PLoS ONE: Flere sporadiske tarmkræft Vis en unik Methylering Phenotype

Abstrakt

Epigenetik menes at spille en vigtig rolle i carcinogenese af flere sporadiske kolorektal kræft (CRC). Tidligere undersøgelser har antydet overensstemmende DNA hypermethylering mellem tumor par. Men er blevet analyseret, kun få methylering markører. Denne undersøgelse havde til formål at beskrive den epigenetiske underskrift flere CRC under anvendelse af en genom-skala DNA-methylering profilering. Vi analyserede 12 patienter med synkron CRC og 29 alders-, køns- og tumor lokationsbaserede parrede patienter med ensomme tumorer fra EPICOLON II kohorte. DNA methylering profilering blev udført under anvendelse af Illumina Infinium HM27 methylering af DNA-assay. De væsentligste resultater blev valideret af Methylight. Tumorer prøver blev også analyseret for CpG Island Methylator fænotype (CIMP);

KRAS

og

BRAF

mutationer og fejlparringsreparationsmangel status. Funktionel annotation klyngedannelse blev udført. Vi identificerede 102 CpG sites, der viste signifikant DNA hypermethylering i flere tumorer med hensyn til de ensomme modstykker (forskel i β værdi ≥0.1). Methylight analyser valideret resultaterne for 4 udvalgte gener (p = 0,0002). Otte ud af 12 (66,6%) multiple tumorer blev klassificeret som CIMP-høj, sammenlignet med 5 ud af 29 (17,2%) solitary tumorer (p = 0,004). Interessant 76 af de 102 (74,5%) hypermethyleret CpG sites tilstede i mange forskellige tumorer blev også set i CIMP-høje tumorer. Funktionel analyse af hypermethylerede gener fundet i multiple tumorer viste berigelse af gener involveret i forskellige tumorgene funktioner. Afslutningsvis er flere CRC forbundet med en tydelig methylering fænotype, med en tæt tilknytning mellem tumor mangfoldigheden og CIMP-høj. Vores resultater kan være vigtigt at optrævle den underliggende mekanisme af tumor mangfoldigheden

Henvisning:. Gonzalo V, Lozano JJ, Alonso-Espinaco V, Moreira L, Muñoz J, Pellisé M, et al. (2014) Flere sporadiske tarmkræft Vis en unik Methylering Fænotype. PLoS ONE 9 (3): e91033. doi: 10,1371 /journal.pone.0091033

Redaktør: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japan

Modtaget: 11. december 2013; Accepteret: 6 feb 2014; Udgivet: 18 marts 2014

Copyright: © 2014 Gonzalo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Hospital klinik for Barcelona (Josep Font tilskud), Ministerio de Economía y Competitividad (SAF 2007-64.873 og SAF2010-19273), Fundación Científica de la Asociación Española contra el kræft og Instituto de Salud Carlos III (PI10 /00384). “Cofinanciado por el Fondo Europeo de Desarrollo Regional (EFRU). Unión Europea. Una manera de hacer Europa “. CIBEREHD er finansieret af Instituto de Salud Carlos III. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

op til 10% af alle kolorektal cancer (CRC) patienter udvikler mere end én tumor i colorectum, enten synkront (diagnosticeret på samme tid) eller metachronously (diagnosticeret under opfølgningsperioden) [1], [ ,,,0],2], [3]. Tumor mangfoldigheden menes at opstå på grund af en fælles ætiologisk faktor (genetiske eller miljømæssige) og giver en god model til at undersøge fælles molekylære ændringer og, mere specifikt en potentiel felt effekt [4], [5], [6], [7 ]. Genetik kun forklare en del af spektret af flere CRCs, især dem, der forekommer i forbindelse med Lynch syndrom (forårsaget af mutationer i de fejlparringsreparationsgener) [8], [9], [10], familiær associeret polypose (FAP) [ ,,,0],11],

MUTYH

associeret polypose (MAP) [11] og andre former for kolorektal polyposis [12]. På den anden side, er begrebet felt defekt været foreslået at forklare tumor mangfoldigheden gennem en generaliseret cellulær eller molekylær uorden i hele colorektal slimhinde, hvilket medfører en formodet felt virkning (såkaldt “feltet cancerization”) [6], [7] , såsom i savtakket polypose syndrom [13], [14], [15]. Men den endelige underliggende patogene mekanisme tumor mangfoldigheden stadig undvigende.

I den ikke-arvelige scenario, tidligere undersøgelser har fundet fælles molekylære ombygning mønstre mellem CRC par og i den normale colon mucosa af patienter med multipla kolorektale tumorer, støtte en formodet felt defekt [4], [10], [14], [16]. I modsætning til genetiske ændringer, som ikke normalt findes i normal slimhinde fra cancerpatienter, er epigenetik menes at spille en vigtig rolle i carcinogenese af de personer, der udvikler multiple tumorer [4], [5], [14], [17 ], [18], [19], [20], [21]. I den forstand er det blevet foreslået, at synkrone CRCs er hyppigere forbundet med CpG øen methylator fænotype (CIMP) [4],

BRAF

mutation og mikrosatellit instabilitet [10]. Faktisk vores gruppe sammenlignet et sæt af 41 parvise flere og ensomme CRC’er og identificeret hypermethylering af

MGMT2

locus og

RASSF1A

gen som variabler uafhængigt forbundet med tumor mangfoldigheden. Desuden har flere undersøgelser fundet overensstemmende methylering mønstre i tumor par [4], [14], [17], [18]. På den anden side er den globale DNA hypometylering blevet forbundet med genomisk ustabilitet og carcinogenese [22], [23] og for nylig højere hypometylering af LINE-1 (en surrogatmarkør for global DNA-methylering) i normal colon mucosa har vist sig at være et særligt kendetegn ved patienter med synkrone CRC’er [14]. Alle disse resultater antyder, at fælles miljø- og /eller genetisk baggrund kan forårsage overensstemmende mønstre af DNA-methylering i patienter med flere tumorer. Imidlertid har kun få methylering markører blevet analyseret og højkapacitetsmetoder med genom bred kapacitet der er behov for at finde og bedre at forstå den underliggende epigenetisk underskrift af flere sporadiske CRC’er.

I denne undersøgelse, vi sigter mod at beskrive den underliggende epigenetiske signatur, der adskiller flere fra ensomme CRC tumorer ved hjælp af en genom-strategi. Til dette formål, vi analyseret 12 synkron og 29 kontrol ensomme CRC’er afledt af populationsbaseret EPICOLON-II kohorte, og evalueret genomet skala methylering profil ved hjælp af Illumina Infinium HM27 DNA methylering assay, en tilgang, der ikke tidligere er blevet forsøgt.

Materialer og metoder

patienter og prøver

Tolv patienter med synkron CRC og 29 alders-, køns- og tumor lokationsbaserede parrede patienter med ensomme tumorer blev rekrutteret fra EPICOLON II kohorte, et multicenter populationsbaseret studie udført i Spanien mellem 2006 og 2007 [24]. Synkrone tumorer blev klart adskilt af normal colon mucosa og begge var invasive (mindst PT1). Patienterne blev fulgt indtil døden eller marts 2012, alt efter hvad der kom først. Demografiske, kliniske og tumor-relaterede karakteristika for patienter, der indgår i undersøgelsen er sammenfattet i tabel 1. kriterier Eksklusionskriterier for den foreliggende undersøgelse var kolorektale polypose syndromer, Lynch-syndrom, og personlige historie af inflammatorisk tarmsygdom. Den institutionelle etiske komité for hver af de deltagende sygehus (se Tak) godkendte undersøgelsen, og skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter.

Frosne tumor kolorektale væv blev opnået ved kirurgi fra alle patienter, og straks opbevaret ved -80 ° indtil brug. Hos patienter med flere læsioner blev vævsprøve opnået fra en af ​​tumorer (den mest avancerede eller den største, når flere tumorer havde samme tumor stadie).

DNA-ekstraktion og bisulfit konvertering

frosne prøver blev optøet og genomisk DNA blev isoleret ved anvendelse QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) ifølge producentens instruktioner. Bisulfitbehandling blev udført på genomisk DNA under anvendelse af EZ DNA-methylering-Gold Kit (Zymo Research, Orange, CA) ifølge fabrikantens protokol.

Infinium matrix

Vi udførte DNA methylering profilering fra 12 synkron og 29 ensomme CRCs vha Infinium methylering assay med HumanMethylation27 BeadChip (Illumina, San Diego, CA), som er i stand til samtidigt at analysere status for methylering af 27,578 individuelle bindingssteder for CpG dækker 14.495 proteinkodende gener og 110 miRNA [25], [ ,,,0],26], [27]. Hele genomamplifikation, mærkning, hybridisering og scanning blev udført i overensstemmelse med producentens anvisninger på en kerne facilitet (Centre de Regulació Genòmica, Barcelona, ​​Catalonien, Spanien). Status for methylering blev målt som forholdet mellem signalet fra en methyleret sonde i forhold til både methylerede og ikke-methylerede probesignaler. Methylering nøgletal blev udvundet ved hjælp af Methylering modulet i Illumina Bead Studio efter gennemsnitlig normalisering. Kvantitativ β-værdi i området fra 0 (0% methylering) til 1 (100% methylering). Den p-værdi afskåret for fundne prober (forskellige fra baggrunden målinger) blev sat til 0,05. Vi udelukkede prober, der tidligere blev offentliggjort at være upålidelige (dem der indeholder enkelt-nucleotid polymorfismer (SNP’er), og dem repetitive sekvenser som dækkede målrettet CpG-dinukleotid) og dem, der var designet til sekvenser på enten X eller Y-kromosomet. Sammen har vi maskerede datapunkter for 7549 sonder [27]. Komplet microarray datasæt er tilgængelig på GEO. (Gene Expression Omnibus; tiltrædelse nummer GSE52573)

Definition af CIMP-høje tumorer baseret på Infinium analysen

Vi klassificerede tumorer som CIMP-høj (CIMP- H), CIMP-lav (CIMP-L) og CIMP-0 baseret på en 2-trins paneler af markører for nylig beskrevet af Hinoue

et al

baseret på Illumina Infinium HM27 methylering af DNA-assay [27]. Det første panel (

B3GAT2

,

FOXL2

,

KCNK13

,

RAB31

, og

SLIT1

) kvalificerer en prøve som CIMP (høj og lav) versus CIMP-0, hvis β-værdi ≥0.1 i tre eller flere markører. Den anden markør panel (

FAM78A

,

FSTL1

,

KCNC1

,

MYODCD

og

SLC6A4

) skelner CIMP-H versus CIMP-L tumorer hvis β-værdi er ≥0.1 i tre eller flere markører (tabel 2). Disse markører har vist at vise 100% følsomhed og 100% specificitet til at identificere CIMP-H-tumorer [27].

Teknisk validering af Infinium assay under anvendelse Methylight

Methylight teknik til kvantitativ analyse af methylering blev brugt til den tekniske validering af de observerede i Illumina Infinium analysen [28] resultater. Følgende strenge kriterier blev anvendt til udvalgte kandidatgener for validering: 1) ensom tumor havde en β værdi 0,2; og 2) flere tumorer havde enten en β værdi 0,3 og en forskel i β værdi ≥0.2; og 3) justeres p-værdi 0,05; og 4) tidligere tegn på tumor undertrykkende funktioner baseret på den offentliggjorte litteratur. Efter disse kriterier, vi valgte 4 gener for teknisk validering (

MAP1B, HTRA1, ALOX15, TIMP3

). Locus specifikke PCR-primere og prober er anført i tabel S1 og blev specifikt designet til bisulfited-konverterede DNA-sekvenser og placeret ved hver genpromotorregion. Methylight blev udført som tidligere beskrevet, under anvendelse ALUC4 som intern kontrol [17], [28].

Evaluering af tumor fejlparringsreparationsmangel

Tumor fejlparringsreparationsmangel blev bedømt ved både mikrosatellit ustabilitet ( MSI) afprøvning og immunfarvning herunder evaluering af MSH2, MLH1, MSH6 og PMS2 som tidligere beskrevet [29]. MSI status blev vurderet ved hjælp af BAT26 og NR24 quasimonomorphic markører som beskrevet tidligere [30]. Tumorer blev klassificeret som MSI, når en af ​​de to markører var ustabil.

Evaluering af

BRAF

KRAS

mutation status

BRAF

mutationer ved codon 600 i exon 15 og

KRAS

mutationer ved codon 12 og 13 i exon 2 blev analyseret ved Methylight og direkte sekventering, henholdsvis som tidligere offentliggjort [31].

Funktionel annotation gruppering af forskelligt methylerede gener mellem flere og ensomme kolorektal kræft

Vi brugte Database til anmærkning, Visualisering og integreret Discovery (DAVID) [32] for at identificere veje er relevante for carcinogenese baseret på de gener, der viste signifikant forskellen methylering mellem flere og ensomme flere tumorer (forskel i β værdi ≥0.1 og p 0,05). (DAVID: https://david.abcc.ncifcrf.gov)

Statistisk analyse

Logistik regression justeret for alder, køn og tumorplacering blev anvendt til at evaluere forskellen i DNA-methylering p-værdier for hver probe mellem to uafhængige grupper. De Illumina Infinium DNA methylering P-værdier blev gengives grafisk ved hjælp af en Heatmap, der genereres af R /BioConductor pakker. Klinisk-patologisk træk blev sammenlignet ved hjælp af Chi-square (kvalitative variabler) og t-tests (kvantitative variabler). Methylight kvantitative data (procent methylering ratio, PMR) blev analyseret ved anvendelse af Mann-Whitney U test. En p-værdi 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Statistisk analyse og datavisualisering blev udført ved hjælp af R /BioConductor softwarepakke og SSP’er software (V.15).

Resultater

Differential methylering mellem flere og ensomme tumorer

Tolv patienter med multipel CRC og 29 alders-, køns- og tumor lokationsbaserede parrede patienter med ensomme tumorer udgjorde grundlaget for denne undersøgelse. Demografiske og tumor egenskaber fra patienter inkluderet i dette studie er anført i tabel 1. Vi brugte Illumina Infinium HM27 DNA methylering assay, som vurderer status DNA methylering af 27,578 CpG sites placeret ved promotor-regioner i over 14.000 protein-kodende gener. Vi identificerede 102 CpG sites, der viste signifikant DNA hypermethylering i flere tumorer med hensyn til ensomme dem (forskel i β værdi ≥0.1 og p 0,05). Brug strengere kriterier (forskel i β værdi ≥0,2; p 0,05), vi identificeret 36 CpG sites betydeligt hypermethyleret (se detaljeret liste over gener i tabel S2). En Heatmap viser de mest markant hypermethyleret bindingssteder for CpG, som adskiller flere og ensomme tumorer er vist i figur 1. Samlet viser disse resultater at multiple tumorer er forbundet med en særskilt methylering fænotype, uanset alder, køn og tumor placering.

DNA methylering β-værdier er repræsenteret ved hjælp af en farveskala fra rød (høj DNA-methylering) til grøn (lav DNA-methylering). Rækker repræsenterer prober og kolonner repræsenterer tumorprøver. Kliniske og molekylære funktioner (gruppe, køn, tumor placering, CIMP-H og

KRAS

mutationsstatus) er repræsenteret over Heatmap med vandrette bjælker.

Teknisk validering af microarray resultater

for at teknisk validere resultaterne af Infinium assay vi brugte strenge kriterier for at vælge prober, som blev væsentligt hypermethyleret i flere tumorer i forhold til ensomme læsioner (β værdi i ensomme tumorer 0,2; β værdi 0,3 i flere tumorer, forskel i β værdi mellem flere og ensomme tumorer ≥0.2 og et justeret p værdi 0,05). For at vælge biologisk relevante bindingssteder for CpG, vi prioriteret gener med tidligere tegn på tumor suppressor funktioner. Efter disse kriterier, valgte vi

MAP1B

,

HTRA1

,

ALOX15

, og

TIMP3

til validering i fem parret flere og ensomme tumorer. Resultater er vist i figur 2. Globalt vi fandt en signifikant højere methylering niveauer i flere tumorer i forhold til ensomme dem (samlet PMR, 14% versus 2,7%, henholdsvis; p = 0,0002). Som vist i figur 2, viste alle fire markører højere methylering i flere tumorer i forhold til de ensomme dem og dermed styrke sammenhængen i vores resultater.

Fire gener (

MAP1B, HTRA1, ALOX15, TIMP3

) blev udvalgt på grundlag af strenge kriterier (β værdi i ensomme tumorer 0,2; β værdi 0,3 i flere tumorer, forskel i β værdi mellem flere versus ensomme ≥0.2, og en justeret p-værdi 0,05). Box-plots vise Procent Methylering Ratio (PMR) bestemt af Methylight. Linjerne inde kasser betegner median og kasser markerer intervallet mellem 25. og 75. percentiler. Sorte linjer betegner den højeste og laveste PMR værdi. er vist P-værdier for sammenligningen mellem flere (rød) og solitary (blå) tumorer (Mann-Whitney test).

CIMP-high er forbundet med tumor mangfoldigheden

Vi næste analyserede CIMP status af flere og ensomme tumorer baseret på nyligt udviklede genmarkøren paneler defineret af Hinoue

et al

[27]. Dette panel har for nylig vist, at overgå Methylight-baserede fem-markør panel beskrevet af Weisenberger [33]. Ti ud af de 12 (83%) flere tumorer og 25 ud af 29 (86,2%) ensom CRC viste hypermethylering af tre eller flere markører fra det første panel (dvs.

B3GAT2

,

FOXL2

,

KCNK13

,

RAB31

, og

SLIT1

), så de blev klassificeret som CIMP tumorer. Baseret på det andet panel (dvs.

FAM78A

,

FSTL1

,

KCNC1

,

MYOCD

, og

SLC6A4

), 8 ud af de 12 (66,6%) multiple tumorer blev endeligt klassificeret som CIMP-H, sammenlignet med 5 ud af de 29 (17,2%) solitary tumorer (p = 0,004) (tabel 2). CIMP-H-tumorer viste signifikant hypermethylering (forskel i β værdi ≥0.1; p værdi 0,05) i 301 CpG sites (109 med en forskel i β værdi ≥0.2; p værdi 0,05). En Heatmap viser de væsentligste bindingssteder for CpG, der adskiller CIMP-H og CIMP-L /0 tumorer er vist i figur 3. En detaljeret liste med CIMP-H hypermethyleret bindingssteder for CpG er vist i tabel S3. Interessant 76 af de 102 hypermethyleret bindingssteder for CpG i mangfoldige tumorer blev også set at blive hypermethyleret i CIMP-H-tumorer (figur 4). Der var ingen

BRAF

mutationer i enhver tumor. Vores resultater viser en tæt sammenhæng mellem tumor mangfoldigheden og CIMP, uanset alder, køn og tumor placering. Denne observation er i overensstemmelse med en tidligere større undersøgelse, hvor tumorer blev klassificeret ved hjælp Methylight-baserede markører [4] og dermed styrke feltet-defekt teori.

DNA methylering β-værdier er repræsenteret ved hjælp af en farve skala fra rød (høj DNA-methylering) til grøn (lav DNA-methylering). Rækker repræsenterer prober og kolonner repræsenterer tumorprøver. Kliniske og molekylære funktioner (gruppe, køn, tumor placering, CIMP-H og

KRAS

mutationsstatus) er repræsenteret over Heatmap med vandrette bjælker.

Blå cirkel viser 102 hypermethyleret CpG websteder, der findes i flere forhold ensomme tumorer og gul cirkel viser de 301 hypermethyleret CpG steder i CIMP-H versus CIMP-L /0 tumorer. Bemærkelsesværdigt, 76 ud af de 102 hypermethyleret gener i flere tumorer blev også ses at være hypermethyleret i CIMP-H-tumorer, og er repræsenteret som et kryds.

Association mellem

KRAS

mutationer og hypermethylering

KRAS

mutationer er blevet forbundet til en methylering fænotype kaldet CIMP-lav, hvor hypermethylering af et reduceret antal CIMP-definerer loci forekomme [27]. Vi søgte at undersøge methylering profil forbundet med

KRAS

mutant tumorer og dens association med tumor mangfoldigheden. Vi fandt, at

KRAS

mutante tumorer var repræsenteret i både multiple og ensomme tumorer (33,3% versus 43,4%, henholdsvis; p = 0,7) (figur 1). Interessant, fandt vi, at

KRAS

mutant tumorer viste en tydelig methylering profil i forhold til

KRAS

vildtype-tumorer. Vi identificerede 189 CpG sites, der viste signifikant DNA hypermethylering i

KRAS

mutant CRC’er med hensyn til

KRAS

vildtype-tumorer (forskel i β værdi ≥0.1 og p 0,05). Brug strengere kriterier (forskel i β værdi ≥0,2; p 0,05), vi identificeret 92 CpG sites betydeligt hypermethyleret. En detaljeret liste med

KRAS

associeret hypermethyleret CpG sites er vist i tabel S4 og figur S1. Procentdelen af ​​CIMP-H var ikke forskellig

KRAS

mutant og vildtype-tumorer (23% versus 35%, p = 0,7). Tilsvarende havde procentdelen af ​​CIMP-low ikke mellem

KRAS

mutant og vildtype-tumorer (69.2% versus 55%, henholdsvis; p = 0,485). Samlet, selvom vi fandt, at

KRAS

muterede tumorer vise et særskilt methylering profiler, der var sammen med hverken tumor mangfoldigheden eller CIMP status.

Funktionel analyse af differentieret methylering observeret i flere kolorektal cancer

Vi udførte en berigelse analyse af de 102 hypermethyleret sonder observeret i flere tumorer (β værdi 0,1; p 0,05) ved hjælp af Database til anmærkning, Visualisering og integreret Discovery værktøj for at finde en funktionel sammenhæng i enhver kræftfremkaldende vej involveret i carcinogenese. Denne funktionelle analyse viste tilstedeværelsen og berigelse af gener involveret i forskellige tumorigene funktioner: celle bevægelse (12 gener), celle migration (7 gener), veje i kræft (8 gener), celle motilitet (7 gener), regulering af celledeling ( 11 gener), transkriptionsfaktoraktivitet (14 gener), og transkription regulering (17 gener) (tabel 3). Komplet liste over funktionelle annotation gruppering af forskelligt methylerede gener er vist i tabel S5.

Diskussion

I denne undersøgelse undersøgte vi for første gang genom-skala DNA methylering profil tumor væv fra patienter med multipel og ensom CRC rekrutteret fra et populationsbaseret kohorte. Vi fandt, at tumor mangfoldigheden er associeret med en distinkt methylering profil, uanset alder, køn eller tumor placering. Sammenlignet med ensomme tumorer, viste flere CRCs signifikant hypermethylering ved specifikke bindingssteder for CpG, og interessant, var der en stærk association med CIMP-H beskrevet for CRC. Funktionel analyse af forskelligt methylerede CpG sites i flere tumorer viste berigelse af gener involveret i forskellige tumorigene funktioner. Resultater fra methylering profilering lykkedes valideret af kvantitative PCR-assays. Samlet set vores data giver ny indsigt i feltet cancerization effekt og kolorektal carcinogenese i ikke-arvelige tilfælde. Denne undersøgelse viser, at somatisk hypermethylering spiller en vigtig rolle i tumor mangfoldigheden og kan udgøre en interessant biomarkør for vurdering CRC risiko.

Nylige undersøgelser har rapporteret en tæt tilknytning mellem afvigende DNA methylering og tumor mangfoldigheden [4], [14 ], [16], [17], [18]. Nosho og kolleger [4] analyseret 47 patienter med synkron CRC og 2021 ensomme tumorer i flere methylering markører, herunder 8 CIMP-specifikke CpG øen (dvs.

CACNA1G

,

CDKN2A

,

CRABP1

,

IGF2

,

MLH1

,

NEUROG1

,

RUNX3

, og

SOCS1

) og fundet en signifikant sammenhæng mellem tumor mangfoldigheden og tilstedeværelsen af ​​CIMP-høj (35% i synkrone tumorer versus 8% i ensomme tumorer; p = 0,036). Vigtigere, fandt forfatterne overensstemmende methylering inden tumor par. Tilsvarende Konishi og kolleger [18] analyserede status methylering af et begrænset antal beslutningstagere i 57 multiple tumorer og 69 ensomme CRC’er, og fandt, at methylering status

P14

MGMT

var signifikant højere i multiple tumorer, der viser samstemmende methylering for nogle markører inden tumorer par af samme colon site. I overensstemmelse med disse observationer, vi tidligere vist, at hypermethylering af

MGMT

RASSF1A

uafhængigt forbundet med tumor mangfoldigheden [17]. I en anden undersøgelse Kamiyama og kolleger [14] analyserede status for methylering af lange afbrudt nukleotid element-1 (LINE-1) i matchede kræftvæv og ikke-kræft kolonmucosa fra patienter med enkelt og flere højresidig CRCs. Forfatterne fandt højere hypometylering af LINE-1 i både tumor og normal slimhinde fra patienter med multiple tumorer sammenlignet med patienter med ensomme tumorer, og endnu vigtigere, LINE-1 hypometylering var en uafhængig prædiktor for metachronous tumorer (p = 0,003). Forfatterne foreslog, at LINE-1 hypometylering i normal slimhinde kan anvendes som en epigenetisk prædiktiv biomarkør for multipel risiko CRC. Det er vigtigt at bemærke, at LINE-1 hypometylering tidligere har vist sig at være omvendt korreleret med CIMP fænotype, som kan være i modstrid med vore og tidligere undersøgelser. Imidlertid har sammenhængen mellem LINE-1 hypometylering og CIMP i flere tumorer ikke blevet udforsket i dybden, og forskelle i patientudvælgelse og metode kunne forklare disse uventede resultater. Endelig har andre undersøgelser hypotese, at den genetiske og epigenetiske landskab af en given tumor bestemmes af placeringen i tyktarmen, og at lignende molekylære profiler til synkrone tumorer påvirkes af nærhed [34], [35]. Desværre kunne vi ikke subanalyze dette problem på grund af den manglende adgang til den anden neoplasme. Alle disse resultater antyder, at ophobningen af ​​afvigende DNA-methylering forekommer overvejende hos individer med en tilbøjelighed til at udvikle flere tumorer. Resultaterne af denne undersøgelse ikke kun argumentere for denne hypotese, men også give nye beviser om epigenetiske landskab af patienter med multiple tumorer. Den underliggende mekanisme af sammenhængen mellem afvigende methylering og mangfoldighed er stadig ukendt. Nogle forfattere har foreslået en nedarvet disposition i nogle tilfælde [14], med ophobning af methylering fejl under aldring i en genetisk disponerede undergruppe af patienter. forbliver dog denne hypotese, er der behov for udokumenterede og fremtidige undersøgelser.

I denne undersøgelse har vi med succes valideret af Methylight status for methylering af 4 differentielt methylerede bindingssteder for CpG observeret i opdagelsen fase af undersøgelsen. Konkret har vi observeret, at

MAPB1B

,

HTRA1

,

ALOX15

, og

TIMP3

var signifikant hypermethyleret i flere tumorer.

MAP1B

(mikrotubulus-associeret protein 1B) er tidligere blevet vist at blive hypermethyleret i CIMP-høje tumorer uden MSI, som hovedsagelig svarer til den gruppe af tumorer analyseret i vores undersøgelse [36].

HTRA1

er medlem af htrA (High-Temperature Krav faktor A) familie af serinproteaser og spiller en beskyttende rolle i forskellige maligniteter grund af dets tumor suppressive egenskaber [37], [38], [39] .

HTRA1

har vist sig at være bragt til tavshed gennem promotor hypermethylering [38], og foreslået som en potentiel ny biomarkør til diagnosticering og forudsigelse i flere kræftformer.

ALOX15

(15-lipoxygenase eller 15-LOX) er en inducerbar og stærkt regulerede enzym i normale humane celler, som spiller en central rolle i produktionen af ​​lipid signalering mediatorer.

ALOX15

har for nylig vist sig at være nedreguleret i CRC og fungere som en tumor suppressor ved at fremme forskellige anti-tumorigene arrangementer, herunder celledifferentiering og apoptose, og hæmmer kronisk inflammation, angiogenese og metastase [40]. Endelig Tissue Inhibitor of metalloproteinaser-3 (

TIMP-3

) har vist sig at være stumme i flere typer af kræft ved promotorgenet hypermethylering, herunder CRC [41], [42]. Samlet set viser vores resultater, at multiple tumorer er forbundet med hypermethylering af veletablerede tumorsuppressorgener.

Uafhængigt af den underliggende mekanisme bag den stærke association mellem afvigende methylering og tumor mangfoldigheden, vores resultater tyder på, at status for methylering af specifikke markører kan anvendes til at stratificere risikoen for tumor mangfoldigheden. Kamiyama og kolleger for nylig viste, at LINE-1 methylering status i normal colon mucosa kunne forudsige udviklingen af ​​metachronous CRC med høj følsomhed [14], hvilket repræsenterer en klinisk vigtig prognostisk biomarkør til identifikation af “høj risiko” patienter. Tilsvarende kunne analysen af ​​status methylering af specifikke markører identificeret i vores undersøgelse anvendes i et klinisk scenarie for at identificere højrisikopatienter og skræddersy strategi overvågningen. Prospektive undersøgelser specifikt analyserer denne hypotese er imidlertid berettiget.

Den største styrke i denne undersøgelse er, at vi udnyttet en populationsbaseret kohorte af velbeskrevne CRC sager, hvilket minimerer selektionsbias. Desuden har vi brugt for første gang genom-dækkende methylering profilering med Illumina Infinium analysen i denne indstilling. Men vi er opmærksomme på nogle begrænsninger. Først havde vi ikke analysere DNA methylering korrelation i tumor par på grund af udformningen af ​​EPICOLON II-projektet, hvor kun én tumor blev indsamlet. For det andet blev CIMP definition ikke er baseret på tidligere beskrevne methylering markører [33]. Men der er i øjeblikket ingen konsensus definition af CIMP tumorer, og Hinoue og kolleger [27] viste for nylig, at et nyt panel baseret på Illumina Infinium DNA methylering platform klaret sig bedre end Methylight-baserede fem-markør panel (dvs.

CACNA1G

,

IGF2

,

NEUROG1

,

RUNX3

SOCS1

). Hyppigheden af ​​CIMP-høj frekvens i ensomme CRC’er observeret i vores undersøgelse (17%) er på linje med tidligere tal, som styrker nøjagtigheden af ​​det nye panel foreslået af Hinoue

et al.

Tredje, i vores undersøgelse , der ikke var

BRAF

mutant tumorer, og i overensstemmelse hermed, sammenslutningen af ​​tumor mangfoldigheden med en tydelig methylering fænotype kun refererer til CIMP-høj /

BRAF

vildtype-tumorer, som kan udgøre op til 40% af CIMP-høje tumorer. Endelig, som vores resultater bør overvejes formelt ikke statistisk signifikant, når de anvender flere test korrektioner, der er behov for yderligere undersøgelser i andre kohorter for at bekræfte resultaterne. Men kunne vi bekræfte nogle af de mest betydningsfulde hypermethyleret CpG steder ved Methylight og dermed styrke gyldigheden af ​​vores resultater.

Sammenfattende vores resultater er i overensstemmelse med den hypotese, at tumor mangfoldigheden er forbundet med en særskilt mønster af afvigende methylering. Sammenlignet med ensomme tumorer, flere CRC’er vise oftere CIMP-H og hypermethylering på andre specifikke locus. Vores resultater kan være vigtigt at optrævle den underliggende mekanisme af tumor mangfoldigheden i den ikke-arvelige scenario, og tilvejebringe nye potentielle biomarkører til at identificere højrisikopatienter og skræddersy strategier overvågning.

Støtte oplysninger

figur S1.

Heatmap viser de 172 mest markant hypermethyleret CpG sites, der adskiller KRAS mutant (n = 13) versus KRAS wild-type tumorer (n = 28), baseret på methylering data Infinium DNA.