter af TSA mod NSCLC. I alle testede aspekter, TSA udstillet i en NQO1 afhængig måde på at fremkalde cytotoksicitet, apoptose, ROS produktion, og DNA-skader; alle disse begivenheder kunne observeres kun i NQO1 positive cellelinier A549 og H596-NQO1. Konsekvent, kunne stilhed NQO1 ved specifik inhibitor DIC og siRNA stort set ophæver alle disse begivenheder i A549 celler. Vigtigere blev NQO1 afhængige anti-cancer effekt af TSA yderligere bekræftet i A549 tumorxenoplantater. TSA (20 mg /kg) behandling signifikant forsinkede tumorvækst, mens samtidig administration af DIC i vid udstrækning kunne ophæve denne virkning. Det var meget interessant at bemærke, at DIC øger tumor ophobning af TSA mens reducerer sin anti-tumor effekt (fig. 8). Dette kan forklares med, at TSA overvejende blev metaboliseres af NQO1 og UGT’er. Men NQO1 haft ringe indflydelse på den cellulære optagelse af TSA, som det fremgår af den iagttagelse, at de cellulære ophobninger af TSA i A549 og H596 cellelinjer var næsten identisk, og siRNA tavshed NQO1 i A549 celler haft ringe effekt på TSA optagelse (Fig . S2). Sådan en farmakokinetisk og farmakodynamisk paradoks viser kraftigt, at NQO1 medierede bioaktivering er afgørende for bestemmelse TSA anti-NSCLC effekt.

De vigtigste karakteristika NQO1 katalyseret bioaktivering er at producere et meget ustabilt catechol mellemprodukt, auto-oxiderer til forælder quinon danner en nytteløs redox-cyklus, som gør celler til kontinuerlige ROS udfordringer. Det er for nylig blevet rapporteret, at ROS fremstillet af NQO1-medieret redox cyklus spillede afgørende rolle i Lap induceret apoptose [40]. Det forekommer, at ROS også kan spille en vigtig rolle i TSA-induceret celledød, da NAC co-behandling i høj grad kunne afskaffe TSA induceret DNA-skader, celleapoptose, og cytotoksicitet i NQO1 positive celler (fig. 1, 2 og 3).

p53 tumor suppressor er en central regulerende komponent som registrerer forskellige indre og ydre belastninger og initierer apoptotisk celledød [41]. Desuden er p53 proteinnedbrydning negativt reguleret af NQO1 via inhibering af et ubiquitin-uafhængig 20S proteosom medieret nedbrydningsvej [42]. Derfor er det vigtigt at fastlægge den rolle p53 på apoptotisk celledød induceret af NQO1 substrater. Alle beviser indsamlet fra denne undersøgelse viste, at TSA induceret apoptotisk celledød er p53 uafhængig. Første, forbehandling med typiske p53-inhibitoren og p53 stilhed ved siRNA havde ubetydelig indvirkning på TSA induceret cytotoksicitet, apoptose, og alle de testede begivenheder af mitochondriale apoptotiske veje i A549-celler (fig. 1 F, fig. 2A, B, Fig. 5 , fig. 6, fig. 7). For det andet, TSA kunne fremkalde tilsyneladende og koncentrationsafhængig cytotoksicitet og apoptose i H596-NQO1 celler (Fig. 1E, 2C), hvori p53 er velkendt skal muteres [43]. Endelig TSA behandling i A549 celler inducerede en koncentrationsafhængig effekt på faldende p53 proteinindhold, og af interesse, kan den NQO1 inhibitor DIC synergi med TSA på faldende p53 proteinindholdet i A549 celler, men vende den nedregulering af NQO1 protein niveauer (fig. S3 ). Selvom de detaljerede mekanismer bag TSA effekt på nedregulere p53 protein niveauer garanterer yderligere forskning, de foreliggende resultater tyder på, at denne virkning kan være forårsaget af NQO1 reguleret ubiquitin-uafhængig p53 nedbrydninger, fordi TSA behandling også blyholdig til nedregulering af NQO1 i parallelt med ændringen af ​​p53 proteinniveauer (fig. S3). NQO1 kunne stabilisere p53 ved at forhindre en ubiquitin-uafhængig proteasomalaktivitet nedbrydning [15], [44]. Konsekvent kunne NQO1 inhibitoren som DIC fremme denne nedbrydningsvej og således interferere med p53 indledt apoptosecyklus [45]. Vores resultater som TSA synergizing med DIC på at reducere p53 protein niveauer giver rimelig forklaring på, hvorfor NQO1 substrater induceret apoptotisk celledød er p53 uafhængig. Det kan tyde på, at NQO1 substrater, ligesom typiske NQO1 hæmmere, kan også fremme ubiquitin-uafhængig proteasomalaktivitet nedbrydning; detaljerede mekanismer er i øjeblikket under efterforskning i vores laboratorium.

Da caspase fungerer som en central del af apoptose maskiner, vi næste forsøgt at bestemme sin rolle på TSA-induceret apoptotisk celledød.